CC BY
46УДК 547.458
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭН ДО И ЭКЗОПОЛИСАХАРИДОВ TRAMETES PUBESCENS (SCHUMACH.) PILAT.
Ананьева Е.П. (зав. кафедрой)*, Турина С.В. (доцент кафедры), Кожемякина Н.В. (старший преподаватель кафедры)
Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия (кафедра микробиологии), Санкт-Петербург, Россия
©Коллектив авторов, 2013
Из мицелия базиЪиалъного гриба Trametes pubescens (Schumach.) Pilat. выделены растворимая и нерастворимая углеводные фракции, из нативного раствора - экзогликан; изучены их состав и иммунобиологическая активность. Установлено, что исследуемые полисахариды представляют собой сложные углеводные комплексы (смесь углеводных полимеров) с различной молекулярной массой причем основным углеводным компонентом является глюкоза, а также обнаружены значительные количества маннозы и галактозы. Внеклеточные полисахариды, предположительно, являются результатом гиперпродукции растворимых полисахаридов клеточных стенок грибов, что подтверждается сходством данных молекулярно-массового распределения основных фракций ЭПС и растворимого клеточного полисахарида, полученных в результате гель-хроматографии. Полисахариды при внутрибрюшинном введении белым мышам оказывали стимулирующее действие на функциональную активность клеток системы мононуклеарных фагоцитов, причем более выраженным активирующим эффектом обладал экзополисахарид.
Ключевые слова: базидиомицеты, иммуностимулирующий эффект, макрофаги, мицелий, полисахарид, экзогликан
THE COMPARATIVE CHARACTERISTICS OF ENDO- AND EXOPOLYSACCHARIDES OF TRAMETES PUBESCENS (SCHUMACH.) PILAT.
Ananjeva E.P. (head of the chair), Gurina S.V. (associate professor of the chair), Kozchemyakina N.V. (senior lecturer of the chair)
St. Petersburg State Chemical-Pharmaceutical Academy (Chair of Microbiology), St. Petersburg, Russia
©Collective of authors, 2013
From the mycelium of Trametes pubescens (Schumach.) Pilat. have been isolated soluble and insoluble carbohydrate fractions
Контактное лицо: Ананьева Елена Петровна, e-mail: amar52@rambler.ru
exopolysaccharide - from the native solution; their composition and immunological activity were studied. Found that the investigated polysaccharides are complex of carbohydrate polymers (mixture of carbohydrate polymers) with different molecular masses, the main carbohydrate component is glucose, they also contained significant amounts of mannose and galactose. The molecular masses distribution of the carbohydrate components of the glycans shown that the basic exopolysaccharide and soluble fraction of cellular polysaccharide coincided output, probably extracellular polysaccharides were mainly the result of overproduction of soluble polysaccharides of the cell walls of fungi. Polysaccharides with intraperitoneal injection to white mice provided a stimulating effect at the functional activity of cells of mononuclear phagocytes with a more pronounced effect on activating macrophages provided exopolysaccharide.
Key words: basidiomycetes, exoglycan, immunostimulating effect, macrophages, mycelium, polysaccharide
ВВЕДЕНИЕ
Разработка и создание новых терапевтических препаратов для коррекции иммунной системы является актуальной проблемой иммунологии и медицины. Перспективными иммуностимуляторами являются полисахариды природного происхождения, в том числе выделенные из базидиальных грибов [1]. В основном, эти соединения относят к модификаторам биологических процессов, активность которых связана со стимуляцией различных звеньев иммунной системы макроорганизма [2]. Грибные полисахариды, в отличие от синтетических иммунокорректоров, нетоксичны, не подавляют кроветворную функцию костного мозга и селезенки. В этой связи, работа, посвященная исследованию новых представителей базидиальных грибов как перспективных источников средств лечебно-профилактической направленности для коррекции иммунной системы, имеет большой практический интерес.
Цель данной работы - выделение, характеристика и оценка иммунобиологической активности клеточных и внеклеточных полисахаридов, синтезируемых базидиомицетом Trametes pubescens (Schumach.) Pilat., 1939.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объекта исследования использовали базидиомицет Т. pubescens. На сусло-агаре культура образовывала колонии белого цвета, выпуклые, округлые, опушенные, с ровным краем, воздушный мицелий - белый, ватообразный, при старении культуры появлялась кремовая или желтоватая окраска мицелия, росшего равномерно-радиально, со скоростью, в среднем, 2,5 мм/с при 24 °С. Микроскопически на септированном, разветвленном мицелии обнаружили одиночные крупные пряжки, крутоизогнутые, без просвета, характерные для базидиомицетов. В глубинной культуре гриб образовывал мицелиаль-ные агломераты сферической формы (пеллеты) диаметром 4-7 мм.
Мицелий получали методом глубинного культивирования в глюкозо-пептонной среде в течение 10 суток при 24 °С в динамических условиях. В качестве посевного материала использовали 4-х суточный
■
ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ. 2013.Т.15. №3
инокулят глубинной культуры, который вносили в среду для накопления мицелия в количестве 10% от объёма. После выращивания мицелий гриба отделяли от культуральной жидкости фильтрованием, промывали дистиллированной водой, обрабатывали этиловым спиртом (1:1), сушили при комнатной температуре до постоянного веса. Углеводные фракции выделяли водной экстракцией измельченного мицелия при 100 °С в течение 8 часов. Осадок и су-пернатант разделяли центрифугированием (15 мин., 5000 ц). Осадок (нерастворимую фракцию) промывали 96% этиловым спиртом на центрифуге; супер-натант упаривали в 2 раза, из упаренного раствора осаждали полисахарид (растворимую фракцию) 96% этиловым спиртом в соотношении 1:2, образовавшийся осадок отделяли центрифугированием (15 мин., 5000 g). Фракции сушили на воздухе, затем измельчали в стерильной фарфоровой ступке до порошкообразного состояния [3].
Экзогликан Т. puhe.sce.ns выделяли из культуральной жидкости, полученной в процессе культивирования гриба. Образующийся мицелий отделяли фильтрацией, фильтрат (нативный раствор) упаривали в 3-4 раза на ротационном вакуумном испарителе. Эк-зополисахарид осаждали из сконцентрированного нативного раствора 2 объемами 96% этанола. Осадок отделяли центрифугированием (15 мин., 5000 ц). Полученный полисахарид обезвоживали 96% этиловым спиртом, сушили на воздухе и измельчали в ступке до порошкообразного состояния.
В полисахаридных фракциях и экзогликане определяли содержание редуцирующих веществ [4], белка - по методу Лоури [5] и минеральных примесей - методом сухого озоления [5]. Кислотный гидролиз образцов проводили 8Н раствором серной кислоты в течение 1 часа при кипячении. Качественный моносахаридный состав в гидролизатах определяли с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках «Силуфол» (ЯПиГ«1) в системе 40:49:10:1 (бутанол : вода : этанол : аммиак); количественный моносахаридный состав - методом ГЖХ в виде три-метилсилильных (ТМС) производных Сахаров на колонке НР-5 (БЕ-54) 30 т*0,25 тт*0,25 ткт на приборе «Кристалл» («Хромотек», Россия). В качестве свидетелей использовали растворы моносахаридов: глюкозы, ксилозы, маннозы, галактозы, фукозы, ара-бинозы, рамнозы, галактуроновой и глюкуроновой кислот. ИК-спектры поглощения фракций снимали на инфракрасном Фурье-спектрометре ФСМ 1201 (АО «СПб Инструменте», Россия). Показатели удельного вращения экзогликана и растворимой углеводной фракции устанавливали на автоматическом поляриметре Регкт-Е1шег-241 (Регкт-Е1тег, США). Характер молекулярно-массового распределения углеводных составляющих во фракциях определяли с помощью гель-хроматографии: использовали колонку (0,4Х30 см), заполненную сефарозой - 4В. Содержание полисахаридов во фракциях выявляли реакцией с фенолом и серной кислотой.
Иммунобиологическое действие выделенных углеводных фракций и экзогликана определяли по их влиянию на показатели функциональной активности перитонеальных макрофагов белых мышей [3]. Углеводные фракции и экзогликан вводили мышам однократно внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг в стерильном физиологическом растворе. Макрофаги получали из перитонеальной полости мышей промыванием средой 199, содержащей 20% сыворотки крупного рогатого скота и гепарин в концентрации 5 Ед/мл (рН среды - 7,7). Клетки культивировали в монослое в течение 2 суток и затем оценивали их морфофункциональные изменения.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При глубинном культивировании Т. puhe.sce.ns в глюкозо-пептонной среде выход биомассы мицелия и внеклеточного полисахарида составил 3,5 и 0,8 г/л соответственно. Из мицелия гриба были выделены растворимая (РФр) и нерастворимая (НФр) углеводные фракции в соотношении 1:12. Показано, что мицелий и выделенные из него фракции, а также экзогликан состояли из углеводов и белка. Фракции содержали от 50,0 до 82,0% углеводов (наибольшее количество - в РФр), экзогликан - 66,3%, в то время как в мицелии их количество не превышало 31,0%. Отмечали высокое содержание белка в мицелии (46,0%), тогда как его количество в выделенных фракциях и экзогликане существенно снижалось (до 8,2%). Содержание минеральных примесей в исследуемых образцах было незначительным (табл. 1).
Таблица 1
Характеристика химического состава мицелия, его
углеводных компонентов и экзогликана Т. риЬеьсепь
Образец РВ, % Белок, % Зольность, % Моносахаридный состав, %
61и Ху1 Мап йа! Рис
Мицелий* 31,0±4,2 46,0±1,9 0,2±0,05 + сл** сл сл сл
РФр 82,0±3,9 16,0±1,1 0,1±0,03 77,4 2,1 14,1 4,9 1,2
НФр 50,0±2,9 8,2±0,9 0,3±0,08 73,7 2,9 13,4 9,0 0,9
ЭПС 66,3±2,5 17,0±1,4 0,4±0,03 49,9 1,2 31,1 17,1 0,7
* В мицелии определяли только качественный моносахаридный состав
** сл - следовые количества РВ - редуцирующие вещества
По результатам качественного анализа моноса-харидного состава установлено, что в гидролизатах мицелия основным компонентом являлась глюкоза, остальные углеводы были представлены в следовых количествах (табл. 1). Был определен количественный моносахаридный состав выделенных фракций и экзогликана. Фракции незначительно отличались по составу: содержали 74-77% глюкозы, значительные количества маннозы (около 14,0%), а также следовые количества ксилозы и фукозы, содержание галактозы во фракциях различалось в 1,8 раза (табл. 1). В экзополисахариде основным компонентом являлась глюкоза, однако ее содержание было в 1,5 раза ниже, чем в углеводных фракциях, содержание маннозы, напротив, в 2,3 раза превышало её содержание во
фракциях, ксилоза и фу ко за были также представлены & следовых количествах.
] 1ри изучении показателей удельного вращения экЗогликана и растворимой углеводной фракции мицелия Т. ргфевсещ определили, что значения данных показателей существенно не различались и варьировали в пределах (+9 - +12)4". На основании полученных данных было сделано предположение о наличии в изучаемых полисахаридах как и-, так и р-гликозидных связей, что было подтверждено результатами проведенной ИК-спектроскопии.
При проведении сравнительного хроматографи-ческого анализа экзо полисахарида и растворимой фракции мицелия гриба (на сефарозе 4В) установили, что исследуемые полисахариды 1федставляк>т собой сложные углеводные комплексы (смесь углеводных полимеров) с различной молекулярной массой. Выявили наличие основных и нескольких минорных углеводных пиков, свидетельствующих о неоднородности состава изучаемых гликанов. При исследовании Э11С 'Г.риЬеясет было обнаружено 3 пика, соответствующих различным фракциям, Выход основной фракции совпадал но времени с максимальным выходом фракции растворимого клеточного полисахарида (Рис, 1, 2),
1,4
Рис. 1. Гель-хроматография ЭПС Т. риЬе$сепв
о.»
0,7 0,6 0,5 о ,й 0,3 0,2 0,1
о -
5
Рис. 2. Гель-хроматография Р/фр Т. риЬе5сеп5
В сравнении с экзогдиканом, растворимый углеводный полимер мицелия дополнительно содержал и из ко молекулярные компоненты. Вероятно, внеклеточные полисахариды, в основном, являлись результатом г и пер продукции растворимых полисахаридов клеточных стенок грибов.
Иммунобиологическое действие выделенных углеводных фракций и экзогликана устанавливали но их влиянию на показатели функциональной активности перитонеальных макрофагов белых мышей, которые являются чувствительной моделью для определения иммунобиологической активности различных препара тов.
Экзо- и эндополисахариды достоверно увеличивали показатели функциональной активности макрофагов, по сравнению с контролем, на все сроки наблюдения. На первом этапе изучали показатели, отражающие начальные стадии фагоцитоза, На 1-е сутки после введения андополисахаридов наблюдали достоверное, хотя не очень активное увеличение значения хемотаксиса (в 1,3 раза для обеих фракций); под действием Э11С этот показатель вырос в 2 раза по сравнению с контролем. Такой стимулирующий эффект гликанов с охранялсяв течениеБ суток. Далее оценивали распластывание макрофагов па стекле как показатель акт ивации цитфплазматической мембраны макрофагов и их ГОТОВНОСТИ к фагоцитозу. Увеличение количества распластанных клеток под действием исследуемых гликанов отмечали достоверно выше контроля уже на 1-е сутки: под действием РФр и НФр показатель увеличился, соответственно, на 25 и 23%, а под действием 911С! - на 28% по сравнению с контролем. К 5-м суткам после введения РФр и НФр этот показатель незначительно снижался, оставаясь достоверно выше контроля, а после введения ЭПС оставался на прежнем уровне;
Влияние полисахаридов на микробоцидный эффект макрофагов по отношению к суточной культуре Staphylococcus aureus оценивали на 1-е и 5-е сутки после инъекций гликанов. Сравнивали выживаемость клеток S. aureus при контакте со стимулированными полисахаридами макрофагами и макрофагами, полученными от контрольной группы, и рассчитывали константу киллинга. Было установлено, что микро-боцидный эффект реализовался в течение 1 минуты кон такта макрофагов с клет ками S, aureus, а увеличение времени не приводило к усилению эффекта, i Io-лисахариды достоверно увеличивали микробоцид-ную способность макрофагов, i 1од влиянием РФр на 1-е сутки константа киллинга возрастала в 2,8 раза, а под влиянием НФр и ЭПС - в 2,0 раз по сравнению с контролем. На 5-е сутки наблюдали некоторое снижение микроб о цидного эффекта макрофагов, но с сохранением данного показателя достоверно выше контроля (в 1,6 раза - для РФр, в 1,7 для НФр, для Э1 К!! показатель остался на прежнем уровне).
В качестве объекта фагоцитоза использовали убитые нагреванием клетки Candida albicans и живые клетки S. aureus. Исследование поглотительной способности макрофагов проводили на 5-е сутки после введения гликанов, т.к. в ранее проведенных экспериментах на других объектах было показано, что именно в это время поглотительная способность была максимальна [3]. Установлено, что исследуемые гликапы достоверно увеличивали данный показатель
10 15 20 v,Mn
ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ. 2013.ТЛ5. №3
па отношению к С, abicans, причем более выраженный эффект оказывала РФр. 11о глот и тельная способность макрофагов в отношении клеток S. aureus под действием гликанов также усиливалась, при этом количество фагоцитировавших клеток достоверно увеличилось, J кжазано, что активность поглощения S. aureus была Выше, чем активность поглощения С, albicans под действием как эндо- так и экзополиса-харидов. Вероятно, гликаны могут частично экранировать лектииоподобпые рецепторы макрофагов, ответственные за связывание с углеводными компонентами клеточной стенки С. albicans, обусловливая менее интенсивное поглощение дрожжевых клеток.
На основании полученных результатов была построена диаграмма (Рис. 3), позволяющая дать сравнительную оценку иммуностимулирующей активности исследуемых гликанов. Наиболее выраженным иммуностимулирующим действием обладал экзогликан Г, pubescens.
2 5 ИА
15 1
0.5 0
Рис. 3. Сравнительная характеристика действия фракций мицелия и экзогликана T.pubescens на показатели функциональной активности макрофагов; J - хемотаксис; 2-активация ЦПМ; 3 - микробоцидность; 4 - фагоцитоз Staphylococcus aureus; 5 - фагоцитоз Candida albicans. I - РФр; И - НФр; II! - ЭПС; ИА - индекс активации.
ВЫВОДЫ
1. Показано, что фракции глубинного мицелия и экзогликан базидиомицета Т, pubescens преимущественно состояли из углеводов, небольшого количества белка и минеральных примесей. Основным углеводным компонентом полисахаридов являлась глюкоза, и были обнаружены значительные количества маннозы и галактозы.
2. Исследуемые полисахариды представляли собой комплекс углеводных полимеров с различными молекулярными массами. Основные фракции!)! 1С и растворимого клеточного полисахарида совпадали по молекулярно-массовому распределению,
3. Экзо- и эндополисахариды достоверно увеличивали показатели функциональной активности макрофагов, более выраженным иммуностимулирующим действием обладал экзогликан.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Галынкин В.А., Заикина Н.А. и др. Основы биотехнологии выейшх грибов. — (Я L6.: 11роспект науки, 2007. — 315 с.
2. Трещалина F..M. I Гротиво опухолевая активность веществ природного происхождения. — М.:! фактическая Медицина, 2005. - 272 с,
3. Ананьева Е.П., Гурина С.В., Кожемякина И.В. Характеристика компонентов мицелия Ganoderma applanation (Pers.) Pat.; изучение их иммунобиологической и противоопухолевой активности //11роблемы медицинской микологии. - 2007. - Т.9, №1 - С. 30-33.
4. Кожемякина Н.В., Ананьева Е.П,, Гурина С.В., Галынкин В.А. Условия культивтрования, состав и биологическая активность МИЦелИЯ Flamulina velutipex (Fr.)P. KarsL. H Прикладная микробиология и биохимия. - 2010. - Т.46, №5 - С. 583-586.
5. Государственная Фармакопея Российской Федерации XI!. Ч. 1, — М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2008. - 701 с.
Поступила в редакцию журнала 09.07,2013
Рецензент: Н.П. Блинов
