CC BY
86
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ДЕЙСТВИЕ УГЛЕВОДНЫХ ФРАКЦИЙ МИЦЕЛИЯ... 83
УДК 579.8:616-006-092.9:612.42
ВА._Галынкин1, Н.В. Кожемякина2, Е.П. Ананьева2, С.В. Гурина2
ДЕЙСТВИЕ УГЛЕВОДНЫХ ФРАКЦИЙ МИЦЕЛИЯ FOMES FOMENTARIUS
И GANODERMA APPLANATUM
НА РОСТ ПОДКОЖНО ПЕРЕВИТОЙ ОПУХОЛИ ЭРЛИХА У МЫШЕЙ
1ГИПРОРЫБФЛОТ, Санкт-Петербург
2Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия Контактная информация
Галынкин Валерий Абрамович, д-р техн. наук, заведующий лабораторией технической микробиологии Адрес: 190000, Санкт-Петербург, ул. Малая Морская, д. 18; тел. +7(812)595-44-17 e-mail: beilis82@inbox.ru
Статья поступила 14.10.2010., подписана в печать 05.05.2011.
Резюме
Изучено действие углеводных фракций, выделенных из мицелия грибов Fomes fomentarius и Ganoderma applanatum, на рост подкожно перевитой солидной опухоли Эрлиха. Показано, что растворимая фракция мицелия G. applanatum вызывала статистически достоверное торможение роста опухоли и обладала выраженным противоопухолевым эффектом, нерастворимые фракции F. fomentarius и G. applanatum соответственно оказывали слабое противоопухолевое действие. Установлено, что фракции при внутрибрюшинном введении оказывали стимулирующее действие на функциональную активность клеток системы мононуклеарных фагоцитов, причем более выраженный активирующий эффект на макрофаги оказывала растворимая фракция G. applanatum.
Ключевые слова: базидиомицеты, солидная опухоль Эрлиха, система мононуклеарных фагоцитов, макрофаги.
V.A. Galvnkin1, N.V. Kozchemyakina2, E.P. Ananjeva2, S.V. Gurina2
EFFECT OF POLYSACCHARIDES FRACTIONS FROM FOMES FOMENTARIUS
AND GANODERMA APPLANATUM
ON GROWTH EHRLICH SOLID TUMOR IN MICE
1GIPRORYBFLOT, St.Petersburg
2Department of Microbiology, St.Petersburg State Chemical-Pharmaceutical Academy Abstract
Effect of carbohydrate fractions from mycelium of higher Basidiomycetes Fomes fomentarius and Ganoderma applanatum on Ehrlichs solid tumor growth was investigated. We present evidence, that administration of soluble fraction of Ganoderma applanatum results in significant Ehrlichs solid tumor growth inhibition. In tumor model insoluble fractions had weak antitumor activity. The aqueous extracts have been shown to have a stimulative effect on functional activity of reticuloendothelial system when it was administrated intraperitoneally. However, the soluble fraction had more significant effect on macrophage activation.
Key words: Basidiomycetes, Ehrlichs solid tumor, reticuloendothelial system, macrophages.
Введение
В народной медицине стран Юго-Восточной Азии базидиальные грибы с давних времен использовали для лечения различных заболеваний. Трутовик настоящий (Fomes &>теМагш) применяли при диспепсии, раке желудка, пищевода, матки, при геморроях; трутовик плоский (Ganoderma арр1апашт - при раке пищевода, туберкулезе как болеутоляющее и жаропонижающее средство [1]. Биологическую активность грибов связывают с присутствием в их плодовых телах и мицелии ряда компонентов, одними из которых являются полисахариды. Установлено, что грибные гликаны обладают иммуностимулирующими, противовирусными, антибиотическими, гиполипидемическими, гепатопротектор-ными и противоопухолевыми свойствами, способны регулировать работу сердечно-сосудистой, дыхательной и нервной систем [9; 12; 13]. В настоящее время препараты на основе грибных гликанов широко применяют в комплексной терапии раковых больных и в качестве средства поддерживающей терапии [12; 13; 14]. Существенным достоинством грибных гликанов помимо действия на опухоли является способность значительно снижать побочные
эффекты химио- и радиотерапии, а также отсутствие токсичности [14]. На основании последних исследований можно сделать предположение о наличии у грибных полисахаридов прямого цитотоксического действия на опухолевые клетки, что, вероятно, связано с остановкой клеточного цикла и активацией процесса апоптоза [7; 11].
Однако в большинстве случаев грибные гликаны классифицируют как модификаторы биологического ответа, их противоопухолевое действие осуществляется за счет стимулирования иммунной системы, в частности макрофагов, Т-лимфоцитов, NK-клеток и индукции экспрессии генов некоторых цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, фНО-а), усиливающих защитные реакции организма [8; 10; 13].
Цель исследования - экспериментальное изучение действия полисахаридных фракций, выделенных из мицелия грибов Fomes fomentarius и Ganoderma applanatum, в отношении солидной опухоли Эрлиха в эксперименте in vivo. Задачи исследования: изучение влияния полисахаридных фракций на рост перевитой солидной опухоли Эрлиха; модулирование одного из важнейших элементов противоопухолевой защиты - функциональной активности перитонеальных макрофагов.
84 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ДЕЙСТВИЕ УГЛЕВОДНЫХ ФРАКЦИЙ МИЦЕЛИЯ...
Материалы и методы Для измерения площади под кинетической кривой роста опухоли использовали метод трапе-В работе изучали мицелиальную культуру бази- ций, базирующийся на формуле: диомицетов Ganoderma applanatum (Pers.) Pat. штамм 9 и Fomes fomentarius (L.:Fn) Fr. штамм 6 из коллекции S ^ ц + ц+1 t ц + V2 t i V2 + V3 t i i Vn—; + Vn t , где Санкт-Петербургского государственного технологиче- f; 2 "t¡ 2 't; 1 2 'tz 1 ... 1 2 X tn1 ского института (технического Университета). Мицелий грибов получали методом глубинного культивиро- y¡: объем опухоли в соответствующем измерении под вания [3]. В качестве объекта исследования использо- номером i, мм3, вали углеводные фракции, выделенные из мицелия п _ число измерений, путем водной экстракции, отличающиеся по моносаха- t; -время между первым и вторым измерениями, сутки, ридюму сосгаву и растворимости^ а иденш рфр и t2 -время между вторым и третьим измерениями, сутки, НФр G. applanatum и нерастворим^1й гликан F. Fomen- tn-; -время между предпоследним и последним измере-tarius. РФр G. applanatum представляла собой смесь ниями, сутки. гетерополисахаридов, состоящих из глюкозных, ман- нозн^1х и гаттакгштк остатков, жртсгасфимью фрж- Иммунобиологическую активность углеводных ции - хит^гаюгашгаш комплекс, причем основн^1м фракций оценивали по их влиянию на показатели углеводн^1м компоненгом фракций являлась глюкоза функциональной активности перитонеальных макро-(45-79 %). В эксперименте ferm использован^1 fcaœ фагов мышей, отражающие стадии фагоцитоза: хемо-нелинейн^1е мыши-самцы в возрасте 2,5-3,0 мес. с мас- таксис, распластывание на стекле, микробоцидность по сой тела 22-30 г (питомник «Рапполово» рАМН). Опу- отношению к живым клеткам Staphylococcus aureus холь Эрлиха £>ыла перевита подкожно введением 0,2 (штамм 209) и поглотительную способность по отно-мл ;0 %-ной взвеси клеток асцитной опухоли Эрлиха в шению к убитым нагреванием клеткам Candida albi-стерильном физиологическом растворе. В исследова- cans (штамм АТСС 855-263). Перитонеальные клетки нии были использованы 4 группы животных. Мыши ; макрофагов получали промыванием брюшной полости групп^1 служили контролем. М^1шам 2; 3 и 4 групп^1 мышей синтетической средой 199, содержащей 20% вводили соответственно фракции внутрибрюшинно сыворотки крупного рогатого скота, антибиотик (200 ежедневно в течение 5 даед, начиная с 48 ч после пере- Ед/мл канамицина) и гепарин в концентрации 5 Е^мл вивки опухоли. Все гликан^1 вводили в дозе 50 мг/кг в (рН среды 7,7). Клетки культивировали в монослое в стерильном физиологическом растворе из расчета 0,4 течение 2 суток и затем оценивали их морфофункцио-мл раствора на 20 г массы тела м^1ши. Мышш кон- нальные изменения [2]. Все полученные в работе ре- трольной группы вводили внутрибрюшинно физиоло- зультаты обрабатывали методом вариационной стати-гический раствор в те же сроки и в том же объеме. С 7 стики с вычислением среднего арифметического для дня после перевивки опухоли у всех мышей произво- каждой группы опытов и стандартного отклонения от дили измер>ение ре:змеров опухоли с определением её среднего арифметического. Достоверность различий объема по формуле: между контрольными и опытными измерениями оце- 2 Ж нивали с помощью параметрического критерия Стью-V = A X о х — , где дента. Достоверными считались различия между груп-6 пами при р<0,05. Повторность всех экспериментов А: наибольший размер опухоли, мм, составляла не менее 5 раз [4]. В: перпендикулярный ему размер, мм. Результаты и обсуждение Измерения опухолей производили до 21 дня после перевивки - дня начала гибели мышей от При изучении противоопухолевой активно-опухоли. Противоопухолевую активность оценива- сти было установлено, что ежедневное в течение 5 ли по проценту ТРО, индексу эффективности и ин- дней введение углеводных фракций не отразилось дексу роста опухоли [5; 6]. Процент торможения на общем состоянии мышей, их поведении, потреб-роста опухоли (ТРО%) определяли по формуле: лении корма и воды. Это свидетельствовало о хо-Vk — Цэ рошей переносимости полисахаридов. T % = X100, где В контрольной группе после перевивки на-Vk блюдали быстрый рост опухоли, гликаны вызывали Уэ: средний объем опухоли в группе мышей, получавших замедление роста по сравнению с контролем. По гликаны, результатам измерения объема опухоли в динамике VK: средний объем опухоли у мышей контрольной группы. (наблюдение в течение 21 дня) было установлено, что наиболее выраженным противоопухолевым эф-ИЭ, или индекс торможения, определяли по формуле: фектом обладала РФр G. applanatum, она вызывала Vk статистически достоверное торможение роста опу- ИЭ = , где холи на все сроки наблюдения, причем процент Цэ торможения достигал 58 % уже на 10 сутки после Уэ: средний объем опухоли в группе мышей, получавших перевивки. НФр G. applanatum и F. fomentarius ока-гликаны, зывали менее выраженный ингибирующий эффект VK: средний объем опухоли у мышей контрольной группы. на рост опухоли (ТРО 31-39 %), статистически достоверное торможение роста опухоли под действием ИРО определяли по формуле: фракций наблюдали на более поздних сроках экс-£э перимента (17-19 сутки; рис. 1). ИРО = , где При оценке показателя индекса эффективно- Sk сти наблюдали ту же тенденцию, что и при измере-S3: площадь под кинетической кривой роста опухоли в нии Т%, что свидетельствовало об умеренной прогруппе мышей, получавших гликаны, мм2, тивоопухолевой жгташсти НФр F. fomentarius и SK: площадь под кинетической кривой роста опухоли G- applanatum и ° досгаютш выраженн°м проти-мышей контрольной группы, мм2. воопухолевом эффекте РФр G. applanatum (рис. 2).
№ 3/том 10/2011 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ДЕЙСТВИЕ УГЛЕВОДНЫХ ФРАКЦИЙ МИЦЕЛИЯ... 85
60 п
50-
40
зон
20
10
0
Т %
мМ
7 10
■ 1
□ 2
□ 3
Рис.1. Динамика ТРО
X - время опыта;
У - ТРО.
1 - НФр Р. [отвМапиз; 2 - НФр С. аррЫпаШт; 3 - РФр С. арр1апаШт.
*р<0,05 достоверность различий показателей по сравнению с показателями в контрольной группе животных; *р<0,01 достоверность различий показателей по сравнению с показателями в контрольной группе животных.
ИЭ
■ 1
02
□ 3
2.5 2
1.5 1
0,50
7 10 12 14 17
сутки
Рис. 2. Динамика изменения индекса эффетивности препаратов:
X - время опыта;
У - индекс эффективности препаратов.
1 - НФр Р. [отвМапиз; 2 - НФр С. арр1апаЫт; 3 - РФр С. арр1апаЫт.
*р<0,05 достоверность различий показателей по сравнению с показателями в контрольной группе животных; *р<0,01 достоверность различий показателей по сравнению с показателями в контрольной группе животных.
контроль
1
сутки
Рис. 3. Кинетические кривые роста опухолей:
X - время опыта;
У - объём опухолей, мм3.
1 - НФр Р. [отвМапиз; 2 - НФр С. арр1апа1ит; 3 - РФр С. арр1апаШт.
Процент ТРО и индекс эффективности отражают выраженность терапевтического действия препаратов, однако для того, чтобы оценить совокупный эффект противоопухолевой терапии необходимо учитывать и его продолжительность. Для оценки динамики изменения объемов опухолей в опытной и контрольной группе использовали кинетические кривые роста опухолей (рис. 3). Большую информационную ценность имеет использование показателей, которые характеризуют кинетические кривые роста опухолей не в отдельных точках, а в совокупности. Такими показателями могут служить площади под кинетическими кривыми роста опухолей [5; 6]. Интегральным критерием, учитывающим как величину, так и продолжительность противоопухолевого действия препарата, является ИРО, который рассчитывается как соотношение площадей под кинетическими кривыми роста опухолей в экспериментальной и контрольной группе. Индекс роста в контроле принимается за 1, в подопытных группах при регрессии опухоли, стабилизации или торможении ее роста он будет меньше 1, а при стимуляции -больше 1. Чем меньше ИРО, тем продолжительнее и сильнее терапевтический эффект. При введении нерастворимых фракций Г. [отви^лт и С. арр1апаШт ИРО составлял 0,79 и 0,68 соответственно (площади под кинетическими кривыми роста опухолей составляли соответственно 79 и 68 % по отношению к контролю) и разница между опытом и контролем не являлась статистически достоверной. При применении РФр С. арр1апа1ит ИРО с высокой степенью достоверности (р<0,01) отличался от контрольных значений и составлял 0,46 (46 % по отношению к контролю), следовательно, наиболее устойчивым и выраженным противоопухолевым действием обладала РФр С. арр1апа1ит. Таким образом, наиболее выраженную противоопухолевую активность в отношении солидной опухоли Эрлиха проявляла РФр С. арр1апай1т, нерастворимые углеводные фракции Г Нотвпапш и С. арр1апай1т соответственно оказывали слабое противоопухолевое действие. Иммунобиологическую активность углеводных фракций изучали по их влиянию на функциональную активность перитонеальных макрофагов мышей в динамике в течение 10 суток после их введения. Фракции достоверно стимулировали функциональную активность макрофагов в течение всего срока наблюдения (10 дней). Наиболее эффективна была РФр С^.арр^ап^^^, при её введении показатели хемотаксиса и активации цитоплазматической мембраны макрофагов (распластывания) достигали максимальных значений на 5 сутки эксперимента: количество перитонеальных клеток в брюшной полости увеличивалось в 2,9 раза (р<0,01), количество распластанных макрофагов - в 2 раза по сравнению с контрольным уровнем (р<0,01).
Литература
К 10 суткам показатели несколько снижались, сохраняясь достоверно выше контроля (р<0,01). Нерастворимые фракции оказывали менее выраженное стимулирующее действие на макрофаги, чем РФр, но обладали пролонгированным эффектом, который сохранялся вплоть до 10 суток эксперимента. Микробоцидные функции макрофагов под влиянием гликанов оценивали по отношению к Б. аигвж Сравнивали выживаемость клеток Б. аитвш при контакте со стимулированными полисахаридами макрофагами и макрофагами, полученными от контрольной группы. Фагоцитарную активность оценивали по интенсивности поглощения макрофагами убитых нагреванием клеток С.а1Ысапз. Исследуемые фракции достоверно увеличивали микробоци-дый эффект и поглотительную способность макрофагов. Процент фагоцитирущих клеток после введения фракций увеличивался в 1,4-2,1 раза по сравнению с контролем, микробоцидный эффект фагоцитов повышался в 2,6-3,5 раза (р<0,01), причем наиболее активна была РФр С.арр1ап^^ит. Таким образом, углеводные фракции, выделенные из мицелия исследуемых грибов, проявляли различное по степени активации действие на функциональный статус макрофагов. Растворимая фракция мицелия С^.арр1ап^^ит оказывала более заметное активирующее действие на макрофаги по сравнению с нерастворимыми гликанами, но при этом эффект нерастворимых фракций был более длительным. На основании полученных результатов можно сделать предположение о том, что способность грибных глика-нов активировать макрофаги, клетки неспецифической противоопухолевой резистентности, может иметь отношение к механизму ингибирования опухолевого роста.
Выводы
Растворимая полисахаридная фракция С. Арр-1апаШт обладает выраженным противоопухолевым эффектом в отношении солидной опухоли Эрлиха, нерастворимые фракции С. арр1апаШт и Г. РотвМа-пш обладают слабой противоопухолевой активностью. Полисахаридные фракции, выделенные из мицелия, обладают выраженным стимулирующим действием на клетки системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ), в частности перитонеальные макрофаги мышей, что проявляется в увеличении показателей их функциональной активности. Растворимая полисахаридная фракция С.арр1апа^ит более активна по сравнению с нерастворимыми фракциями. Ингибирование опухолевого роста под действием гликанов может быть связано с активацией макрофагов, участвующих в неспецифической противоопухолевой резистентности.
1. Денисова Н.П. Лечебные свойства грибов. Этномикологический очерк. - СПб: Изд. СПбГМУ, 1998. - 59 с.
2. Иммунологические методы / под ред. Г. Фримеля; пер. с нем. А.П. Тарасова. - М.: Медицина, 1987. - 472 с.
3. Кожемякина НВ, Гурина С.В., Ананьева Е.П. Глубинное культивирование некоторых базидиомицетов // Тез. докл. II съезда микологов России... - М., 2008. - Т. 2. - С. 330.
4. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под общ. ред. Р.У.Хабриева. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2005. - 832 с.
5. Стуков А.Н., Иванова МА., Никитин А.К. Индекс роста опухоли как интегральный критерий.. .//Вопросы онкологии. -2001. - Т. 47, № 5. - С. 616-8.
6. Стуков А.Н., Иванова МА, Никитин А.К. Оценка эффекта противоопухолевой терапии в эксперименте на основании площади под кинетической кривой роста опухоли//Матер. 5-го Всерос. съезда онкологов. - Казань, 2000. - Т. 1. - С. 226-7.
7. Chen W, Zhao Z., Chen S., Li Y Optimization for the production of.. .//Bioresource Technology. - 2008. - 99(8). - P. 3187-94.
8. Kidd P.M. The use of mushroom glucans and proteoglycans in cancer treatment // Altern. Med. Rev. - 2000. - 5. - P. 4-27.
9. Mizuno T. The extraction and development of.. .//Int. J. of Medicinal Mushrooms. - 1999. - 1 - P. 195-206.
10. Monro J.A. Treatment of cancer with mushroom products // Arch. Environ. Health. - 2003. - 58(8). - P. 533-7.
11. Muller C.I, Kumagai T, OKelly J. et al. Ganoderma lucidum causes apoptosis in leukemia, lymphoma and multiple myeloma cells // Leukemia research. - 2006. - 30(7). - P. 841-8.
12. ReshetnikovS. V, Higher Basidiomycota as a source of antitumor. // Int. J. Med. Mush. - 2001. - 3. - P. 361-94.
13. Wasser S.P., Weis A.L. Medical properties of substances.// Int. J. of Medicinal Mushrooms. - 1999. - 1 - P. 31-62.
14. WasserS.P. Reishi or Ling Zhi (Ganodermalucidum); Encyclopedia of Dietary Supplements. - NY: Marcel Dekker Inc., 2005. - P. 603-21.
