CC BY
134
Сибирский медицинский журнал, 2006, М 8
ЛЕКАРСТВЕННЫЕ РАСТЕНИЯ
©ЧХЕНКЕЛИ В.А., ОГАРКОВ Б.Н., ЧХЕНКЕЛИ Г.Д., ОГАРКОВАГ.Р., САМУСЕНОКЛ.В. - 2006
СОСТАВ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ
В.А. Чхенкели, Б.Н. Огарков, Г.Д. Чхенкели, Г.Р. Огаркова, Л.В. Самусёнок
(Иркутский филиал Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН, директор — к.в.н. В.Л. Тихонов, лаборатория биотехнологии, зав. — д.б.н. В.А. Чхенкели' Научно-исследовательский институт биологии при Иркутском государственном университете, директор — к.б.н. Л.С. Изместьева, лаборатория экспериментальной биотехнологии, зав. — д.б.н., проф. Б.Н. Огарков)
Резюме. Установлено, что при глубинном культивировании некоторые ксилотрофные базидиомицеты синтезируют экзополисахариды. Изучен состав (і-Б-глюкан-протеиновьіх комплексов грибов, показано, что внеклеточные полисахариды стимулировали развитие гуморального иммунного ответа, индуцированного эритроцитами барана. Ключевые слова. Базидиомицеты, экзополисахариды, иммунотропная активность.
В последние годы всё большее внимание исследователей привлекает изучение биологической активности полисахаридов и гликопротеинов базидиальных грибов. Уже стало очевидным, что, если не все базиди-альные грибы, то многие из них содержат биологически активные противоопухолевые и иммуностимулирующие полисахариды различного типа. Полисахариды по своей природе являются водорастворимыми P-D-глюканами с сильно разветвлённой структурой, в состав которых могут входить глюкоза, ксилоза, манноза галактоза и другие моно- и полисахаридные комплексы, а также P-D-глюкан-протеиновые комплексы (про-теоглюканы), которые, как правило, обладают иммуностимулирующей активностью [11]. В настоящее время в Японии производятся полисахаридные препараты он-костатического действия: крестин (PSK), получаемый из мицелия Trametes (Coriolus) versicolor, представляющий собой P-D-глюкан-протеиновый комплекс с молекулярной массой 100.000, лентиан, получаемый из плодовых тел Lentinus edodes (Berg.) Sing., который представляет собой р-глюкан с высокой молекулярной массой (500.000) и сонифлан (SPG), более известный как шизофиллан, который получают из культуральной жидкости Schisophyllum commune Fr. при культивировании на жидких средах, представляющий собой высокомолекулярный р-глюкан (450.000) [12,14].
Как исследования, так и практические разработки многих авторов направлены на изучение химического состава и биологической активности эндополисахаридов глубинного мицелия базидиальных грибов: L. edodes [4,13], T. versicolor [3], T. pubescens [10,11], Ganoderma lucidum (Curt.:Fr.) P. Karst. [2,13]. В китайской медицине издавна широко используются не только высшие базидиальные грибы, но и представители других классов. Так, например, онкостатически активный активный р-глюкан получают из Cordyceps ophyoglossoides (семейство Cvicipitaceae). Механизм фармакологического действия высокомолекулярных природных P-D-глюка-нов, подробно изученный на примере лентиана, основан на усилении иммунитета клеток хозяина, т.е. они действуют как индукторы интерферона, обнаруживая наряду с онкостатической, активность против ряда вирусов, включая, в отдельных случаях, вирусы СПИДа и гепатита.
Однако, на наш взгляд, на сегодняшний день наиболее перспективным является изучение экзополисахаридов с целью создания новых иммуностимулирующих препаратов, что связано не только с их высокой биологической активностью, но и с технологическими особенностями получения таких препаратов, стабильностью их состава и возможностью жёсткого контроля их качества как фармакологических средств.
Цель настоящей работы заключалась в выделении, сравнительном изучении химического состава экзополисахаридов некоторых ксилотрофных базидиальных грибов при культивировании на жидких средах и их им-мунотропной активности.
Материалы и методы
В работе использовали культуры грибов L. edodes, G. lucidum из коллекции лаборатории экспериментальной биотехнологии НИИ биологии при Иркутском государственном университете, культуру T. pubescences (Schumach.) Pilat. штамм 0663 — возбудителя белой гнили древесины — из коллекции Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН (г. Санкт-Петербург). Грибы выращивали на глю-козо-пептонной среде или неохмелённом пивном сусле с добавлением отвара вешенки в колбах Эрленмейера на круговой качалке при 200-220 об./мин. при температуре 26280С в течение 4-10 сут. Культуральную жидкость (КЖ) отделяли от биомассы центрифугированием при 6000 об./ мин. в течение 10-15 мин. и концентрировали в 2-3 раза на вакуумном ротационном испарителе ИР-12М (Россия) при 400С. Для выделения экзополисахаридов концентрированную КЖ осаждали этиловым спиртом (1:1), оставляли при температуре 40С до полного осаждения. Затем осаждённые полисахариды отделяли центрифугированием, диали-зовали, переосаждали спиртом, отделяли центрифугированием и сушили при температуре 400С [2].
ИК-спектры поглощения экзополисахаридов в виде прессованных таблеток с бромистым калием снимали на приборе Specord М-80 (Германия) в области 4000-400 см-1.
Для проведения кислотного гидролиза 20 мг полисахарида заливали 2 мл 72%-ной серной кислоты и оставляли на 16 ч при комнатной температуре. Затем пробы разводили водой до 7%-ной концентрации кислоты и гидролизовали на водяной бане в течение 5 ч.
Сахара, входящие в состав полисахаридов определяли методом ГЖХ в виде триметилсилильных (ТМС) производных на хроматографе Chrom-5 (Чехия) с пламенноионизационным детектором. ТМС производные углеводов и метчиков (ксилоза, галактоза, манноза, глюкоза, маннит, арабит, арабиноза, «Sigma», США) получали по методу [6,7].
Иммунотропную активность экзополисахаридов исследовали в соответствии с общепринятой методикой [5,8].
Математическую обработку результатов экспериментов и оценку достоверности проводили по критерию Стьюден-
7O
та для уровня вероятности не менее 95% с использованием пакета программ Microsoft Excel 97.
Результаты и обсуждение При экзополисахаридов из КЖ исследуемых культур грибов было установлено, что T. pubescens, L. edodes,
G. lucidum синтезировали до 4,6, 3,8, 6,5 г/л внеклеточных полисахаридов, соответственно.
Динамика накопления биомассы, потребления глюкозы и биосинтетической активности продуцента T. pubescens при культивировании на глюкозо-пептонной среде показана на рис. 1.
Изучение роста Т. риЬезсет в глубинных условиях показало, что максимальный уровень биомассы достигал 8,8 г/л на 10-12 сут., а количество экзополисахаридов увеличивалось до 4,4-4,6 г/л.
Установлено, что экзополисахариды всех исследуемых культур слабо растворялись в воде, лучше — в щёлочи (0,5-0,7% гидроокиси натрия), при этом их растворимость повышалась с увеличением концентрации едкого натра.
В составе внеклеточных полисахаридов базидиоми-цетов обнаружено значительное количество белка: Ь. ес1ос1е8 — 9,6%, С. 1иайит — 8,5%, Т. риЬеьсет — 9,5%.
После обработки КЖ грибов (перед выделением полисахаридов) трихлоруксусной кислотой количество белка не изменялось, что позволило отнести синтезируемые полисахариды к гликопротеинам.
Хроматографический анализ гидролизатов экзополисахаридов базидиомицетов показал, что они являются гетерогликанами с различным соотношением моносахаридов (глюкозы, маннозы, ксилозы, галактозы, ара-бинозы). Результаты представлены в табл. 1.
Для идентификации экзополисахаридов были записаны и проанализированы их ИК-спектры. Известно, что полисахариды — один из самых трудных объектов для ИК-спектроскопии — из-за большого количества ОН- и СН-групп [13].Однако ИК-спектры дают цен-
ную информацию о строении полисахаридов, типах связей этих интересных и ценных объектов. Установлено, что наиболее сильные полосы поглощения находятся в области 3400 см-1. Их следует рассматривать как проявление валентных колебаний — ОН-групп, которые включены в меж- и внутримолекулярные водородные связи. Об этом свидетельствует смещение максимума в область меньших волновых чисел относительно максимума поглощения свободного гидроксила (3615 см-1). Полоса 2940 см-1 в коротковолновой области соответствует проявлению колебаний СН2-групп. Полоса 1550 см-1 относится к колебаниям =NH— групп. Наличие полосы поглощения при 1550 см-1 подтверждает тот факт, что экзополисахариды исследуемых культур базидиомицетов содержат азот (белок) и относятся к гликопротеинам.
Самой главной является область 1200-800 см-1 — область «отпечатков пальцев углеводов», о чём свидетельствует наличие полос, свойственных деформационным колебаниям — С-С-, -С-О-, СН- и ОН— групп и колебаниям пиранозного кольца. Для образцов экзополисахаридов наиболее интенсивной полосой в области 1200-800 см-1 является пик 1075-1074 см-1, что характерно для хитина и хитозана [2,13].
Наибольшую информацию о структуре полисахарида несёт ближняя ИК-область спектра (аномерный регион, 800-900 см-1), наличие полос в которой характеризует направление и тип связей в макромолекуле, а также конформационные и конфигурационные особенности полимера. В этой области очень хорошо видны структурные различия полисахаридов. Так, в спектре экзополисахаридов присутствует полоса 898-900 см-1, свидетельствующая о наличии р — типа связи: р-(1 ^ 3), р-(1 ^ 6). С этим согласуются данные по растворимости. По данным литературы [4], многие полисахариды, имеющие Р—(1 ^ 3) связи, т.е. Р—(1 ^ 3) — глюка-ны, плохо растворимы в воде. Их растворимость в значительной степени определяется молекулярной массой (чем она выше, тем хуже растворимость).
На основании проведённых исследований можно считать, что экзополисахариды, синтезируемые базидиомицетами L. edodes, G. lucidum, T. pubescens, являются гликопротеинами, а основным их мономером является глюкоза. Экзополисахариды грибов представляют собой глюканы с р—(1 ^ 3)-связью. Аналогичные связи содержатся в структурах молекул полисахаридов грибного, микробного [9] и растительного происхождения [1], обладающих биологической активностью.
Исследование иммунотропной активности полисахаридов гриба T. pubescens показало, что при введении мышам один раз в сутки per os в дозе 0,8 г/кг полисахариды не оказывают влияния на массу тела, уровень лейкоцитов и лейкоцитарную формулу, фагоцитарную активность и состояние системы комплемента, оказывают незначительное влияние на показатель специфичес-
0 1 2 3 4 5 В 7 В Э 10 11 12 13 14
Продолжительность культ -л , сут.
—1 - Концентрация биомассы, г/л (по а.с.б.) —±—3 - Концентрация экзополисахаридов, г/л ♦ 2 - Концентрация глюкозы, г/л
Рис. 1. Динамика потребления глюкозы, накопления биомассы и биосинтетической активности при глубинном культивировании Т. риЬевсепв на глюкозо-пептонной среде: 1 — накопление биомассы гриба, г/л; 2 -содержание глюкозы в среде, г/л; 3 — накопление экзополисахаридов, г/л.
Таблица 1
Углеводный состав экзополисахаридов, синтезируемых базидиомицетами
^л^ура Углеводы, %
глюкоза манноза галактоза ксилоза арабиноза
L. edodes 86,3 12,9 O,8 следы следы
G. lucidum 89,2 IO,7 O,I следы следы
T. pubescens 74,6 16,9 следы 8,5 следы
кого клеточного иммунитета, индуцированного эритроцитами барана — реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ).
Таблица 2
Влияние экзополисахаридов гриба Т. pubescens на показатели неспецифической резистентности у мышей
Показатели Группы
контрольная n=I2 опытная n=I2
Масса селезёнки, г O,25+O,O5 O,28+O,O6
Селезёночный индекс I,O5+O,4O I,28+O,35
Число антителообразующих клеток селезёнки (в 1000 спленоцитов) I45,3+4O,2 169,4+19,2
Титр гемагглютининов ^ М, 1ов2 3,8+O,58 5,9+O,53
Титр гемагглютининов 1в С, 1ов2 2,7+O,52 3,I+O,42
Выраженность реакции ГЗТ-индекс ГЗТ, % 6,6+2,5 6,9+2,7
Однако полисахариды стимулировали развитие гуморального иммунного ответа, индуцированного по стандартной схеме. Эта стимуляция проявлялась высоким в сравнении с группой контроля увеличением уровня антител к эритроцитам барана—^ М, а также тенденцией к увеличению гемагглютининов ^ С числа антителообразующих клеток селезёнки и селезёночного индекса (табл. 2).
Таким образом, проведённые исследования показали, что изучаемые базидиомицеты синтезируют экзополисахариды при культивировании в глубинных условиях, которые представляют собой глюкопротеины, основным мономером которых является глюкоза. Экзополисахариды грибов являются Р-Б-глюканы с р-(1 ^ 3)-связью и обладают иммунотропной активностью.
STRUCTURE AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF EXTRACELLULAR POLYSACCHARIDS OF
XYLOTROPHIC BAZIDIOMYCETES
V.A. Chhenkeli, B.N. Ogarkov, G.D. Chhenkeli, G.R. Ogarkova, L.V. Samusyonok (Irkutsk Department of Institute of Experimental Veterinary Science of Siberia and the Far East, Siberian Department of RAAS; Scientific Research Institute of Biology of Irkutsk State University)
It is established, that at deep cultivation researched xylotrophic bazidiomycetes synthesize exopolysaccharides. The structure of glucan-protein complexes of mushrooms is investigated. It is shown, that extracellular polysaccharides stimulate development of humoral immune response, induced by sheep red blood cells.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алексеева С.А., Шевченко Н.М., Кусайкин М.И. и др. Полисахариды диатомовых водорослей озера Байкал // Прикл. биохим. и микробиол. — 2005. — Т 41. — С.213-
2. Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Пучкова Т.А. и др. Факторы, влияющие на образование полисахаридов вапоёегта 1ис'к1ит // Прикл. биохим. и микробиол. — 2005. — Т. 41, № 2. — С. 194-199.
3. Горшина Е.С., Скворцова М.М., Бирюков В.В. Технология получения биологически активной субстанции лекарственного гриба кориола опушённого // Биотехнология. — 2003. — № 2. — С.45-53.
4. Лобанок А.Г., Бабицкая В.Г., Пленина Л.В. и др. Состав и биологическая активность глубинного мицелия кси-лотрофного базидиомицета ЬепИпиз еёоёез // Прикл. биохим. и микробиол. — 2003. — Т 391, № 1. — С.69-73.
5. Методические рекомендации по оценке иммунотокси-ческих свойств фармакологических средств / Под ред. В.П. Фисенко. — М., Наука, 1999. — ГО с.
6. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов / Под ред. С.Д. Варфоломеева. — М.: ВИНИТИ, 1993. — 152 с.
7. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / Под ред. И.М. Скурихина,
B.А. Тутельяна. — М.: Брандес, Медицина, 1998. —
C. 123-127.
8. Сычёв И.А., Порядин Г.В., Смирнов В.М. Действие по-
лисахаридов на систему крови крыс // Бюл. экспер. биол. и мед. — 2OO6. — № 5. — C.53O-533.
9. Чxенкели B.A. Биологически активные вещества Coriolus pubescens (Shum.:Fr.) Quel. и их использование в медицине, ветеринарии, экологии и пищевой промышленности. — Швосибирск: ООО «Юпитер», 2OO6. — 259 с.
10. Чxенкели B.A., Знамировская A.B., Скворцова Р.Г. и др. Полисахариды высших базидиомицетов в коррекции иммунопатологических состояний // Мат. 2-ой межрег. научн. конф. «Человек и окружающая среда». — Рязань, 1998. — C.246-247.
11. Чxенкели B.A., Малова T.H., Чxенкели Г.Д. и др. Пепти-до-полисахаридные комплексы Coriolus pubescens (Shum.:Fr.)Quel. как иммуностимуляторы природного происхождения // Тез. III ежегодной научно-практ. конф. «Aктуальные вопросы медицинского обеспечения при чрезвычайных ситуациях и катастрофах», I6-
|7сентября I999 г. — Иркутск, 1999. — C.4O-4I.
12. Чxенкели B.A., Таонова И.B. ^временные представления о возможности использования пептидополисахаридных комплексов базидиальных грибов как иммуностимуляторов // C^. мед. журн. — 2OOO. — № I. — C.II-I7.
13. Щерба B.B., Бабицкая B.r Углеводы глубинного мицелия ксилотрофных базидиомицетов // Прикл. биохим. и микробиол. — 2OO4. — Т. 4O, № 6. — C.634-638.
14. Wasser S.P. Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulatinh polysaccharides // Appl. Microbiol., Biotechnol. — 2OO2. — Vol. 6O. — P.258-274;
СЛУЧАИ ИЗ ПРАКТИКИ
© ЗОБНИН Ю.В., ПРОВАДО И.П., ПЕШКОВ Д.М., ТЕТЕРИНА И.П., ЛЕЛЮХТ.Д. - 2006
К ВОПРОСУ О МАССОВОМ ОТРАВЛЕНИИ СОДЕРЖАЩИМИ АЛКОГОЛЬ ЖИДКОСТЯМИ, ОСЛОЖНЕННОМ ТОКСИЧЕСКИМ ПОРАЖЕНИЕМ ПЕЧЕНИ
Ю.В. Зобнин, И.П. Провадо, Д.М. Пешков, И.П. Тетерина, Т.Д. Лелюх
(Иркутский государственный медицинский университет, ректор — д.м.н., проф. ИВ. Малов, кафедра внутренних болезней с курсами ПП и ВПТ, зав. — к.м.н., доц. С.К. Седов; МУЗ г. Иркутска «МСЧ ИАПО», гл. врач —
Н.П. Матвейчук; Бюро судебно-медицинской экспертизы Главного управления здравоохранения администрации
Иркутской области, нач. — к.м.н., доц. В.Н. Проскурин)
Резюме. Представлены сведения о клинических проявлениях, лабораторных, ультразвуковых признаках и некоторых результатах стационарного лечения больных с отравлением содержащими алкоголь жидкостями, осложненным поражением печени с выраженным синдромом холестаза. Приведены результаты гистологического исследования печени и почек.
Ключевые слова. Отравление содержащими этанол жидкостями, токсический гепатит, холестаз.
Клинические проявления токсического повреждения печени и почек обнаруживаются более чем в 30% случаев острых отравлений. Существует два основных патогенетических механизма токсических повреждений печени и почек: специфический, связанный с нарушением их выделительной обезвреживающей функции, и неспецифический, зависящий от участия этих органов в поддержании гомеостаза. Повреждение печени и почек при остром отравлении обусловлено общими филогенетическими и анатомическими особенностями этих органов, их тесной функциональной связью [4]. Выделяют облигатные (истинные) гепатотоксиканты, вызывающие дозо-зависимый эффект, как правило, воспроизводимый в эксперименте, а также идиосинкратические гепатотоксиканты, повреждающие орган лишь у чувствительных индивидов, дозо-независимо и невоспроизводимо в эксперименте [11]. В основе идиосинкразии предполагаются генетически детерминиро -ванные особенности метаболизма ксенобиотиков и иные, в том числе иммунные, причины повышенной чувствительности, например, аллергия. Патологические изменения печени химической этиологии могут быть отнесены к одному из двух типов: цитотоксичес-кие и холестатические. Цитотоксические повреждения печени проявляются некрозом, стеатозом, канцерогенезом, холестатические — нарушением секреции желчи на интралобулярном (гепатоцеллюлярном и канали-курярном) или экстралобулярном (дуктулярном) уровнях [8,9]. К числу холестатических гепатотоксикантов относят ряд лекарственных препаратов (эритромицин, метилтестостерон, мерказолил и др.) и промышленных веществ (органические соединения мышьяка, этанол и др.), механизмы их действия практически неизвестны [3].
В истории известны случаи острых массовых отравлений, с развитием поражения печени, связанных с пищевыми продуктами. Так, в 1965 г. в Англии, попадание в муку метилендианилина (4,4-диаминофенил-метана) привело к развитию токсического гепатита у 84 пострадавших (“Epping jaundice”), попадание в корм для скота полибромистых дифенилов в Мичигане (1973) вызвало нарушение функциональных показателей печени у 92 чел., с загрязнением рисового масла полихло-
ристыми дифенилами связывают увеличение числа случаев рака печени в 1968 г. в Японии (Yucho - “rice oil disease”), и в 1979 г. в Тайване (Yu-Cheng — “oil disease”). Указывается, что холестатический гепатит был одним из проявлений эпидемического токсического синдрома —“toxic oil syndrome” (пневмонит, эозинофилия, легочная артериальная гипертензия, склеродермиeподоб-ные и нейромышечные изменения), развившегося в 1981 г. в Испании в результате загрязнения анилином рапсового масла (этиологический фактор этого массового отравления точно установить не удалось). В результате отравления пострадали 19000 человек, умерли, по меньшей мере, 340 человек [10].
В России острые массовые отравления алкогольсодержащей жидкостью впервые были зарегистрированы с мая по август 2004 г. в Верхней Салде Свердловской области, когда в Центральную городскую больницу поступили 90 больных с признаками острого неинфекционного гепатита. Расследование причин отравления выявило, что все пострадавшие употребляли жидкость «Хелиос» — антисептическое средство для дезинфекции помещений тубдиспансеров, содержащее 93% этилового спирта, около 7% — диэтилфталатов и 0,1% полигек-саметиленгуанидина гидрохлорида. Токсикодинами-ческие и токсикокинетические характеристики жидкости «Хелиос» и ее аналогов не изучены [6].
В июле-августе 2006 г. случаи подобных отравлений были зарегистрированы в Тверской, Белгородской, а затем и других областях. По данным Министерства по чрезвычайным ситуациям отравления алкогольсодержащими жидкостями с развитием своеобразного поражения печени зарегистрированы в 15 субъектах РФ, а также в Белоруссии и Литве.
В Иркутской области первая информация о массовых отравлениях поступила в середине октября из За-ларинского, Балаганского и Усть-Удинского районов, где пострадавшие, еще в конце сентября, стали поступать в лечебные учреждения с диагнозом вирусный гепатит. Однако, признаков инфекционного характера гепатита выявлено не было. На конец декабря 2006 г. данные отравления были зарегистрированы в 29 регионах области, а общее число пострадавших составляло
