CC BY
50
УДК 537.533.35:576.852.2
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭЛЕКТРОННО-ЦИТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МYCOBACTERIUM LEPRAE, МУСОВАСТЕЯШМ «LUFU» И М YCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
М. Ю. ЮШИН, А. К. МАСЛОВ, В. В. АНОХИНА*
В связи с отсутствием воспроизводимых методов культивирования М. leprae in vitro основным источником бактериальной массы являются животные с экспериментальной лепрозной инфекцией (мыши, крысы, броненосцы). Длительность развития экспериментальной лепрозной инфекции (1,5-2 года), а также сложности, связанные с многоэтапным процессом выделения М. leprae из инфицированных тканей, в результате которого нарушается их поверхностная структура, заставляют искать новые подходы для решения проблемы получения бактериальной массы. В качестве альтернативного источника бактериальной массы с целью разработки новых вакцинных и диагностических препаратов в НИИ по изучению лепры была предложена культура М. «lufu» [5, 6, 7], выделенная из почвы в Заире в 1980 году [9] и первоначально использовавшаяся в лепрологии для скрининга in vitro препаратов с потенциальной противолепрозной активностью. Интерес к этой культуре обусловлен наличием уникального свойства - чувствительности к низким концентрациям сульфоновых препаратов, ранее обнаруженной только у М. leprae [13]. Дальнейшее изучение М. «lufu» и М. leprae показало их сходство по ряду морфологических и антигенных свойств [2].
В 1982 году с помощью метода электронной цитохимии у M. leprae была обнаружена микрокапсула - морфологическая структура, расположенная на поверхности бактериальной клетки в виде тонкого слоя, в состав которой входят специфические антигены, полисахариды и мукополисахариды. Микрокапсула играет важную роль в адаптационных взаимоотношениях микро-и макроорганизма и, по-видимому, является фактором, препятствующим внутриклеточному перевариванию М. leprae [3, 4]. В 1967 году у М. leprae был выявлен медьсодержащий фермент ДОФА-оксидаза [10], установлена его специфичность [11], что позволило использовать определение активности этого фермента в качестве одного из тестов идентификации М. leprae, рекомендованного ВОЗ. Роль ДОФА-оксидазы в процессе жизнедеятельно -сти М. leprae окончательно не установлена. В экспериментах на интраплантарной модели Shepard было показано, что ингибиторы ДОФА-оксидазы подавляют размножение М. leprae в подушечках лап мышей, в связи с чем предполагается, что данный фермент играет важную роль в процессе размножения М. leprae [12].
Цель исследования - сравнительное электронноцитохимическое изучение М. leprae, М. «lufu» и М. tuberculosis по наличию микрокапсулы и активности ДОФА-оксидазы.
Материалы и методы. Материалом для исследования служили М. leprae в биоптатах кожных лепром, полученных от больных лепроматозной лепрой. М. «lufu» и лабораторный штамм М. tuberculosis R37Rv культивировали на плотной питательной среде Левенштейна - Йенсена при + 37° С, М. «lufu» - в течение 10 дней, М. tuberculosis - в течение 28 дней. Культивируемые микобактерии синхронизировали холодом в течение 72 часов при +4° С. Для электронной микроскопии применяли методы препарирования материала, включающие фиксацию глюта-ральдегидом и четырехокисью осмия, обезвоживание и заключение в эпоксидные смолы, а также специальные методы выявления кислых мукополисахаридов (гликозаминогликанов) и ДОФА-оксидазы [1]. Ультратонкие срезы микобактерий получали на ультратоме LKB-8802А (Швеция) и изучали в электронном микроскопе Тесла-БС-540 при ускоряющем напряжении 80 кВ и увеличении от 10 до 40 тыс. крат. Для электронноцитохимического выявления кислых мукополисахаридов применяли метод контрастирования рутениевым красным по Luft [8] и его модификации, в соответствии с которыми в фиксирующие и буферные растворы, наряду с 0,1% раствором рутениевого красного (фирмы «BDH», Англия), добавляли 4% раствор диметил-сульфоксида, который способствовал проникновению красителя в структуры бактериальной клетки. Для контроля специфичности контрастирования часть материала предварительно выдерживали в течение 6-12 часов в среде, содержащей 300 МЕ/мл тестикулярной гиалуронидазы (фирмы «Reanal», Венгрия).
* НИИ по изучению лепры Росздрава, 414057, г. Астрахань, пр. Н. Островского 3
ДОФА-оксидазу выявляли методом электронной цитохимии по Mishima [1], в качестве субстрата применяли D,L-3,4-диоксифенилаланин (фирмы «BDH», Англия) и D-3,4-диоксифенилаланин (фирмы «Sigma», США). В качестве контроля использовали бессубстратное инкубирование исследуемого материала и ингибирование фермента добавлением в среду 10 мМ цианида натрия или предварительным нагреванием. Результаты. На ультратонких срезах М. leprae кислые мукополисахари-ды, маркирующиеся отложениями рутениевого красного, выявлялись кнаружи от электронно-прозрачного слоя клеточной стенки в области микрокапсулы. Слой гликозаминогликанов имел неравномерную толщину от 5-10 до 30-40 нм, в связи с чем наружная поверхность М. leprae выглядела фибриллярной (рис. 1).
► e1* - 1
0,1 ыкы мл. /
Рис. 1. Локализация гликозаминогликанов микрокапсулы (стрелки) кнаружи от электронно-прозрачного слоя клеточной стенки M.leprae (х75000)
У М. tuberculosis и М. «lufu» слой гликозаминогликанов, маркирующийся отложениями рутениевого красного, также выявлялся кнаружи от клеточной стенки и имел фибриллярный вид, причем толщина слоя у М. tuberculosis варьировала от 10 до 45 нм. Наблюдался ряд особенностей этого слоя у М. «lufu», так как гликозаминогликаны микрокапсулы этих микобактерий нередко выявлялись в виде крупных конгломератов, либо в виде отдельных глыбок, либо в виде тонкого слоя (рис. 2, 3).
Рис. 2. Локализация гликозаминогликанов микрокапсулы (стрелки) кнаружи от электронно-прозрачного слоя клеточной стенки M. tuberculosis H37Rv (х105000)
Рис 3. Локализация гликозаминогликанов микрокапсулы (стрелки) кнаружи от электронно-прозрачного слоя клеточной стенки М.«1и:Ти» (х50000)
В контрольных препаратах, при предварительной обработке материала гиалуронидазой, слой гликозаминогликанов у всех исследуемых видов микобактерий не выявлялся, или же интен-
сивность отложений значительно снижалась. На ультратонких срезах микобактерий активность ДОФА-оксидазы маркировалась отложениями фермент-субстратных комплексов (ФСК), выявляющих место локализации фермента. У М. leprae активность ДОФА-оксидазы проявлялась в виде усиления электронной плотности плазматической мембраны и мезосом. В цитоплазме бактериальных клеток определялись отложения ФСК, представляющих собой электронно-плотные гранулы размером 10-50 нм. Наблюдалась также повышенная электронно-оптическая плотность округлых образований, так называемых «гомогенных телец», природа которых остается неясной (рис. 4 а, б).
П SA
а - б
Рис. 4. Локализация активности ДОФА-оксидазы, маркирующаяся отложениями ФСК, (стрелки), а - в области плазматической мембраны (ПМ), мезосом (М), цитоплазмы (Ц), б - в области «гомогенных телец» (ГТ) M. leprae (без дополнительного контрастирования, x50000)
На ультратонких срезах М. «lufu» маркеры активности ДОФА-оксидазы в виде ФСК размером 10-50 нм обнаруживались чаще в цитоплазме бактериальных клеток около плазматической мембраны. Наблюдалось также усиление электронной плотности «гомогенных телец», что является доказательством локализации ДОФА-оксидазы в этих включениях (рис. 5).
Рис. 5. Локализация активности ДОФА-оксидазы, маркирующаяся отложениями ФСК, (стрелки) в цитоплазме и «гомогенных тельцах» (ГТ)
M. «lufu» (без дополнительного контрастирования, х50000)
У M. tuberculosis активность ДОФА-оксидазы не наблюдалась. В контрольных препаратах маркеры активности ДОФА-оксидазы - отложения ФСК в мембранных структурах, цитоплазме и «гомогенных тельцах» изучаемых микобактерий не выявлялись. Методом контрастирования рутениевым красным у М. leprae, М. «lufu» и М. tuberculosis H37Rv обнаружена микрокапсула, которая, являясь наружным структурным элементом бактериальной клетки, не только препятствует перевариванию микобактерий фагоцитами, но также, по нашему мнению, способствует выживанию этих микобактерий в неблагоприятных условиях внешней среды, в том числе и вне организма хозяина. Сравнительное электронно-цитохимическое изучение выявило активность ДОФА-оксидазы у М. leprae и М. «lufu», а у М. tuberculosis активность этого фермента отсутствовала. Маркеры активности ДОФА-оксидазы обнаружены на мембранных структурах, а также в цитоплазме и «гомогенных тельцах» М. leprae и M. «lufu», что говорит о сходстве метаболических процессов, происходящих в этих микобактериях, о необходимости использования в процессе жизнедеятельности фенольных соединений.
Выводы. По наличию микрокапсулы, ДОФА-оксидазной активности, а также локализации маркеров активности этого фермента в структурах бактериальных клеток между М. leprae и М. «lufu» обнаружено сходство, что, наряду с выявленным в [2] сходством ряда морфологических и антигенных параметров, является доказательством общности биологических свойств этих микобактерий и позволяет рекомендовать культуру М. «lufu» для дальнейшего изучения и использования в лепрологии.
Литература
Ї.ГайерГ. Электронная гистохимия.- М.: Мир 1974.
2.Калянина О. В. и др. // Пробл. туберкулеза.- 2000.- N° 5.— С. 49—52.
3.Маслов А. К. Ультрацитохимические особенности микобактерий при лепроматозном типе лепры и характер взаимоотношений возбудителя с клетками организма больного при рецидивах заболевания: Автореф. дис... канд. мед. наук.— М., 1982.
4.Маслов А.К., Дячина М.Н. // Ж. микробиол.— 1996.— № 1.— С. 84—87.
5.Пат. № 2124730 Россия. Способ диагностики лепры / Юшин М. Ю. и др.// Изобретения.— 1999.— № 1.
6.Пат. №213519 Россия. Способ иммунопрофилактики экспериментальной лепрозной инфекции / Юшин М. Ю., Каляни-на О. В. // Изобретения.— 1999.— № 24.
7.Пат. № 2171689 Россия. Способ диагностики лепры / Дячина М. Н., Юшин М. Ю., Ющенко А. А., Бочановский В. А. // Изобретения.— 2001.— № 22.
S.Luft J. H. // Feder. Proc.— 1966.— Vol. 25.— P. 1773—1783.
9.Portaels F.//Ann Soc Belge Med Trop.—1980.— Vol.60.— P. 381—386.
10.Prabhakaran K. // Int J Lepr.— 1967.— № 1.— P. 42—51.
11.PrabhakaranK. // Int J Lepr.— 1973.— Vol.41, №1.— P. 121.
12.Prabhakaran K. //LeprosyRev.—1973.— Vol.44, №3.— P. 112.
13.Seydel J. K. Wempe E. C. // Int. J. Lepr.— 1982.— Vol. 50,
№1.— P. 20—30.
УДК 616-002.73.576.852.213
ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТОВ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ ИНФИЦИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ МЫШЕЙ НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ MYCOBACTERIUM LEPRAE
В.В. АНОХИНА, А.К. АЮПОВА, М.Ю. ЮШИН, Н.Г. УРЛЯПОВА,
О.В. КАЛЯНИНА *
М. leprae не культивируются in vitro, поэтому единственным способом оценки их жизнеспособности является использование экспериментальной модели лепрозной инфекции на лабораторных животных. В настоящее время общепринятой моделью, применяемой в лепрологии не только для оценки жизнеспособности М. leprae, но и для скрининга противолепрозных препаратов, а также изучения протективности потенциальных противоле-прозных вакцин, является интраплантарная модель, разработанная С.С. Shepard в 1960 году [5]. Данная модель предусматривает заражение иммунологически интактных мышей в подушечку лапы дозированным количеством М. leprae, с последующим локальным их размножением в месте инокуляции. Через 6-9-12 месяцев после заражения число М. leprae в инфицированной лапе подсчитывается и сравнивается с числом введенных в момент заражения, при этом размножение М. leprae в подушечке лапы мыши служит основным критерием их жизнеспособности. Рядом исследователей предпринимались попытки изучить выживание М. leprae при длительном хранении в инфицированных тканях in vitro. В частности Prabhakaran et al. [4] показали, что М. leprae сохраняют жизнеспособность при хранении в инфицированных тканях девятипоясных броненосцев при температуре -80° С в течение 19 месяцев. А.А. Ющенко [1], А.А. Ющенко и Н.Г. Урляпова [2] отмечали, что М. leprae остаются жизнеспособными при длительном хранении кожных лепром, полученных от больных лепроматозной лепрой людей, в 40% растворе глицерина при температуре от +4° С до +22° С.
Цель исследования - изучение влияния различных вариантов длительного хранения инфицированных тканей мышей при температуре -18° С на жизнеспособность М. leprae.
Материалы и методы. Исследование проведено на 183 мышах линии СВА и ВАLВ/С, массой 18-20 г. Материалом для изучения служили 19 различных штаммов М. leprae, пассируемых на мышах (от 3-го до 9-го пассажей), первоначально выделенных в НИИ по изучению лепры от 7 больных лепроматозной лепрой людей. Лапы мышей, инфицированные М. leprae, помещали в стерильные пластиковые контейнеры (бакпечатки одноразового применения) и хранили при температуре -18° С от 3 до 24 месяцев. Материал для хранения разделен на три группы: 1-я группа -инфицированные лапы хранились в сухом виде, 2-я группа -хранились в физрастворе, 3-я группа - хранились в 40% растворе глицерина. По окончании хранения ткань размораживали, гото-
* НИИ по изучению лепры, 414057,г. Астрахань, пр. Н. Островского 3
