CC BY
32
УДК 616-002.73+576.8.097 © О.С. Рылова, О.В. Дегтярев, 2011
О.С. Рылова1, О.В. Дегтярев1,2 СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ЛЕПРОЗНОЙ УЗЛОВАТОЙ ЭРИТЕМЫ
1ФГУ «НИИ по изучению лепры» Минздравсоцразвития России, г. Астрахань 2ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России
В работе приведены результаты собственных исследований, изучен антительный ответ к различным антигенным детерминантам M. leprae в сыворотке крови больных лепрой с развитием лепрозной узловатой эритемы. Под наблюдением находились 33 больных лепрой в активной стадии болезни, впервые выявленные или леченые не более 2-х лет. Среди них -27 больных с многобактериальными и 6 больных с малобактериальными формами заболевания. У 6 из 27 больных с многобактериальной формой лепры в процессе лечения наблюдалось обострение заболевания по типу лепрозной узловатой эритемы.
Ключевые слова: больные лепрой, лепрознаяузловатая эритема, DiS-BSA, УЗДM. leprae, УЗДM.lufu
O.S. Ryilova, O.V. Degtyaryev SEROLOGIC DIAGNOSTICS OF LEPROSY NODULAR ERYTHEMA
The article deals with the results of investigations of antybodies response to different antygenous determinants of M.leprae to blood serum in leprosy patients with different leprosy nodular erythema. 33 patients were examined in active step of disease, firstly discovered or treated not more than 2 years. Among them there were 27 patients with multibacterial and 6 patients with less bacterial forms of disease. 6 from 27 patients with multibacterial form of lepra in the process of treatment had the acuteness of disease in type of leprosy nodular erythema.
Key words: leprosy patients, leprosy nodular erythema, DiS-BSA, UZD M. leprae, UZD M. lufu.
Лепра - хроническое инфекционное гранулематозное заболевание, вызываемое Мycobacterium leprae, характеризующееся длительным инкубационным периодом, разнообразными клиническими проявлениями, склонностью к развитию лепрозных реакций, поражающее преимущественно кожные покровы, слизистые оболочки верхних дыхательных путей, периферическую нервную систему и внутренние органы [6].
M. leprae - многокомпонентная антигенная система, способная к поликлональной активации В-клеток. В активной стадии лепрозного процесса в сыворотке крови появляются антитела к различным антигенным детерминантам. Потенциально антитела к M. leprae ценны как маркеры M. leprae в организме, и тесты, основанные на их детекции, могут быть использованы для поиска инфицированных среди контактных по лепре лиц и жителей эндемичных районов, а также для контроля за проводимой химиотерапией [5].
Лепрозная узловатая эритема (ЛУЭ), или реакция 2-го типа, является серьезным осложнением лепроматозной и погранично-лепроматозной формы лепры. До внедрения эффективных методов лечения лепры считалось, что реакции 2-го типа являются относительно редкими осложнениями течения инфекционного процесса. После применения комбинированной терапии случаи ЛУЭ стали регистрироваться значительно чаще, примерно у 50% больных лепроматозной и у 25% больных погранично-лепроматозной формами лепры [5].
Целью исследования явилось изучение антительного ответа к различным антигенным детерминантам М. leprae в сыворотке крови больных лепрой с развитием лепрозной узловатой эритемы.
Материалы и методы:
Под наблюдением находились 33 больных лепрой в активной стадии болезни, впервые выявленные или леченые не более 2-х лет. Среди них - 27 больных с многобактериальными (МВ) и 6 больных с малобактериальными (РВ) формами заболевания.
В качестве контроля использовали сыворотку от 100 здоровых доноров, любезно предоставленных станцией переливания крови г. Астрахани.
Больные лепрой в активной стадии заболевания получали комбинированную химиотерапию согласно схемам, рекомендованным ВОЗ.
У 6 из 27 больных с МВ формой лепры в процессе лечения наблюдалась ЛУЭ.
Для определения в сыворотках крови антител к М. leprae в качестве тест-антигенов использовали:
1. УЗД (ультрозвуковой дезинтеграт) M. leprae - озвученный нативный препарат из М. leprae, пассируемый на экспериментальных животных и выделенный из инфицированных тканей. Очистка включала дифференциальное центрифугирование тканевых гомогенатов в градиенте плотности сахарозы [4]. Разделение М. leprae тканевых частиц проводили в двухфазной полимеразной системе, состоящей из 7% декстрана Т-500 и 5% полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 Дальтон. Очищенную бактериальную массу разрушали ультразвуком на аппарате MSE-100 (Англия) в физиологическом растворе в течение 7 минут при частоте 18 кГц. Эффект разрушения контролировали микроскопически в мазках, окрашенных по Цилю-
Нельсону. В полученном препарате определяли белок по Лоури. Конечная концентрация белка соответствовала 1,5 - 2,0 мг/мл.
2.УЗД М. lufu - нативный препарат из M. lufu, выращенных на среде Левинштейна-Йенсена, разрушенных ультразвуком, первоночально выделенных из почвы в Заире [2]. Полученную культуру трижды отмывали, и также как и предыдущие, подвергали ультразвуковому разрушению. Концентрация белка в препарате соответствовала 1 - 2 мг/мл.
3.DiS-BSA (дисахарид - бычий сывороточный альбумин) - полусинтетический аналог дисахаридной детерминанты ФГЛ-1, специфического антигена M. leprae, конъюгированный с БСА, полученный из банка ВОЗ. Концентрация белка в препарате соответствовала 10 мг/мл.
Для определения антител к М. leprae в сыворотке крови был взят непрямой вариант иммуноферментного анализа для определения антител в сыворотке крови [1].
1. Растворы антигенов готовили на 0,05 М карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,6. Адсорбировали антиген на твердую фазу, в качестве которой использовали поверхность лунок полистиролового планшета фирмы «Corning» (США). В каждую лунку вносили по 0,1 мл раствора в концентрации: УЗД M. leprae и УЗД M. lufu - 5 мкг/мл, DiS-BSA- 2 мкг/мл. Планшеты инкубировали в течение 18 ч: с DiS-BSA при 37°С, с УЗД M. leprae, УЗД M. lufu при 4°С. После этого планшет трижды промывали забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,05% твина-20.
2. В лунки планшета заливали по 0,1 мл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина в 0,02 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (рН 7,4), выдерживали 1 ч при 37°С для блокирования свободных поверхностей полистирола. Планшет отмывали, как указывалось выше.
3. Наслаивали исследуемые образцы сывороток, предварительно титрованных в ФСБ-твин-20 (рН 7,3) с 10% сывороткой крупного рогатого скота (КРС) в скрининг-титре 1:400 - для УЗД М. 1ергае, УЗД М. lufu и 1:200 - для DiS-BSA. Положительным контролем служили сыворотки больных с активной лепрой, отрицательным - донорские сыворотки в тех же разведениях. Планшет инкубировали при 37°С в течение 1 ч, затем отмывали.
4. В каждую лунку вносили по 0,1 мл конъюгата (антитела диагностические к иммуноглобулинам человека, меченные пероксидазой хрена производства НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. Н.Ф. Гамалеи) в рабочем разведении 1:1000 на ФСБ-твин. Инкубировали при 37°С в течение 1 ч, затем вновь отмывали, как указывалось выше.
5. Проявление ферментативной фазы реакции проводили субстратно-буферной смесью, содержащей 2 мкл 30% перекиси водорода и 4 мг ортофенилендиамина гидрохлорида на 10 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,5. Инкубировали при 25°С в течение 30 мин в темноте. Останавливали ферментативную реакцию, внося в каждую лунку по 0,05 мл 2,5 Н серной кислоты.
Величину оптического сигнала определяли на фотометре Униплан (фирма «Пикон», Россия) при длине волны 492 нм.
Статистическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере по программам «STATGRAPHICS» и «EXCEL-97». Достоверность полученных данных оценивали с помощью критерия Стьюдента.
Результаты и их обсуждение.
В ИФА для определения фоновых показателей оптической плотности уровня антител и критерия серопозитивности нами исследованы сыворотки крови 100 здоровых доноров, не имевших контакта с больными лепрой (табл.1).
Таблица 1
Величины оптического сигнала (в ед. ОП) в ИФА у здоровых доноров
Антиген Интервалы колебаний М±м
DiS-BSA 0-0,15 0,06±0,001
УЗД M. leprae 0-0,20 0,1±0,006
УЗД M. lufu 0-0,30 0,14±0,008
Больные с малобактериальными формами лепры (6 человек) не имели высоких показателей уровня антител к УЗД M. leprae, УЗД M. lufu и DiS-BSA, колебания оптической плотности в ИФА у этой группы составляли от 0,15 до 0,25 для антигена DiS-BSA, от 0,20 до 0,30 для УЗД M. leprae и от 0,15 до 0,35 для УЗД M. lufu. Суммарный уровень серопозитивности у данной группы больных был обусловлен наличием антител в сыворотке крови больных к одному или нескольким используемым тест-антигенам. В этой группе больных она составила 13,3 % в основном за счет антител к перекрестно реагирующим антигенам M. leprae.
У больных с многобактериальными формами лепры (27 человек) до начала лечения отмечен высокий уровень антител ко всем тест-антигенам в сравнении со здоровыми донорами. Показатели оптической плотности для антигена DiS-BSA соответствовали от 0,50 до 1,20, для УЗД M. leprae от 0,35 до 0,80 и для УЗД M. lufu от 0,45 до 1,35. Детекция антител к отдельным антигенам была следующей: к DiS-BSA антитела
обнаружены у 94 %, к УЗД M. leprae у 88%, к УЗД M. lufu у 72%. Суммарная серопозитивность достигала 97%.
Проводимая химиотерапия влияла на изучаемые нами показатели. Так, в процессе лечения от 6 месяцев до 3-х лет у больных с МВ формами лепры отмечено снижение уровня антител к M. leprae. Полученные нами данные свидетельствуют, что уже после одного года проведенной химиотерапии отмечается существенное снижение уровня антител, причем положительные результаты определения антител к концу 3-го года отмечаются только у 3% больных на антиген DiS-BSA, у 32% больных на антиген УЗД M. leprae и у 14% больных на УЗД M. lufu.
У 6 из 27 больных с МВ формой лепры в процессе лечения наблюдалось обострение заболевания по типу лепрозной узловатой эритемы. Механизм реакции зависел от выброса в кровь огромного количества микобактериальных антигенов вследствие разрушения M. leprae под действием антибактериальных препаратов. У 3-х пациентов клинические проявления реактивного состояния протекали в очень легкой форме и характеризовались обилием внезапно появляющихся овальных или круглых эритематозных пятен, без общих расстройств в течение 2-3 дней. У 2-х больных ЛУЭ протекала в течение 1-2 недель с расстройством общего состояния и локализацией высыпаний на коже лица, верхних и нижних конечностей в виде узелков ярко-красного цвета, мягкой консистенции, размером от 0,2 до 0,5 см. Расположение их симметричное, продолжительность их существования от трех дней до нескольких недель.
Продолжительное реактивное состояние наблюдалось у одного пациента в течение 1 -2 месяцев, когда беспрерывно за одним острым эпизодом следовал другой. Клинические проявления ЛУЭ при этом характеризовались формированием пузырьков, язвочек.
Таблица 2
Показатели оптической плотности в ИФА у больных с ЛУЭ
Степени тяжести ЛУЭ Кол- во больн ых Показатели оптической плотности (к исследуемым тест-антигенам)
УЗД M. leprae УЗД М. lufu DiS-BSA
Интервалы колебаний М±м Интервалы колебаний М±м Интервалы колебаний М±м
Легкая 3 1,15-0,95 1,07±0,06 1,35-1,05 1,22±0,09 1,05-0,87 0,94±0,05
Средняя 2 0,62-0,38 0,47±0,08 0,75-0,42 0,57±0,09 0,48-0,20 0,34±0,08
Тяжелая 1 0,20-0,15 0,18±0,01 0,51-0,30 0,41±0,06 0,30-0,19 0,25±0,03
Как видно из таблицы 2, при легкой степени течения ЛУЭ уровень исследуемых тест-антигенов колебался от 1,05-1,15. Пациенты со средней степенью тяжести имеют показатели, не превышающие 0,75. У пациента с тяжелой формой ЛУЭ отмечается резкое снижение уровня антител - от 0,15-0,51.
После того как фаза обострения и клинические признаки ЛУЭ на коже регрессировали, уровень антител к тест-антигенам вновь возрастал (рис. 1). Показатели оптической плотности в стадии регресса данной реакции составляли: для DiS-BSA от 0,41-0,45, для УЗД M. leprae от 0,35-0,42, для УЗД M. lufu от 0,67 до 0,78. Необходимо отметить, что уровень антител к исследуемым тест-антигенам в стадии регресса ЛУЭ возрастал у всех пациентов примерно за одинаковые промежутки времени - от 2-х недель до 1,5 месяцев. У пациентов без проявления ЛУЭ уровень антител к видоспецифическим антигенам M. leprae оставался высоким и снижался на фоне проводимой специфической химиотерапии по мере элиминации возбудителя.
1,6 1,4 1,2 1
0,8 0,6 0,4 0,2
M.leprae
М.1и&
DiS-BSA
средняя
стадия регресса ЛУЭ
Рис. 1. Динамика уровня антител к М. leprae у больных с лепроматозным типом лепры с явлениями лепрозной узловатой эритемы (на оси ординат - показатели оптической плотности Х-490Нм, на оси абсцисс -
степень тяжести развития лепрозной узловатой эритемы)
Обобщая вышеизложенное, можно заключить, что реакция, протекающая по типу ЛУЭ, как правило, наблюдается после начала лечения, когда разрушение возбудителя приводит к образованию в крови большого количества антигенов М.1ергае и формированию иммунных комплексов антиген-антитело. В связи с этим уровни антител к исследуемым тест-антигенам в данный период снижаются. Полученные нами данные согласуются с наблюдениями А. Andreoli с соавторами(1985), которые изучали антительный ответ у больных лепрой с проявлениями ЛУЭ. Они также пришли к выводу, что комплексное использование тестов по определению уровня антител к DiS-BSA, УЗД M. leprae, УЗД M. lufu позволяет предупредить развитие данного обострения, при котором кожные проявления являются наиболее общим, но не самым значительным симптомом при этой реакции [3].
Таким образом, ЛУЭ является наиболее серьезным аутоиммунным осложнением у многобактериальных больных, возникающим на поздних сроках заболевания, т. е. через несколько лет от начала лечения, а обнаружение антител в сыворотке крови больных лепрой с проявлениями лепрозной узловатой эритемы дает объективную информацию о течении лепрозного процесса и позволяет обеспечить адекватный серологический контроль за проводимой терапией и повторным развитием лепрозных обострений.
0
ЛИТЕРАТУРА
1. Воллер А., Бидуэлл Д., Бартлет А. Иммуноферментативные реакции в диагностической медицине. // Бюл ВОЗ. - 1977. - Т. 53, № 1.-С. 38-48.
2. Калянина О.В., Юшин М.Ю., Дячина М.Н. [и др.]. Сравнительная культурально-биохимическая и иммунохимическая идентификация лабораторных штаммов культивируемых микобактерий из лепрозных поражений больных и почвы // Пробл. Туб. - 2000. - № 5. - С. 49-52.
3. Andreoli A., Brett S.J., Draper P. [et al.]. Ganges in circulating antibody levels to the maior phenolic glycolipid during erythema nodosum leprosum in leprosy patients // Int. J.Lepr. - 1985. - Vol. 53. -P. 211-217.
4. Draper P. Cell walls of Micobacterium leprae // Int. J. Lepr. - 1981. - Vol. 49. - P. 57-59.
5. Ilangumaran S., Shankernarayan N., Ramu G. [et al.]. Clinical features and diagnosis of relapses in leprosy // Ibid. - 1994. - Vol. 62. - P. 245-255.
6. Scollard D.M., Adams L.B., Gillis T.P. [et al.]. The continuing challenges of leprosy. // Clin. Microbiol. Rev. - 2006. - Vol. 19 - Р. 338-381.
Рылова Ольга Сергеевна, аспирант ФГУ «НИИ по изучению лепры» Минздравсоцразвития России, Россия 414000, г. Астрахань, проезд Н. Островского, 3, тел. (8512) 33-13-22, e-mail: [email protected]
Дегтярев Олег Владимирович, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник ФГУ «НИИ по изучению лепры» Минздравсоцразвития России, доцент кафедры дерматовенерологии ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, Россия,414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121, тел. (8512) 52-51-
33,
e-mail: [email protected]
