CC BY
32
сивность отложений значительно снижалась. На ультратонких срезах микобактерий активность ДОФА-оксидазы маркировалась отложениями фермент-субстратных комплексов (ФСК), выявляющих место локализации фермента. У М. leprae активность ДОФА-оксидазы проявлялась в виде усиления электронной плотности плазматической мембраны и мезосом. В цитоплазме бактериальных клеток определялись отложения ФСК, представляющих собой электронно-плотные гранулы размером 10-50 нм. Наблюдалась также повышенная электронно-оптическая плотность округлых образований, так называемых «гомогенных телец», природа которых остается неясной (рис. 4 а, б).
П SA
а - б
Рис. 4. Локализация активности ДОФА-оксидазы, маркирующаяся отложениями ФСК, (стрелки), а - в области плазматической мембраны (ПМ), мезосом (М), цитоплазмы (Ц), б - в области «гомогенных телец» (ГТ)
M. leprae (без дополнительного контрастирования, х50000)
На ультратонких срезах М. «lufu» маркеры активности ДОФА-оксидазы в виде ФСК размером 10-50 нм обнаруживались чаще в цитоплазме бактериальных клеток около плазматической мембраны. Наблюдалось также усиление электронной плотности «гомогенных телец», что является доказательством локализации ДОФА-оксидазы в этих включениях (рис. 5).
Рис. 5. Локализация активности ДОФА-оксидазы, маркирующаяся отложениями ФСК, (стрелки) в цитоплазме и «гомогенных тельцах» (ГТ)
M. «lufu» (без дополнительного контрастирования, х50000)
У M. tuberculosis активность ДОФА-оксидазы не наблюдалась. В контрольных препаратах маркеры активности ДОФА-оксидазы - отложения ФСК в мембранных структурах, цитоплазме и «гомогенных тельцах» изучаемых микобактерий не выявлялись. Методом контрастирования рутениевым красным у М. leprae, М. «lufu» и М. tuberculosis H37Rv обнаружена микрокапсула, которая, являясь наружным структурным элементом бактериальной клетки, не только препятствует перевариванию микобактерий фагоцитами, но также, по нашему мнению, способствует выживанию этих микобактерий в неблагоприятных условиях внешней среды, в том числе и вне организма хозяина. Сравнительное электронно-цитохимическое изучение выявило активность ДОФА-оксидазы у М. leprae и М. «lufu», а у М. tuberculosis активность этого фермента отсутствовала. Маркеры активности ДОФА-оксидазы обнаружены на мембранных структурах, а также в цитоплазме и «гомогенных тельцах» М. leprae и M. «lufu», что говорит о сходстве метаболических процессов, происходящих в этих микобактериях, о необходимости использования в процессе жизнедеятельности фенольных соединений.
Выводы. По наличию микрокапсулы, ДОФА-оксидазной активности, а также локализации маркеров активности этого фермента в структурах бактериальных клеток между М. leprae и М. «lufu» обнаружено сходство, что, наряду с выявленным в [2] сходством ряда морфологических и антигенных параметров, является доказательством общности биологических свойств этих микобактерий и позволяет рекомендовать культуру М. «lufu» для дальнейшего изучения и использования в лепрологии.
Литература
1.ГайерГ. Электронная гистохимия.- М.: Мир 1974.
2.Калянина О. В. и др. // Пробл. туберкулеза.- 2000.- N° 5.— С. 49—52.
3.Маслов А. К. Ультрацитохимические особенности микобактерий при лепроматозном типе лепры и характер взаимоотношений возбудителя с клетками организма больного при рецидивах заболевания: Автореф. дис... канд. мед. наук.— М., 1982.
4.Маслов А.К., Дячина М.Н. // Ж. микробиол.— 1996.— № 1.— С. 84—87.
5.Пат. № 2124730 Россия. Способ диагностики лепры / Юшин М. Ю. и др.// Изобретения.— 1999.— № 1.
6.Пат. №213519 Россия. Способ иммунопрофилактики экспериментальной лепрозной инфекции / Юшин М. Ю., Каляни-на О. В. // Изобретения.— 1999.— № 24.
7.Пат. № 2171689 Россия. Способ диагностики лепры / Дячина М. Н., Юшин М. Ю., Ющенко А. А., Бочановский В. А. // Изобретения.— 2001.— № 22.
S.Luft J. H. // Feder. Proc.— 1966.— Vol. 25.— P. 1773—1783.
9.Portaels F.//Ann Soc Belge Med Trop.—1980.— Vol.60.— P. 381—386.
10.Prabhakaran K. // Int J Lepr.— 1967.— № 1.— P. 42—51.
11.PrabhakaranK. // Int J Lepr.— 1973.— Vol.41, №1.— P. 121.
12.Prabhakaran K. //LeprosyRev.—1973.— Vol.44, №3.— P. 112.
13.Seydel J. K. Wempe E. C. // Int. J. Lepr.— 1982.— Vol. 50,
№1.— P. 20—30.
УДК 616-002.73.576.852.213
ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТОВ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ ИНФИЦИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ МЫШЕЙ НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ MYCOBACTERIUM LEPRAE
В.В. АНОХИНА, А.К. АЮПОВА, М.Ю. ЮШИН, Н.Г. УРЛЯПОВА,
О.В. КАЛЯНИНА *
М. leprae не культивируются in vitro, поэтому единственным способом оценки их жизнеспособности является использование экспериментальной модели лепрозной инфекции на лабораторных животных. В настоящее время общепринятой моделью, применяемой в лепрологии не только для оценки жизнеспособности М. leprae, но и для скрининга противолепрозных препаратов, а также изучения протективности потенциальных противоле-прозных вакцин, является интраплантарная модель, разработанная С.С. Shepard в 1960 году [5]. Данная модель предусматривает заражение иммунологически интактных мышей в подушечку лапы дозированным количеством М. leprae, с последующим локальным их размножением в месте инокуляции. Через 6-9-12 месяцев после заражения число М. leprae в инфицированной лапе подсчитывается и сравнивается с числом введенных в момент заражения, при этом размножение М. leprae в подушечке лапы мыши служит основным критерием их жизнеспособности. Рядом исследователей предпринимались попытки изучить выживание М. leprae при длительном хранении в инфицированных тканях in vitro. В частности Prabhakaran et al. [4] показали, что М. leprae сохраняют жизнеспособность при хранении в инфицированных тканях девятипоясных броненосцев при температуре -80° С в течение 19 месяцев. А.А. Ющенко [1], А.А. Ющенко и Н.Г. Урляпова [2] отмечали, что М. leprae остаются жизнеспособными при длительном хранении кожных лепром, полученных от больных лепроматозной лепрой людей, в 40% растворе глицерина при температуре от +4° С до +22° С.
Цель исследования - изучение влияния различных вариантов длительного хранения инфицированных тканей мышей при температуре -18° С на жизнеспособность М. leprae.
Материалы и методы. Исследование проведено на 183 мышах линии СВА и ВАLВ/С, массой 18-20 г. Материалом для изучения служили 19 различных штаммов М. leprae, пассируемых на мышах (от 3-го до 9-го пассажей), первоначально выделенных в НИИ по изучению лепры от 7 больных лепроматозной лепрой людей. Лапы мышей, инфицированные М. leprae, помещали в стерильные пластиковые контейнеры (бакпечатки одноразового применения) и хранили при температуре -18° С от 3 до 24 месяцев. Материал для хранения разделен на три группы: 1-я группа -инфицированные лапы хранились в сухом виде, 2-я группа -хранились в физрастворе, 3-я группа - хранились в 40% растворе глицерина. По окончании хранения ткань размораживали, гото-
* НИИ по изучению лепры, 414057,г. Астрахань, пр. Н. Островского 3
вили суспензию и заражали животных интраплантарно дозированным количеством 1х104 М. leprae на мышь. М. leprae, выделенными из сухих лап, были заражены 120 мышей (первая группа), М. leprae, выделенными из лап, хранившихся в физрастворе, заражены 25 мышей (2-я группа), М. leprae, выделенными из лап, хранившихся в 40% растворе глицерина, заражены 38 мышей (3-я группа). Через 3-5-7-8-12 месяцев после заражения животных забивали и подсчитывали количество М. leprae в подушечке лапы мыши по методу C.C. Shepard - McRae [6]. Достоверным считается размножение, при котором в месте инокуляции имеется >1х105М. leprae, т. е. количество размножившихся микобактерий должно быть в 10 раз больше инокулированного. Заражение проводили в разные сезоны года (зима, весна, лето, осень).
Результаты. Из 120 мышей первой группы у 17 (14,2%) М. leprae в месте инокуляции не обнаруживались, при этом у 5 животных М. leprae в подушечках лап отсутствовали в ранние сроки - до 3-х месяцев с момента заражения, что характерно для интраплантарной модели Shepard [3], следовательно, истинное отсутствие размножения М. leprae отмечено только у 12 мышей (10,4%) из 115 животных, оставшихся в эксперименте на поздних сроках. Из 115 мышей локальное размножение М. leprae было у 103 (89,6%). Через 3 месяца после заражения размножение М. leprae отмечалось у 50% животных, а их среднее количество в лапах составляло 5,2х106. Через 4-7 месяцев размножение М. leprae наблюдалось у 81,3% животных при ср. количестве в месте инокуляции 5,9х108. Через 8-12 месяцев размножение М. leprae выявлялось у 96,7% животных при среднем количестве в лапах 5,0х107. Средняя кратность увеличения М. leprae по сравнению с инокулированным количеством составляла 2-4 порядка.
Из 25 мышей 2-й группы у 13 (52%) М. leprae в подушечках лап не было, в сроки до 3-х месяцев М. leprae отсутствовали у всех особей (32%), на поздних сроках отсутствие размножения -у 5 мышей (29,4%). Размножение M. leprae в подушечках лап наблюдалось у 12 животных (70,6%) из 17 оставшихся на поздних сроках. Через 5-7 месяцев размножение М. leprae отмечено у 37,5% мышей при ср. количестве в месте инокуляции 1,7х105. Через 8-12 месяцев размножение М. leprae выявлялось у 100% животных при ср. количестве в лапах 9,9х106. В этой группе кратность роста М. leprae составляла один-два порядка.
Из 38 мышей 3-й группы у 6 (15,8%) М. leprae в месте инокуляции не обнаруживались. На поздних сроках после заражения размножение М. leprae наблюдалось у 32 мышей (84,2%). Через 3 месяца после заражения размножение М. leprae имелось у всех особей при ср. количестве в лапах 2,8х105. Через 5-7 месяцев выявлялось у 83,3% животных, а их ср. количество составляло 4,2 х105. Через 8-12 месяцев размножение М. leprae в месте инокуляции наблюдалось у 87,0% животных при ср. количестве в лапах 4,1х105. ТВ 3-й группе кратность увеличения М. leprae в подушечках лап - один-два порядка.
Выводы. Показано, что М. leprae при длительном хранении в лапах мышей - от 3 до 24 месяцев при температуре -18° С в сухом виде, в физиологическом растворе и в 40% растворе глицерина остаются жизнеспособными и при интраплантарном заражении мышей по методу Shepard дают рост в месте инокуляции, увеличивая «урожай» по сравнению с введенным количеством на один-четыре порядка через 5-12 месяцев от момента заражения. Сравнительно благоприятными условиями для выживания М. leprae является хранение при температуре -18° C в сухих лапах, наименее благоприятными - хранение при температуре -18° C в физрастворе, о чем говорит низкий % животных, у которых развилась локальная инфекция, задержка размножения М. leprae в лапах мышей 2-й группы. Показана способность М. leprae выживать при длительном хранении в инфицированных тканях мышей при температуре -18° С, что имеет эпидемиологическое значение, а также в условиях отсутствия культуры возбудителя лепры in vitro дает возможность стандартизировать материал, используемый для заражения в опытных исследованиях при лепре.
Литература
1.Ющенко А.А. // Актуальные вопросы лепрологии.- Астрахань, 1984.- С. 3-7.
2.Ющенко А.А., Урляпова Н.Г. // Актуальные вопросы. дерматовенерологии.- Алма-Ата, 1986.- С. 112-114.
3.Levy L. // Int. J. Lepr.- 1987.- Vol. 55, № 4.- P. 814-818.
4.Prabhakaran K. et al.//Microb Letters.- 1976.-Vol.1.- P. 193.
5.Shepard C.C. // J. Exp. Med.- 196G.- Vol. 112.- P. 44З-4З4.
6.Shepard C., McRae D.// Int J Lepr.- 1968.- Vol.36.- P.78-82.
УДК 616-091.8
МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПЕЧЕНИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПНЕВМОНИИ, ПРОТЕКАЮЩЕЙ НА ФОНЕ ГОРМОНАЛЬНОГО ДИСБАЛАНСА
Л.В. ВОХМИНЦЕВА, А.П. НАДЕЕВ*
Печень занимает особое место в развитии любой воспалительной реакции, т.к. является органом, обеспечивающим гомеостатические реакции организма и выполнение одной из функций - иммунитета. Наличие в печени 90% элементов ретикулоэндоте-лиальной системы, и большей части мононуклеарных фагоцитов, обусловливает роль печени как органа неспецифической резистентности [2]. Механизмы, лежащие в основе патогенеза повреждения печени при заболеваниях органов дыхания, остаются малоизученными. Нейроэндокринная система, модулирующая иммунный ответ при воспалительных заболеваниях, влияет и на функционирование печени при воспалении.
Цель работы - изучение структурно-функционального состояния печени у крыс с экспериментальной пневмонией в условиях нарушенного гормонального состояния.
Работа выполнена на крысах-самцах линии Вистар массой 200-220 г, полученных из вивария ЦНИЛ Новосибирского ГМУ. Животные имели обычный полноценный общевиварный рацион и воду ad libitum. Крысам 1-й группы (n=12) моделировали пневмонию интратрахеальным введением с помощью специального зонда под эфирным наркозом суспензии сефадекса А-25 («Pharmacia Uppsala», Швеция) в дозе 0,5 мг/100 г (диаметр гранул 40100 мкм), приготовленной на тёплом физиологическом растворе [5]. 2-й группе животных (n=12) вводили сефадекс А-25 на фоне гормонального дисбаланса [4], который моделировали введением гидрокортизона (0,3*10-9 М/100 г) и адреналина (0,6*10-6М/100 г) в течение 3 дней через неделю после введения аллоксана (120 мкг/100 г массы тела); сефадекс вводили на следующий день после приёма гормонов. Крыс декапитировали на 2, 10 и 20 сутки после заключительного воздействия. Процедуры выполняли по Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Контроль составили интактные животные (n=16) того же возраста, находившихся на общевиварном рационе.
Для гистологического анализа кусочки легкого и печени фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, заливали парафином. Гистологические срезы толщиной 5-6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином [3]. В сыворотке крови изучали активность внутриклеточных ферментов печени - аланинами-нотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) колориметрическим динитрофенилгидразиновым методом с применением наборов реагентов «ТРАНСАМИНАЗА-АЛТ-НОВО» и «ТРАНСАМИНАЗА-АСТ-НОВО» (ЗАО «Вектор-Бест»), активность аминотрансфераз выражали в Е/л.
В основе метода определения уровня общего билирубина лежит реакция билирубина с диазотированной сульфаниловой кислотой в присутствии кофеин-бензоата натрия. Для определения общего билирубина применяли набор реагентов «БИЛИРУ-БИН-НОВО» (ЗАО «Вектор-Бест»). Концентрацию общего билирубина выражали в мкмоль/л.
Общий белок сыворотки крови определяли биуретовым методом с помощью реагентов «ПРОТЕИН-НОВО» (ЗАО «Вектор-Бест»), концентрацию выражали в г/л. При введении в трахею сефадекса А-25 на 2 сутки опыта в лёгких отмечали: полнокровие, очаги микрокровоизлияний, вокруг бронхов и сосудов крупного и среднего калибра имелись лимфомакрофагальные инфильтраты с примесью нейтрофилов и эозинофилов (рис.1).
Наблюдали диффузное утолщение межальвеолярных перегородок за счёт их инфильтрации макрофагами и лимфоцитами с наличием нейтрофилов, выявляли очаги эмфиземы (рис.2). В просвете крупных бронхов воспалительный инфильтрат был представлен преимущественно нейтрофилами. На 10 день эксперимента в лёгких сохранялись полнокровие и очаги микрокрово-
* Новосибирский ГМУ, 69GG91, г. Новосибирск, Красный проспект, З2
