CC BY
20
МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ «ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ» 85
основными полимерами для создания биополимерной композиции были выбраны альгинат натрия и смесь аль-гинат натрия/гиалуронат натрия в соотношении 70/30. Дополнительно в качестве антимикробного агента в полимерную матрицу были введены частицы наносеребра, полученные микробиологическим способом. Далее было проведено экспериментальное изучение регенераторных возможностей разработанных полимерных матриц различного состава.
результаты. На основании анализа результатов па-тологогистологического исследования мягких тканей однотипно сформированных обширных дефектов, независимо от длительности течения раневого процесса, при применении биополимерных композиций, разработанных на основе альгината натрия (альгинат, альгинат с серебром, смесь альгината и натриевой соли гиалуроновой кислоты) были получены морфологические признаки стимулированной репаративной регенерации в области дефекта мягких тканей. При сравнении выраженности стимулирующего действия биополимерных композиций на регенеративные процессы в мягких тканях преимущество наблюдалось при объемном замещении приобретенного дефекта альгината натрия с модифицированным серебром. Далее в порядке убывания — альгинатом, альгинатом в сочетании с солью гиалуроновой кислоты. Отсутствие морфологических признаков наличия рассматриваемых биополимеров в тканях к 14-м суткам после помещения в зону мягкотканного дефекта подтвердило целесообразность и эффективность применения гидрогелевой структурной формы и способность использованных биополисахаридов к биодеградации, обеспечивая полную безопасность данного материала. Было установлено, что при хронизации раневого процесса активизация регенераторных возможностей мягких тканей в зоне мягкотканного дефекта замедлена. Применение биополимерной композиции с инкорпорированными ионами серебра, обладающими антибактериальной активностью, снижает уровень инфицирования раны и синергично активизирует репаративный процесс.
Заключение. Структурные биополисахариды обладают свойствами, принципиально отличающими их от других классов биополимеров: высокая биосовместимость с тканями, управляемая биодеградация и биорезорбция, структурная комбинаторность, управляемая функциональная композиционная синергия. Сочетая эти характеристики возможно создание управляемых многокомпонентных биокомпозиций, создающих в ране условия, активизирующие процессы регенерации, с последующим неинвазивным объемным восполнением дефекта развившейся аутотка-нью, таким образом, избегая развития иммунологического отторжения.
Работа выполнена в рамках гранта РФФИ № 15-29-04847.
А.И. Щербаков1, А.С. Гриневич1, Е.Н. Кособокова1, М.В. Пинюгина1, Е.В. Шешукова2, В.С. Косоруков1
сравнение антигенных ЭПитоПов HER2 моноклональных антител трастузумаба и фитотрастузумаба
ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва, Россия;
2НИИФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
введение. Моноклональные антитела в случае взаимодействия с большими молекулами класса белков связываются не со всей молекулой, а с отдельным ее участками, имеющими размер от нескольких до десятков аминокислот. Рецептор HER2 является важной мишенью противоопухолевой терапии при лечении рака молочной железы (РМЖ). Положение эпитопа на поверхности молекулы HER2, с которым связывается моноклонально антитело, может значительно влиять на его биологический эффект. В настоящее время в клинической практике применяют препарат на основе анти-НЕЯ2 моноклональных антител — трастузумаб. В случае трастузумаба эпитопом является участок IV субдомена внеклеточного домена HER2. Использование трастузумаба снижает риск развития отдаленных метастазов и увеличивает выживаемость пациентов. Трастузумаб производится в культуре животных клеток и стоит достаточно дорого. Альтернативой может быть получение рекомбинантных терапевтических антител в растениях методом транзиторной экспрессии.
Цель исследования — сравнение специфического связывания с антигеном HER2 и с IV субдоменом рецептора HER2 рекомбинантных антител, полученных классическим способом в культуре клеток и полученных в растительной биомассе.
Материалы и методы. Фитоантитела получали в листовой пластине Nicotiana benthamiana методом транзиторной экспрессии. Для внедрения вирусных векторов в клетки листьев Nicotiana benthamiana применяли метод агроинфек-ции. Инфицирование осуществляли культурами клеток штамма A. tumefaciens GV-3101, которые были предварительно трансформированы конструкциями VTM-PT-HC и PVX-PT-LC. Эти конструкции обеспечивали экспрессию тяжелых и легких цепей рекомбинантного анти-НЕК2-ан-титела в клетках листа растения. Собранные листья гомогенизировали и подвергали экстракции. Экстракт фильтровали и очищали хроматографическими методами. Контроль и оценка уровня экспрессии анти-НЕК2-фито-антител осуществлялся с помощью метода электрофореза в ПААГ и ИФА. При исследовании связывания с рецептором полученных анти-НЕК2-фитоантител использовали метод проточной цитометрии. Работу проводили с HER2-положительными клетками РМЖ SK-BR-3. Специфичность связывания тестировали с помощью кроличьих антител против антител человека, конъюгированных с пероксидазой хрена. Для анализа связывания полученных анти-HER2-фитоантител с IV субдоменом внеклеточного домена рецептора HER2 была применена методика анализа конкурентного связывания с антигеном HER2 на поверхности клеток между анти-HER2-фитоантителами и трастузумабом. Эксперимент осуществляли методом
86
МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ «ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ»
проточной цитометрии с использованием клеток, гипер-экспрессирующих антиген HER2 — SK-BR-3. Оценивалось связывание меченых анти-HER2-антител с клетками SK-BR-3, предварительно обработанных анти-HER2-фи-тоантителами или трастузумабом.
результаты и заключение. В данной работе нами показано, что антитела, экспрессированные в Nicotiana bentha-miana, не уступают аналогам, полученным из клеток млекопитающих, в связывании антигена HER2 на поверхности мембран клеток SK-BR-3. Полученные нами анти-НЕК2-фитоантитела ингибируют связывание трастузума-ба с эпитопом IV субдомена рецептора HER2, как тра-стузумаб ингибирует связывание фитоантител. Обобщая данные проведенных экспериментов, можно сделать вывод о том, что полученные анти-НЕК2-фитоантитела связывают тот же эпитоп, что и трастузумаб.
А.И. Щербаков1, Е.Н. Кособокова1, М.В. Пинюгина1, Е.В. Шешукова2, В.С. Косоруков1
аффинные свойства AHTИ-HER2-AHTИTEЛ, полученных из растительного источника
ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва, Россия;
2НИИФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
введение. Рецептор HER2 является важной мишенью противоопухолевой терапии при лечении рака молочной железы (РМЖ). В настоящее время в клинической практике применяют препарат на основе анти-НЕК2-монокло-нальных антител — трастузумаб. Использование тра-стузумаба снижает риск развития отдаленных метастазов и увеличивает выживаемость пациентов. Трастузумаб производится в культуре животных клеток и стоит достаточно дорого. Альтернативой может быть получение рекомби-нантных лекарственных препаратов, в частности терапевтических антител, в растениях методом транзиторной экспрессии.
Цель исследования. Сравнение специфического связывания с антигеном HER2 и с IV субдоменом рецептора НЕК2-рекомбинантных антител, полученных классическим способом в культуре клеток и полученных в растительной биомассе.
материалы и методы. Фитоантитела получали в листовой пластине Nicotiana benthamiana методом транзиторной экспрессии. Для внедрения вирусных векторов в клетки листьев Nicotiana benthamiana применяли методику агро-инфекции. Инфицирование осуществляли культурами клеток штамма A. tumefaciens GV-3101, которые были предварительно трансформированы конструкциями VTM-PT-HC и PVX-PT-LC. Эти конструкции обеспечивали экспрессию тяжелых и легких цепей рекомбинантного анти-НЕК2-антитела в клетках растения. Собранные листья гомогенизировали и подвергали экстракции. Затем экстракт фильтровали и очищали хроматографическими методами. Контроль и оценка уровня экспрессии анти-НЕК2-фитоантител осуществлялись с помощью метода ИФА. Для исследования активности полученных анти-НЕК2-фитоантител использовали иммуноцитохимический тест. Работу проводили с НЕК2-положительными клетками
РМЖ SK-BR-3. Специфичность связывания тестировали с помощью кроличьих антител против антител человека, конъюгированных с пероксидазой хрена. Для оценки биологической активности анти-HER2-фитоантител был использован метод проточной цитофлуориметрии. Оценивалось связывание анти-HER2-антител с клетками SK-BR-3. Для анализа связывания полученных анти-НЕК2-фитоантител с IV субдоменом внеклеточного домена рецептора НЕЯ2 была разработана методика анализа конкурентного связывания с антигеном НЕЯ2 между анти-НЕК2-фитоантителами и трастузумабом. Эксперимент осуществляли методом проточной цитометрии с использованием клеток, гиперэкспрессирующих антиген НЕЯ2, — SK-BR-3. Оценивалось связывание меченых анти-НЕК2-антител с клетками SK-BR-3, обработанными анти-НЕК2-фитоантителами или трастузумабом.
результаты. В данной работе нами показано, что антитела, экспрессированные в Nicotiana benthamiana, не уступают аналогам, полученным из клеток млекопитающих, в связывании антигена НЕЯ2 на поверхности мембран клеток SK-BR-3. Полученные нами анти-НЕК2-фитоан-титела связываются с IV субдоменом рецептора НЕЯ2.
Заключение. Обобщая данные проведенных экспериментов, можно сделать вывод о том, что полученные анти-НЕК2-фитоантитела функционально соответствуют тра-стузумабу.
Т.Г. Щербатюк, Е.С. Плеханова, И.А. Чернигина
оценка повреждения днк лейкоцитов крови после фотодинамической терапии с локальным введением фотосенса
ФГБОУВО НижГМА Минздрава России, Нижний Новгород, Россия
введение. Известно, что генерируемыми продуктами действия фотодинамической терапии (ФДТ) являются активные формы кислорода, в частности синглетный кислород, который обладает цитотоксическим и мутагенным действием, повреждая органеллы клетки и ДНК.
Цель исследования. Оценить уровень повреждений ДНК в лейкоцитах цельной крови организма-опухолено-сителя после ФДТ при локальном введении фотосенсибилизатора.
материалы и методы. Белые нелинейные крысы возрастом 3 мес были разделены на 3 группы: 1) «интактные» — здоровые животные (п = 10), 2) «без воздействия» — живот-ные-опухоленосители с подкожно трансплантированной карциномой почки РА без лечения (п = 10) и 3) «ФДТ» — жи-вотные-опухоленосители, которым проводили фотодинамическое воздействие (п = 10). В 2 последних группах выделили подгруппы с исходными объемами опухоли до 0,3 см3 (А) и >0,5 см3 (В). При ФДТ интратуморально вводили 0,3 % раствор препарата фотосенс (ФГУП «ГНЦ «НИОПИК», Россия) и в течение 6—12 ч после инъекции воздействовали светодиодным лазером (X = 660 ± 10 нм, Р = 100 мВт/см2, плотность энергии 60 Дж/см2). Всего проведено 2 сеанса ФДТ на 15-е и 19-е сутки после перевивки. Противоопухолевый эффект оценивали по коэффициенту абсолютного прироста опухоли (К). Определение спонтанного уровня повреждений ДНК лейкоцитов цельной крови лабораторных животных
