CC BY
25
аффинные свойства affra-her2 антител, полученных из растительного источника
А.и. щербаков1, E.H. Кособокова1, м.В. Пинюгина1, Е.В. Шешукова2, B.C. Косоруков1
ФГБУ«НМИЦонкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24; 2ФГБУНИнститут общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН; Россия, 119991 Москва, ул. Губкина, 3
Контакты: Вячеслав Станиславович Косоруков atgtga@mail.ru
Введение. Рецептор Her2 является важной мишенью противоопухолевой терапии при лечении рака молочной железы. В настоящее время в клинической практике применяют препарат на основе моноклональных антител анти-Нег2 — трастузумаб. Трастузумаб производится в культуре животных клеток и стоит достаточно дорого. Разработана технология продукции рекомбинантных антител в растительном продуценте Nicotiana benthamiana с высоким выходом очищенного белка. Цель исследования — сравнение аффинных свойств рекомбинантных антител, полученных классическим способом в культуре клеток и полученных в растительной биомассе.
Материалы и методы. Рекомбинантные фитоантитела выделяли методом аффинной хроматографии из биомассы растений N. benthamiana, агроинфильтрованных векторными конструкциями. Сравнение аффинных свойств проводили методами иммуноцитохимической окраски клеток, конкурентного связывания нативным эпитопом с анализом методом проточной цитофлуориметрии.
Результаты и заключение. В данной работе нами установлено, что антитела, экспрессированные в N. benthamiana, не уступают аналогам, полученным из клеток млекопитающих, в связывании антигена Her2 на поверхности мембран клеток SK-BR-3. В настоящей работе впервые показано, что полученные фитоантитела анти-Нег2 не отличаются от трастузумаба по специфичному связыванию с антигеном Her2, а также с IVсубдоменом рецептора Her2.
Ключевые слова: рак молочной железы, терапевтические антитела, продукция антител в растениях
DOI: 10.17650/1726-9784-2018-17-1-95-100
AFFINITY PROPERTIES OF PLANT-MADE ANTI-HER2 ANTIBODIES
A.I. Scherbakov1, E.N. Kosobokova1, M. V. Pinyugina1, E. V. Sheshukova2, V.S. Kosorukov1
1N.N.. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478, Russia;
2N.I. Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences; 3 Gubkina St., Moscow 119991, Russia
Introduction. The Her2 receptor is an important target for antitumor therapy in the treatment of breast cancer. Trastuzumab, based on anti-Her2 monoclonal antibodies, is used in clinical practice. Trastuzumab is produced by animal cells culture technology and is quite expensive. We use the technology of production of recombinant antibodies in the plants Nicotiana benthamiana with a high yield of final purified protein.
Objective. The aim of following study is a comparison of monoclonal antibodies received via classic cell culture technology and produced in plant biomass.
Materials and methods. Recombinant plant-made antibodies were isolated by affinity chromatography from the biomass of N. benthamiana plants agroinfiltrated by vector constructs. Comparison of affinity properties was carried out by immunocytochemical staining of cells and competitive binding using flow cytometry analysis.
Results and conclusion. We show that the antibodies expressed in N. benthamiana are equal to those obtained from mammalian cells in binding to Her2 antigen localized on the surface of the SK-BR-3 cells. In the present work it was shown that the plant-made anti-Her2 antibodies do not differ in specific binding with the Her2 antigen, as well as with IV subdomain of the Her2 receptor.
Key words: breast cancer, therapeutic antibodies, plant-made antibodies
Введение
В мире ежегодно регистрируется более 1 млн новых случаев рака молочной железы (РМЖ), а в РФ более 50 тыс., вследствие чего это заболевание по-прежнему является актуальной и серьезной проблемой здравоохранения.
Около 25—30 % случаев РМЖ — это Hetí-поло-жительный РМЖ [1, 2]. Her2 (human epidermal growth factor receptor 2, человеческий рецептор эпидермаль-ного фактора роста 2-го типа) — трансмембранная тирозиновая протеинкиназа ErbB2, молекулярная масса которой составляет 185 кДа. В организме
96 Оригинальные статьи
человека Her2 экспрессируется и в здоровых тканях. сле инкубации растений в течение 4—6 сут листья Для опухолевых клеток РМЖ характерна гиперэкс- собирали и замораживали в жидком азоте. прессия Her2. Повышение уровня Her2 означает Получение и очистка фитоантител анти-Her2. прогрессирование развития опухоли, так как он от- Для внедрения вирусных векторов в клетки листьев вечает за рост опухоли. Также гиперэкспрессия Her2 N. benthamiana применяли методику агроинфекции. вызывает ускоренное метастазирование и устойчи- Инфицирование осуществляли культурами клеток штам-вость к химиопрепаратам. Таким образом, рецепторы ма A. tumefaciens GV3101, которые были предвари-Her2 являются важной мишенью противоопухолевой тельно трансформированы конструкциями VTM-PT-HC терапии [3]. и PVX-PT-LC. Эти конструкции обеспечивали экс-В конце 1990-х годов в клиническую практику прессию тяжелых и легких цепей рекомбинантного был введен таргетный препарат на основе монокло- антитела анти-Нег2 в клетках растения. Для повыше-нальных антител — трастузумаб (герцептин; Genetech, ния уровня экспрессии и наработки целевого белка Сан-Франциско, Калифорния). Механизм действия использовали конструкцию, которая кодирует анти-трастузумаба основан на том, что он обладает высо- сайленсинговый белок Р19 вируса кустистой карли-ким сродством к рецептору Her2/neu и, связываясь ковости томатов. с ним, предотвращает пролиферацию в клетках Сбор листьев осуществляли через 3 сут после РМЖ. Применение трастузумаба смогло повысить агроинфекции. Листья гомогенизировали и подвер-эффективность лечения и продлить жизнь пациентов гали экстракции. Затем экстракт пропускали через с Heü-положительным РМЖ. Показано, что исполь- систему фильтров и очищали методами аффинной зование трастузумаба в терапии РМЖ снижает риск и гель-фильтрационной хроматографии. Контроль развития отдаленных метастазов и тем самым увели- и оценку уровня экспрессии фитоантител анти-Heü чивает выживаемость пациентов [4]. Трастузумаб осуществляли с помощью метода иммунофермент-производится в культуре животных клеток и являет- ного анализа. ся дорогостоящим препаратом. Экстракция целевого белка из листьев N. bentha- Классическая система получения терапевтиче- miana. Листья измельчали в гомогенизаторе с добав-ских антител предполагает их экспрессию в генети- лением буфера для экстракции (200 мМ натрия цит-чески модифицированных культурах клеток. Техно- рат, 5 мМ этилендиаминтетраацетат, 0,1 % Tween 20, логия достаточно дорогая и сложная. Альтернативой рН 6,0). Раствор фильтровали через фильтры 20, 1,2 может быть получение рекомбинантных лекарствен- и 0,2 мкм. Фильтрат наносили на колонку HiTrap ных препаратов, в частности терапевтических анти- MabSelect SuRe 5 мл (GE Healthcare, США). Элюцию тел, в растениях методом транзиторной экспрессии проводили глицином 100 мМ pH 2,7. На финальном [5, 6]. Антитела, экспрессированные в растениях, этапе очистки целевого белка применяли гель-фильт-не уступают аналогам, полученным из клеток млеко- рационную хроматографию на колонке Superdex питающих, в противоопухолевой активности в отно- 200 10/300 GL (GE Healthcare, США). шении клеточных культур, которые экспрессируют иммуноцитохимический анализ гиперэкспрессии Her2/neu на поверхности мембран [7, 8]. Способ- антигена Шг2 с помощью фитоантител анти-Ш^. ность к модификации системы гликозилирования Клеточные линии SK-BR-3, полученные из банка растений позволяет получать антитела с профилем клеточных культур ФГБУ «НМИЦ онкологии им. гликозилирования, близким к таковому у человека [9]. Н.Н. Блохина» Минздрава России, культивировали В настоящей работе впервые показано, что полу- на стеклах в чашках Петри в среде RPMI-1640, соченные фитоантитела анти-Heü не отличаются от держащей 10 % телячьей эмбриональной сыворотки, трастузумаба по специфичному связыванию с антиге- 2 мМ L-глутамина, пенициллин (25 000 Ед) — стреп-ном Her2, а также с IV субдоменом рецептора Her2/neu. томицин (25 000 мкг), пируват натрия, 0,1 % раствор аминокислот и 0,1 % раствор витаминов, при 37 °С Материалы и методы в атмосфере 5 % CO2. Контроль прикрепления кле-накопление рекомбинантных антител в листьях. ток осуществляли визуально под микроскопом. После Фитоантитела получали в листовой пластине Nico- прикрепления клеток к стеклу аккуратно наливали tiana benthamiana методом транзиторной экспрессии. в чашку 8—10 мл среды. После образования клетками Полностью сформированные листья растения N. ben- 80 % монослоя стекла промывали 2 раза в PBS (фос-thamiana обрабатывали агробактериями Agrobacterium фатно-солевой буфер 2 мМ KH2PO4, 10 мМ Na2HPO4, tumefaciens (штамм GV3101), которые подвергаются 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, рН 7,3), просушивали на трансформации соответствующими плазмидами воздухе. Затем наносили первичные антитела (фито-pA16571 и pA16671, кодирующими легкую и тяжелую антитела анти-Her2/контрольные антитела) в разве-цепи антитела, в том числе плазмидой 35S-P19, ко- дении 1:500, инкубировали в течение ночи при +4 °С. дирующей антисайленсинговый белок P19 [10]. По- На следующий день отмывали 2 раза в PBS
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY 1'2018 том 17 |voL. 17
и наносили вторичные антитела против IgG человека, меченные FITC (флуоресцеин-5-изотиоцианатом). Инкубировали 45 мин при +4 °С во влажной камере. Отмывали стекла 2 раза в PBS в течение 5 мин, после этого наносили краситель для ядер Hoechst-33258 и инкубировали 15 мин во влажной камере. Промывали стекла 2 раза в PBS в течение 5 мин, просушивали и заключали под покровные стекла с помощью Fluorescent Mounting Medium (Daco, Дания).
Через сутки оценивали результаты на флуоресцентном микроскопе IN Cell Analyzer (GE Healthcare, США).
Проточная цитофлуориметрия. Для оценки биологической активности фитоантител анти-Her2 был использован метод проточной цитофлуориметрии. Оценивалось связывание антител анти-Her2 с клетками SK-BR-3. Клеточные линии получены из банка клеточных культур ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России.
Клетки SK-BR-3 собирали в количестве 5 х 105 и отмывали 2 раза в растворе PBS (рН 7,5). Клеточную суспензию (50 мкл) помещали в пробирки и инкубировали с 20 мкл образца антител в соответствующем разведении в течение 30 мин при комнатной температуре. После этого клетки отмывали PBS посредством центрифугирования при 1200 об/мин
в течение 7 мин. Далее клетки инкубировали с 20 мкл козьей антисыворотки против иммуноглобулинов человека, меченной FITC, в течение 30 мин при температуре 4 °С. После этого клетки отмывали 2 раза в растворе PBS и ресуспендировали раствором PBS, содержащим 1 % формалина и 0,1 % азида натрия.
Анализ результатов проводили методом проточной цитофлуориметрии на проточном цитофлуори-метре BD FACS Cento II (Becton Dickinson, США) на базе программного обеспечения CellQuest. В качестве контрольного образца использовали препарат трастузумаб фирмы Roche.
Результаты
Анализ специфической активности фитоантител анти-Her2 in vitro. В процессе исследования активности полученных фитоантител анти-Heü применяли иммуноцитохимический тест. Работу проводили с Heö-положительными клетками РМЖ SK-BR-3. Специфичность связывания тестировали с помощью кроличьих антител против антител человека, конъюгированных с пероксидазой хрена. В качестве положительного контроля выступали диагностические антитела, специфичные к Her2 (Dako, Дания), в качестве отрицательного — кроличьи антитела (рис. 1).
«
»
<0 *
& О
t
* -
Oï,
-Я
«4
jl.
щ
Ш
. __ ¿.¿s -с
( ш&ж^ Ш
•Vr* ' г.,
/ ? /
r
y
о
рис. 1. Результаты анализа специфической активности полученных фитоантител анти-Нег2: а — цитологический анализ клеток SK-BR-3, экспрессирующих онкоген Нег2 и обработанных фитоантителами анти-Нег2; б — клетки SK-BR-3 после обработки диагностическими антителами, специфичными к Нег2; в и г — отрицательные контроли соответственно к а и б, полученные путем обработки клеток SK-BR-3 только кроличьими антителами
в
98 Оригинальные статьи
100,0
Концентрация моноклональных антител, мкг/мл QJ Ahth-HER-2 ^ Трастузумаб
Рис. 2. Результаты связывания фитоантител анти-Нег2 с клетками SK-BR-3 при анализе на проточном цитофлуориметре
Сравнение эффективности специфического связывания анти-Нег2 фитоантител и трастузумаба с антигеном Нег2. Для подтверждения связывания полученных фитоантител анти-Нег2 с рецептором Нег2 в сравнении с трастузумабом проводили серию экспериментов с Нег2-положительными клетками РМЖ линии SK-BR-3 методом проточной цитофлуориметрии. В качестве контрольного образца использовали препарат трастузумаб.
В результате проведенных экспериментов был показан высокий процент связывания фитоантител анти-Нег2 с рецепторами Нег2 на поверхности клеток SK-BR-3 (от 69,1 до 100 % в зависимости от концентрации антител) (рис. 2). Этот результат идентичен данным, полученным при исследовании трастузумаба. Образцы фитоантител анти-Нег2 не отличаются по способности связываться с антигеном Нег2 на поверхности клеток РМЖ SK-BR-3 от препарата сравнения трастузумаба.
Анализ эффективности связывания фитоантител анти-Нег2 с IV субдоменом внеклеточного домена рецептора Нег2. Для анализа связывания полученных фитоантител анти-Нег2 с IV субдоменом внеклеточного домена рецептора Нег2 была разработана методика анализа конкурентного связывания с антигеном Нег2 между фитоантителами анти-Нег2 и трастузумабом. Эксперимент осуществляли методом проточной цитофлуориметрии с использованием клеток, гиперэкспрессирующих антиген Her2, — SK-BR-3. Оценивалось связывание меченых антител анти-Нег2 с клетками SK-BR-3, обработанными фитоантителами анти-Нег2 или трастузумабом.
Для этого клетки SK-BR-3 предварительно обрабатывали фитоантителами анти-Нег2 либо трастузумабом, после чего инкубировали обработанные клетки с меченными FITC образцами фитоантител
анти-Нег2 и трастузумаба различной концентрации (рис. 3). В случае если антитела связывают разные антигенные эпитопы, будет наблюдаться полноценное окрашивание клеток антителами, меченными Р1ТС. При совпадении эпитопов отмечается отсутствие или значительное снижение получаемого окрашивания. Проценты рассчитывали от 100 % окрашивания клеток без конкуренции соответствующим типом антител.
Полученные результаты показали, что при инкубации клеток БК-ВЯ-З как с фитоантителами анти-Нег2, так и с трастузумабом происходило практически полное связывание рецепторов Ней на поверхности клеток с антителами и не оставалось свободных аффинных эпитопов.
В результате проведенных экспериментов выявлен низкий процент связывания фитоантител анти-Нег2, меченных Р1ТС, с рецепторами Ней на поверхности клеток БК-ВЯ-З, обработанных трастузумабом (от 0,2 до 13,3 % в зависимости от концентрации антител). Аналогично показан низкий процент связывания трастузумаба, меченного Р1ТС, с рецепторами Ней на поверхности клеток БК-ВЯ-З, обработанных фитоантителами анти-Ней (от 0,8 до 13,8 % в зависимости от концентрации антител) (рис. 4). Результат идентичен данным, полученным при исследовании трастузумаба. Это свидетельствует о том, что образцы фитоантител анти-Ней связываются с тем же доменом антигена Ней на поверхности клеток РМЖ ЗК-ВЯ-З, что и препарат сравнения — трастузумаб.
Обсуждение
Применение трастузумаба радикально изменило лечение РМЖ, в результате этого в руках онкологов появилось инновационное средство, которое смогло повысить эффективность лечения или продлить жизнь больных Ней-положительным РМЖ.
В нашей работе экспрессию и наработку фитоантител анти-Ней осуществляли в растениях N. ЬепМа-
Антитела, меченные FITC (трастузумаб/ фитоантитела)
Первичные антитела
(трастузумаб/
фитоантитела)
Рецептор Her2
Рис. 3. Схема эксперимента конкурентного связывания рекомби-нантных антител с клетками ЗК-ВК-З
100
80
60
40
20
SK-BR-3 + трастузумаб, 100 мкг/мл
3,8 5,3
1,3 0,2
100
80
60
40
20
SK-BR-3 + фитоантитела анти-Нег2, 100 мкг/мл
s,s
ШШН):
4,5
1,3 0,5
24
12
24
12
0
0
100 80
g 60 ни
а
Cû
£ 40 cc
Cû
с
чр 04 20
0
SK-BR-3 + трастузумаб, 50 мкг/мл
1,3 13,3
24
4,3 2,6
ии im*—
12
I трастузумаб/FITC
100 80
§ 60 н а
ffl
g 40 m
с
* 20 0
SK-BR-3 + фитоантитела анти-Нег2, 50 мкг/мл
12,6
llllllll
4,5
24
= фитоантитела анти-Her2/FITC
5,5
llllllll
12
0,5
Рис. 4. Результаты эксперимента по определению конкурентного связывания рекомбинантных антител с клетками SK-BR-3 на проточном цитофлуориметре
miana. Для этого листья N. benthamiana инфицировали клетками A. tumefaciens, трансформированными соответствующими генными конструкциями. Эти конструкции обеспечивали экспрессию тяжелых и легких цепей рекомбинантного антитела анти-Нег2 в клетках растения. После сбора растительного материала проводили экстракцию фитоантител анти-Her2 с последующей поэтапной очисткой.
Нами было проведено исследование с целью доказательства активности полученных анти-Herë фитоантител, для этого использовали иммуноцито-химический тест. Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что полученные анти-Herë фито-антитела способны специфически узнавать клетки РМЖ SK-BR-3 и связываться с ними.
Исследование специфической активности такого многофункционального вещества, как монокло-нальное антитело, можно проводить по нескольким параметрам. В первую очередь подлежит оценке эффективность связывания моноклональных антител с целевым антигеном Her2.
Полученные данные демонстрируют совпадение в аффинных свойствах трастузумаба и фитоантител анти-Нег2 как по степени связывания антигена, так и по локализации аффинного эпитопа на молекуле Нег2. Метод проточной цитофлуориметрии позволяет оценить эти параметры на нативном антигене, локализованном на мембране клеток. Также была выявлена высокая степень связывания фитоантител анти-Herë с рецепторами Her2 на поверхности клеток SK-BR-3, аналогичная связыванию контрольного препарата трастузумаба.
Заключение
Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют о том, что образцы фитоантител анти-Herë, полученных из растения N. benthamiana, связываются с тем же IV доменом онкоантигена Her2, что и трас-тузумаб, с аналогичной аффинностью. В связи с этим можно сделать вывод о том, что полученные фитоан-титела анти-Heü функционально соответствуют трастузумабу.
100 Оригинальные статьи
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Давыдов М.И. Структура заболеваемости злокачественными новообразованиями населения России в 2008 г. Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН 2010;21(2):52.
2. Чиссов В.И. Злокачественные новообразования в России в 2010 году (заболеваемость и смертность).
М.: ФГБУ «МНИОИ
им. П.А. Герцена» Минздравсоцраз-
вития России, 2012. 260 с.
3. Hudziak R.M., Lewis G.D., Winget M. et al. p185HER2 monoclonal antibody has antiproliferative effects in vitro and sensitizes human breast tumor cells
to tumor necrosis factor. Mol Cell Biol
1989;3:1165-72.
DOI: 10.1128/MCB.9.3.1165.
4. Komarova T.V., Kosorukov V.S., Frolova O.Y. et al. Plant-made trastuzumab (herceptin) inhibits HER2/Neu+ cell proliferation and retards tumor growth.
PLoS One 2011:e17541.
DOI: 10.1371/journal.pone.0017541.
5. Кособокова Е.Н., Пинюгина М.В., Косоруков В.С. Получение биологически активного интерферо-на-а-2Ь человека из растений Nicotiana benthamiana. Биотехнология 2015;4:52-61.
6. Steplewski Z., Sun L.K., Shearman C.W. et al. Biological activity of human — mouse IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 chimeric monoclonal antibodies with antitumor specificity. Proc Natl Acad Sci USA 1988;85(13):4852—6. PMID: 3387441.
7. Косоруков В.С., Скрыпник К.А., Трещалина Е.М., Андронова Н.В. Противоопухолевое действие субстанции рекомбинантных антител против онкоантигена HER2/neu, полученной из растительного продуцента. Российский биотерапевтический журнал 2012;11(2):4.
8. Dorokhov Y.L., Frolova O.Y., Skurat E.V. et al. A novel function for a ubiquitous plant enzyme pectin methylesterase:
the enhancer of RNA silencing. FEBS
Lett 2006;580:3872-8.
DOI: 10.1016/j.febslet.2006.06.013.
9. Komarova T.V., Sheshukova E.V., Kosobokova E.N. et al. Trastuzumab and pertuzumab plant biosimilars: Modification of Asn297-linked glycan of the mAbs produced in a plant
with fucosyltransferase and xylosyltransferase gene knockouts. Biochemistry (Moscow) 2017;82(4):510-20. DOI: 10.1134/S0006297917040137. 10. Косоруков В.С., Кособокова Е.Н., Пинюгина М.В. и др. Биологическая активность рекомбинантных антител против рецептора Her2, полученных из растительного источника. Российский биотерапевтический журнал 2015;14(2):105—12.
