CC BY
43
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
ПОЛУЧЕНИЕ ВЕКТОРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В NICOTIANA BENTHAMIANA СЛИТНОГО БЕЛКА НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНОГО ГУМАНИЗИРОВАННОГО АНТИТЕЛА ПРОТИВ ОПУХОЛЕВОГО АНТИГЕНА HER2 И ИНТЕРФЕРОНА-a^b ЧЕЛОВЕКА
12 3
Кособокова Е.Н. , Шешукова Е.В. , Щербаков А.И. , Пинюгина М.В.4, Косоруков В.С.5 Email: Kosobokova17118@scientifictext.ru
1Кособокова Екатерина Николаевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, лаборатория трансгенных препаратов, Федеральное государственное бюджетное учреждение Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина
Минздрава России; 2Шешукова Екатерина Владимировна - младший научный сотрудник, лаборатория генетического контроля устойчивости к стрессам, Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук;
3Щербаков Александр Игоревич - младший научный сотрудник; 4Пинюгина Марина Владимировна - младший научный сотрудник; 5Косоруков Вячеслав Станиславович - кандидат биологических наук, заведующий лабораторией, лаборатория трансгенных препаратов, Федеральное государственное бюджетное учреждение Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина
Минздрава России, г. Москва
Аннотация: в клинической практике широко используется терапия на основе препаратов из группы цитокинов. Одним из наиболее используемых цитокинов является интерферон а-2б человека (ИФН-а2б). В случае применения в онкологии предпочтительным является усиленное воздействие ИФН-а2б в зоне локализации опухоли. С этой целью предложено создание слитного белка на основе полноразмерного рекомбинантного антитела против онкоантигена HER2 и ИФН-а2б. Гиперэкспрессия HER2 характерна для части случаев рака молочной железы, которые поддаются терапии антителами. Ранее была разработана технология получения рекомбинантных антител из растительной биомассы Nicotiana benthamiana путем транзиентной агроинъекции. В работе рассмотрены подходы по получению векторных конструкций гибридного белка на основе антитело-ИФН и их модификация для эффективной экспрессии в растительной клетке. Ключевые слова: рекомбинантные слитные белки, интерферон-а-2Ь, онкоантиген HER2, растительная транзиторная экспрессия.
CONSTRUCTION OF VECTORS FOR EXPRESSION OF FUSION PROTEINS BASED ON MONOCLONAL ANTI-HER2 ANTIBODY AND INTERFERON-a-2b IN NICOTIANA BENTHAMIANA
12 3
Kosobokova E.N.1, Sheshukova E.V.2, Shcherbakov A.I.3, Pinyugina M.V.4, Kosorukov V.S.5
1Kosobokova Ekaterina Nikolaevna - Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher, LABORATORY OF TRANSGENIC SUBSTANCES, N.N. BLOKHIN NATIONAL MEDICAL SCIENCE ONCOLOGY CENTER;
2Sheshukova Ekaterina Vladimirovna - Junior Researcher, LABORATORY OF GENETIC CONTROL OF STRESS RESISTANCE, VAVILOVINSTITUTE OF GENERAL GENETICS;
3Shcherbakov Alexander Igorevich - Junior Researcher;
4Pinyugina Marina Vladimirovna - Junior Researcher; 5Kosorukov Vyacheslav Stanislavovich - Candidate of Biological Sciences, Head of the Laboratory, LABORATORY OF TRANSGENIC SUBSTANCES, N.N. BLOKHIN NATIONAL MEDICAL SCIENCE ONCOLOGY CENTER,
MOSCOW
Abstract: the therapy based on drugs from the group of cytokines is widely used in clinical practice. One of the most used cytokines is human interferon a-2b (IFN-a2b). In oncology field it is preferred to enhance concentration of IFN-a2b close to the tumor localization. It has been proposed to create a fusion protein based on a full-length recombinant antibody against the antigen HER2 and IFN-a2b. Overexpression of HER2 is common in cases of breast cancer which could be treated with antibody therapy. Previously was developed the technology for expressing recombinant antibodies in biomass of Nicotiana benthamiana using agroinjection. The approaches to obtaining vector of hybrid antibody-IFN constructions of and its modifications for effective expression in a plant tissue are discussed. Keywords: recombinant fusion proteins, interferon-a-2b, anti-HER2, plant transient expression.
УДК 57.088.2
Интерфероны (ИФН) - группа сигнальных низкомолекулярных белков, выделяемых клетками млекопитающих в ответ на присутствие болезнетворных микроорганизмов (таких, как вирусы, бактерии, паразиты) или опухолевых клеток. Эти цитокины обладают антивирусной, иммуномодулирующей, противоопухолевой и другими видами активности, что позволяет отнести их к важнейшим факторам врожденного иммунитета, полифункциональным биорегуляторам широкого спектра действия и гомеостатическим агента м [1]. В клинике наиболее часто используется ИФН-а-2Ь. Одной из важнейших областей использования этого белка является онкология [2, 3].
ИФН-а является иммуномодулятором, стимулирующим дифференцировку и активность дендритных клеток, Th-клеток [4] и обеспечивает длительное выживание CD8+T клеток [5]. В дополнение к способности усиливать адаптивный противоопухолевый иммунный ответ, ИФН-а может увеличивать уровень экспрессии гена опухолевого супрессора Р53 [6], ингибировать ангиогенез и запускать апоптоз [7] в опухолевых клетках. Было продемонстрировано также направленное цитотоксическое действие ИФН-а на некоторые злокачественные клеточные линии.
Основные области применения ИФН - это хронический миелолейкоз, Т-клеточная лимфома кожи, множественная миелома, злокачественная меланома и рак почки.
Однако системная высокодозная интерферонотерапия часто сопровождается тяжелыми побочными эффектами, которые делают невозможным дальнейшее применение цитокина в эффективной дозе. Целенаправленное введение препарата в область злокачественного образования лишь частично решает проблему,
т. к. концентрация цитокина в месте введения быстро снижается. Кроме того, часто локализация опухоли или микрометастаз делает невозможным проведение данной процедуры.
Специфические к опухоли моноклональные антитела, генетически сшитые с цитокинами, (МАт-Ц) являются альтернативным способом накопления в области опухоли цитокинов в концентрации, достаточной для проявления значительного противоопухолевого эффекта без сопровождаемой системной токсичности.
Помимо того, что Ат обеспечивают доставку интерферона в область опухоли, они и сами могут работать в качестве противоопухолевых агентов, блокируя рецепторы на поверхности злокачественных клеток. Около 50% всех антител на фармацевтическом рынке являются противоопухолевыми, и каждый год ожидается появление в среднем около 10 новых препаратов Ат, направленных на лечение разных типов опухолей.
На фармацевтическом рынке нет слитных белков на основе антител и цитокинов, однако ряд препаратов проходят клинические испытания на I-II фазе. Предварительные результаты свидетельствуют о серьезной перспективе для таких рекомбинантных белков в качестве противоопухолевых препаратов за счет ряда преимуществ [8].
В данной работе за основу таргетного носителя мы взяли гены цепей антитела против опухолевого антигена HER2 (от Human Epidermal growth factor Receptor 2), представляющего собой трансмембранную тирозиновую протеинкиназу ErbB2 с мол. массой 185 кДа. Антитела, введенные в кровоток пациента, взаимодействуют с экзоклеточной частью HER2 и угнетают деление раковых клеток иногда, сопровождающееся их гибелью. В комбинации с химиотерапией антитела оказывают выраженный лечебный эффект. Показано, что использование такой терапии снижает риск развития отдаленных метастазов и тем самым увеличивало выживаемость пациентов [9].
Классически рекомбинантные антитела получают путем экспрессии в культурах клеток млекопитающих. Технология достаточно дорогая и сложная.
В клетках высших растений осуществляются посттрансляцинные модификации, сходные с таковыми в клетках млекопитающих: гликозилирование, фосфорилирование, метилирование и др. [10], а также обеспечивается правильная укладка (фолдинг) рекомбинантного продукта, обеспечивающая сохранение белка растворимым. В отличие от систем экспрессии на основе культур клеток млекопитающих растения не содержат патогенных для человека вирусов, микроорганизмов, прионов и онкогенов, таким образом, они являются безопасным продуцентом для терапевтически значимых белков [11, 12].
Ранее была разработана система экспрессии рекомбинантных белков в листьях Nicotiana benthamiana [13]. Данная технология подразумевает вставку целевого гена в реплицирующиеся элементы вируса, последующее инфицирование клеток растения, где происходит амплификация, приводящая к накоплению рекомбинантного белка в цитозоли растительной клетки [14, 15]. Вследствие обработки агроинъекцией растения, получаемые по данной технологии, будут трансгенными «временно». Экспрессия целевого белка может достигать высокого уровня за короткий срок (от 3 до 14 дней после инфицирования в зависимости от используемой системы). Применение специальных генетических вспомогательных элементов, обеспечивающих высокий уровень экспрессии, позволяет получать до 5 г. целевого продукта с одного килограмма зеленой массы, что составляет порядка 50% от всех растворимых белков [16]. Благодаря такому подходу возможно получение большого количества конструкций, которые могут быть быстро и легко протестированы; нет опасности переноса трансгена в окружающую среду; кроме того, агробактериальные векторы легко переносятся в ткань листа при помощи механического введения, осуществляя крупномасштабное инфицирование; возможна агроинъекция одного и того же растения двумя и более векторами, что обеспечивает возможность сборки белков, состоящих из нескольких субъединиц [17, 18].
На базе этой системы экспрессии были созданы рекомбинантные гуманизированные антитела, производимые в растениях (aнтиHER2-фитоaнтитело) специфически взаимодействующие с внеклеточным доменом рецептора эпидермального ростового фактора человека (HER2) [18, 19]. Разработанный технологический процесс достаточно прост и дешев в сравнении с существующими технологиями производства в терапевтических антител в культурах клеток животных. Полученные фитоантитела являются биоаналогом коммерческих антител трастузумаб, используемых в терапии рака молочной железы [20].
Целью данной работы стало создание векторов для экспрессии слитного белка на основе моноклонального гуманизированного антитела против опухолевого антигена HER2 и интерферона^^ человека в Nicotiana benthamiana.
Методы
В работе использовались штамм Escherichia coli BL21(DE3) и dH5a и штамм агробактерии Agrobacterium tumefaciens GV3101. Генетические конструкции и праймеры для проведения ПЦР были синтезированы фирмой «Евроген» (Россия). В работе использовались рестриктазы, Т4 ДНК-лигаза (Fermentas, Литва).
Клонирование целевого гена в экспрессионные векторы проводили стандартными методами генной инженерии.
Агроинъекция
Агробактерии A.tumefaciens, штамм GV3101, трансформированные плазмидами тяжелой и легкой цепей МАт, культивировали в течение ночи в 20 мл LB при 28 0С до OD600=0,1. Агроинъекцию проводили однократно посредством шприца без иглы. Растения культивировали в лабораторной теплице с контролем параметров света, влажности и температуры.
Для стимуляции продуктивности и повышения уровня экспрессии системы проводили коагроинъекцию с культурой агробактерий, несущих вектор с геном белка р19 из вируса карликовой кустистости томатов [21].
Экстракция целевого белка из листьев N.benthamiana
На пятые сутки у растений собирали ткани листьев и гомогенизировали в буфере 0,2 М цитрат натрия, 0,005 М), 0,1% Tween 20, рН 8,0. Экстракт инкубировали при комнатной температуре в течение часа при постоянном перемешивании и центрифугировали 30 минут при 1200g с целью удаления клеточного дебриса и нерастворимого материала. Далее экстракт фильтровали через двойной слой предфильтра Miracloth (Merck, Германия), через фильтр с размером пор 1,2 мкм и 0,45 мкм (Whatman, Англия). Полученный экстракт использовали в исследованиях.
Скрининг белка
Для анализа уровня экспрессии экстракты смешивали с буферным раствором для нанесения (60% глицерол (Amresco, США), 5 мМ ß-меркаптоэтанол (Helicon, Россия), 10% SDS (Sigma, США), 250 мМ Tris-Ha (Helicon, Россия), pH 6,8). Полученные образцы прогревали в течение 5 минут при 95 0С. Для оценки результатов экспрессии применяли стандартный метод Леммли вертикального электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) с додецилсульфатом натрия (SDS) в редуцирующих условиях. Для работы использовали установку Mini Protean II (Bio-Rad, США). Для визуализации белков на ПААГ использовали метод окрашивания 0,2% Coomassie brilliant blue G-250.
Для идентификации домена МАт использовали Вестерн-блоттинг, который осуществляли методом влажного переноса при помощи установки Mini-VE Blotter (Amersham Biosciences Corp., США). Перенос осуществляли на NC мембрану (Amersham Biosciences Corp., США) в TGB (39 мМ глицин, 48мМ TrisHCl, 0,1% SDS, 20% метанол) в течение 2-х часов при 180 мА. Для забивки мембраны использовали T-TBS (2 мМ TrisHCl, 13,7 мМ NaCl, 0,1% Tween-20, pH 7,5-7,6) с 5% BSA (Sigma, США). Проводили гибридизацию с моноклональными мышиными антителами против IgG человека в течение двух часов при постоянном вращении в гибридайзере. Далее
повторяли отмывку в T-TBS. И инкубировали с меченными антителами против Ig мыши (Имтек, Россия) в течение часа в гибридайзере. Для проявки антител с пероксидазной активностью использовали DAB.
Концентрация рекомбинантного белка определялась при помощи иммуноферментного анализа (ИФА). Для проведения ИФА использовались наборы «ИФА-IFN-alfa» (Цитокин, Россия) и набор для определения иммуноглобулинов крови (Производитель ЗАО «Вектор-Бест»), согласно рекомендациям производителей.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование наработки рекомбинатного белка слитных антител в различных векторных системах.
1.1. Модификация линкерной последовательности вектора слитного белка.
Антитела являются сложными белками, состоящими из 2-х пар цепей - легкой и тяжелой. Создание еще более сложных мультидоменных конструкций на их осннове несет в себе определенные сложности. Так, например, может нарушаться сборка полноразмерных антител в полноценный белок при сохранении уровня эекспрессии отдельных компонентов или, значительно смещаться уровни экспрессии отдельных компонентов, что может нарушать процесс сборки уже как следствие. Именно поэтому целью нашего исследования стало получение векторов, обеспечивающих эффективную экспрессию и сборку полноценной молекулы слитного белка (рис. 1).
Рис. 1. Схематичное изображение слитного белка мАТ и ИФН. Кружок - ИФН
Ранее нами было показано, что использование 358 промотора обеспечивает высокие уровни экспрессии терапевтически значимых белков в растениях [18, 22]. По аналогии была создана конструкция для экспрессии слитного белка (рис. 2).
Р(А) | term
HER2 tnAb LC| р( А) Г^
Рис. 2. Схематическое изображение векторных конструкций 35S-pHC-HER2-L6-IFN, 35S-pHC-HER2-L12-IFN, 35S-pLC-HER2
Было высказано предположение, что изменение в С-конце тяжелой цепи в виде довольно крупного домена интерферона может нарушать сборку антитела в тетра-белок. Одним из очевидных решений такой проблемы было введение в последовательность пептидного линкера на границе антитело-интерферон.
Методом сайт мутагенеза были созданы модифицированные версии векторов со вставкой короткого линкера в008в8 и более длинного GGGSGGGSGGGS. Для этого в вектор 358-рИС-ИБК2-ГРМ была введены сайтспецифические нуклеотидные вставки участков ООСвОАввАТССООТТСС и ООТООАООСТСАООТООТООАТССООАО GTGGCAGT, кодирующие варианты линкера, на границе последовательностей тяжелой цепи МАт и ИФН.
Полученные последовательности были проверены методом секвенирования.
Для доставки вирусных векторов в листья растений был использован метод агроинъекции с помощью культуры клеток Л.Штв/аЫвт, предварительно трансформированный векторными конструкциями.
Эффективность экспрессии оценивали при помощи ИФА, используя наборы «ИФА-^в общий» (Вектор БЕСТ, Россия). Используемый твердофазный метод иммуноанализа основан на принципе «сендвич». Анализ проводится в две стадии. На первой стадии калибровочные образцы с известной концентрацией и анализируемые образцы инкубируются в лунках стрипированного планшета с иммобилизованными моноклональными антителами к На второй стадии
связавшийся в лунках обрабатывают конъюгатом моноклональых антител к легким цепям иммуноглобулинов человека с пероксидазой. Образовавшиеся иммунные комплексы выявляют цветной реакцией с раствором тетраметилбензидина. Степень окрашивания пропорциональна концентрации в анализируемом образце. После измерения величины оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация в анализируемых образцах.
Для анализа уровня экспрессии на 5-й день после агроинъекции собирали по 0,04 г биомассы листа, растирали в тефлоновой ступке и смешивали с 200 мкл буферного раствора для экстракции (2М №3С6И507, 0,1% Tween 20,5мМ ЭДТА, рН 6,0). Потом в соответствующих разведениях проводили анализ проб методом ИФА.
В таблице 1 представлены результаты для проверяемых конструкций.
Таблица 1. Оценка уровня экспрессии слитного белка методом ИФА, полученного при использовании разных генетических конструкций, на 5-й день после инфильтрации
Концентрация, мг/кг листьев
358-ИБК2-Ь6-1ЕК 18
358-НЕК2-и2-ШК 55
Полученные результаты свидетельствуют о том, что при использовании 358 промотора длина линкера имеет значение для уровня экспрессии слитного белка. Более длинный линкер обеспечивает больший уровень экспрессии. Это свидетельствует о том, что длина линкера оказывает влияние на полноценную сборку сложной молекулы.
Для детекции наличия домена интерферона использовались также наборы «ИФА-¡ЕМ-аНа» (Цитокин, Россия).
Использование двух наборов на каждый из доменов слитного белка, позволило оценить процентное соотношение массы участков антител и цитокина. Полученные результаты соответствовали ожиданиям (табл. 2) и свидетельствовали о правильной сборки гибридной конструкции в растительном продуценте.
Размер домена Доля в гибридной конструкции расчетная Доля в гибридной конструкции по ИФА
МАТ к HER2 145 кДа 79,68% = 80%
чИФН-a^b 18,5 кДа (*2) 20,32% = 20%
Заключение
В процессе выполнения исследования были созданы модифицированные векторные генетические конструкции, обеспечивающие экспрессию в растениях слитного белка на основе МАт, домена интерферона и линкера между ними. Было показано, что наиболее эффективная конструкция 35S-HER2-L12-IFN обеспечивает синтез заметных количеств целевого слитного рекомбинантного белка, хотя и ниже, чем было получено ранее для полноразмерных рекомбинантных анатител в той же экспрессионной системе.
Список литературы /References
1. Ершов Ф.И. Пять десятилетий интерферона // Интерферону - 50 лет. Москва, 2007. С. 11, 34.
2. Кособокова Е.Н., Косорукое В.С. Интерфероны в онкологии // Врач, 2010. № 11. С. 18-21.
3. Asmana Ningrum R. Human interferon alpha-2b: a therapeutic protein for cancer treatment // Scientifica (Cairo), 2014. V. 2014:970315.
4. Finkelman F.D., Pearce E.J., Urban J.F.Jr, Sher A. Regulation and biological function of helminth-induced cytokine responses. // Immunol Today, 1991. Mar. 12 (3). P. A62-6.
5. Tough D.F., Borrow P., Sprent J. Induction of bystander T cell proliferation by viruses and type I interferon in vivo. // Science, 1996. 272 (5270). Р. 1947-1950.
6. Takaoka A.1, Hayakawa S., Yanai H., Stoiber D., Negishi H., Kikuchi H., Sasaki S., Imai K., Shibue T., Honda K., Taniguchi T. Integration of interferon-alpha/beta signalling to p53 responses in tumour suppression and antiviral defence // Nature, 2003. Vol. 424 (6948). P. 516-523.
7. Rodriguez-Villanueva J., McDonnell T.J. Induction of apoptotic cell death in non-melanoma skin cancer by interferon-alpha. // Int J Cancer., 1995. Vol. 61(1). P. 110-114.
8. Кособокова Е.Н., Косоруков В.С., Барышников А.Ю. Слитные белки на основе антител и цитокинов: получение, функциональность и перспективы применения в онкологии // Современные технологии в медицине, 2013. № 4. С. 103-111.
9. Ганьшина и Личиницер. Герцептин в адъювантной терапии рака молочной железы //. Фарматека, 2005. №18. С. 8-11.
10. Gomord V., Fitchette A.C., Menu-Bouaouiche L., Saint-Jore-Dupas С., Plasson С., Michaud D., Faye L. Plant-specific glycosylation patterns in the context of therapeutic protein production // Plant Biotechnol. J., 2010. V. 8 (5). P. 564-587.
11. Demain A.L., Vaishnav Р. Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms // Biotechnol. Adv., 2009. V. 27 (3). P. 297-306.
12. Desai P.N., Shrivastava N., Padh Н. Production of heterologous proteins in plants: strategies for optimal expression // Biotechnol. Adv., 2010. V. 28 (4). P. 427-435.
13. Dorokhov Y.L. Reciprocal dependence between pectinmethy lesterase gene expression and tobamovirus reproduction effect ivenessin Nicotiana benthamiana / Y.L. Dorokhov, E.V. Skurat, O.Y. Frolova, T.V. Gasanova, A.A. Smirnov, S.D. Zvereva, P.A. Ivanov, N.V. Ravin, L.I. Zamchuk, I.G. Atabekov // Dokl. Biochem. Biophys., 2004. V. 394. P. 30-32.
14. Gleba Y. Magnifection - a new platform for expressing recombinant vaccines in plants / Y. Gleba, V. Klimyuk, S. Marillonnet // Vaccine, 2005. V. 23 (17-18). P. 2042-2048.
15. Lico С., Chen Q., Santi L. Viral vectors for production of recombinant proteins in plants / C. Lico, Q. Chen, L. Santi // J. Cell. Physiol., 2008. V. 216 (2). P. 366-377.
16.Mett V. Plants as biofactories / V. Mett, C.E. Farrance, B.J. Green, V. Yusibov // Biologicals., 2008. V. 36 (6). P. 354-358.
17. Santi L., Huang Z., Mason H. Virus-like particles production in green plants // Methods., 2006. V. 40 (1). P. 66-76.
18. Komarova T.V., Kosorukov V.S., Frolova O.Y., Petrunia I.V., Skrypnik K.A., Gleba Y.Y., Dorokhov Y.L. Plant-made trastuzumab (herceptin) inhibits HER2/neu+ cell proliferation and retards tumor growth // PLoS One, 2011. e17541. doi:10.1371/journal.pone.0017541.
19. Косорукое В.С., Кособокова Е.Н., Пинюгина М.В., Севостьянова М.А., Щербаков А.И., Андоронова Н.В., Соломко Э.Ш., Шешукова Е.В., Трещалина Е.М., Дорохов Ю.Л. Биологическая активность рекомбинантных антител против рецептора HER2, полученных из растительного источника // Российский биотерапевтический журнал, 2015. Т. 14. № 2. С. 105-112.
20. Komarova T.V., Sheshukova E.V., Kosobokova E.N., Serebryakova M.V., Kosorukov V.S., Tashlitsky V.N., Dorokhov Y.L. Trastuzumab and pertuzumab plant biosimilars: Modification of Asn297-linked glycan of the mAbs produced in a plant with fucosyltransferase and xylosyltransferase gene knockouts. // Biochemistry (Moscow), 2017. Vol. 82 (4). C. 510-520.
21. Voinnet О., Rivas S., Mestre Р., Baulcombe D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus // Plant J., 2003. V. 33 (5). P. 949-956.
22. Кособокова Е.Н., Пинюгина М.В., Косоруков В.С. Получение биологически активного интерферона-а^ человека из растений Nicotiana benthamiana. // Биотехнология, 2015. № 4. С. 52-61.
