Исследование влияния поли-His доменов на уровень экспрессии и эффективность очистки интерферона-гс-2ь человека Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 616-022:578.245.4

Е.Н. Кособокова, В.С. Косоруков

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПОЛИ-HIS ДОМЕНОВ НА УРОВЕНЬ ЭКСПРЕССИИ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ОЧИСТКИ ИНТЕРФЕРОНА- а-2 b ЧЕЛОВЕКА

РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Контактная информация:

Кособокова Екатерина Николаевна, научный сотрудник лаборатории трансгенных препаратов НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(495)324-14-59; e-mail: ekkos@mail.ru

Статья поступила: 16.09.2010, принята к печати 07.10.2010. Резюме

Интерфероны - важный класс цитокинов, нашедших широкое применение в медицинской практике, в частности в терапии онкологических заболеваний.

Для применения в клинике необходимо создание высокоочищенной субстанции. Современные препараты интерферонов соответствуют требованиям к качеству очистки, но поступают на потребительский рынок с ценами недоступными для многих больных. До сих пор остается актуальной проблема оптимизации процесса получения и очищения ИФН.

Для получения ИФН-а-2Ь человека (чИФН-а-2Ь) в данной работе использовали бактериальную систему экспрессии (Escherichia coli), в которую клонировали генетическую конструкцию, содержащую синтезированную и модифицированную последовательность целевого белка. Были созданы три генетические конструкции чИФН-а-2Ь: нативный белок, белок с одним (6His) и с двум (12His) доменами. Идентификацию ИФН проводили с помощью метода Вестерн-блоттинга с антителами против чИФН-а и иммуноферментного анализа. Наши исследования показали, что в отношении уровня экспрессии и эффективности очистки наиболее удачна конструкция с одним 6His-доменом на N-конце.

Ключевые слова: интерфероны, His-домен, бактериальная экспрессия.

E.N. Kosobokova, V.S. Kosorukov

THE SIGNIFICANCE OF POLY-HIS DOMENS ON EXPRESSION LEVEL AND EFFICACY OF PURIFICATION OF HUMAN INT-A-2

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow

Abstract

Interferons (IFN) belong to cytokines family and are widely used in clinic, particularly in cancer therapy.

Modern drugs fit the requirements of quality of clearing, but appear on the market with prices unacceptable for many patients. The problem of optimization of the production and purification of IFNs for simplification and cost reduction is still actual. Many laboratories are engaged in solving this problem in different countries.

For production of highly purified substances, we used pET bacterial expression system (Escherichia coli) for production of a human IFN-a-2b. The genetic design containing synthesized and modified sequences of target protein has been cloned. We have synthesized three genetic designs of hIFN-a-2b: without histidine tag and with domains consist of 6 or 12 histidine (6-His and 12-His). Proteins expressed were identified as IFN-a-2b using ELISA and Western blotting assaus. Our data indicate that the design with the 6His on the N-end is the most successful construction either the level of expression or efficacy of purification.

Key words: intereferons, His-tag, bacterial expression.

Введение

Последние достижения в геномике, протеоми-ке и биоинженерии привели к экспоненциальному росту числа лекарственных белков, получаемых с использованием биотехнологий. Биотехнологический процесс включает в себя несколько этапов: продукция белка в эксрессионной системе, восстановление активности и очищение. Последний этап очень важен для последующего использования субстанции в качестве основы лекарственного препарата.

Перспективным методом очищения на данный момент является аффинная хроматография [10]. В основе технологии лежит избирательное взаимодействие белков с лигандом, ковалентно связанным с инертным носителем. Аффинный домен экспрес-сионного белка - удобный инструмент для проведения высокоэффективного очищения белка. Включе-

ние такой последовательности в генетическую конструкцию в зависимости от вида может оказывать как положительный, так и отрицательный эффект. К первым относятся [2]:

- Увеличение уровня экспрессии белка.

- Предотвращение протеолиза.

- Облегчение и увеличение эффективности рефолдинга.

- Увеличение растворимости.

С другой стороны, возможно проявление негативного действия включения аффинной метки, выражающееся в изменении конформации и снижении выхода белка. Одной из наиболее часто используемых аффинных последовательностей является полипептид из нескольких аминокислотных остатков гистидина (nHis) [8]. Полигистидиновый домен образует комплекс с ионами хелатных металлов (например, №2+), иммобилизованных на ЫТД.

10S

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПОЛИ-HIS..

Образование таких комплексов стабильно происходит даже в присутствии высоких концентраций хаотропных агентов, таких как гуанидин гидрохлорид и мочевина. nHis - это небольшая не загружающая белок последовательность, которая не влияет на транспорт и сворачивание слитного белка внутри клетки, и, как правило, не нарушающая структуру и функционирование очищенного белка.

Среди терапевтических рекомбинантных белков ведущее место занимают цитокины, в частности -интерфероны, нашедшие широкое применение в медицине [1]. В клинике наиболее широко представлен ИФН-а-2Ь. Одной из важнейших областей использования этого белка является онкология.

Препараты ИФН включены в качестве вспомогательных агентов в схемы лечения ХМЛ, Т-клеточной НХЛ кожи, ММ, злокачественной мела-номы и рака почки[3-5; 7; 9]. Препараты первого поколения (на основе природных интерферонов) практически полностью вытеснены рекомбинант-ными аналогами. Это связано с дефицитом и неоднородностью сырья (донорской крови) и высокой стоимостью конечного продукта.

До сих пор актуальной остается проблема оптимизации процесса получения и очистки ИФН. Решением этого вопроса занимаются в лабораториях разных стран.

Нашей целью стало изучение влияния включения различных типов полигистидиновых последовательностей (6 His и 12 His) на уровень экспрессии и эффективность очистки иФН-а-2Ь человека (чИФН-а-2Ь). Важной идеей создания конструкции с увеличенным количеством гистидиновых остатков было предположение о возможности более тщательной отмывки рекомбинантного белка и возможности проведения процесса восстановления его конформацион-ной структуры - рефолдинга - прямо на аффинной колонке за счет увеличения прочности связи между полигистидиновым доменом и №2+-сефарозой. Для достижения цели в рамках данной работы нами были созданы синтетические генетические конструкции, содержащие последовательность чИФН-а-2Ь, модифицированную для экспрессии в бактериальной системе, и полигистидиновую последовательность.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы и плазмиды

Все манипуляции для клонирования вектора проводили в штамме E. coli Ш5а с генотипом F- ф80с1 lacZAM15 A (lacZYA-argF) U169 deoR recAl endAl hsdR17 hsdR17(r-, m+) phoA supE44 X- thi-1 gyrA96 relA1. Для изучения экспрессии полученных конструкций выбрали штамм BL21 (DE3) с генотипом F-ompT hsdSB (r-, m-) gal dcm (DE3).

В работе использовали экспрессионные векторы фирмы Novagen pET-26b(+) и pET-28a(+). На их основе сконструировали плазмиды pEI26-60, pEM26 и pEM28. Все плазмиды обладают канами-циновой устойчивостью.

Конструкция экспрессионных векторов

Ген чИФН-а-2Ь был искусственно синтезирован на основе синтетической последовательности, построенной с учетом частоты встречаемости кодирующих кодонов ДНК в геноме E. coli.

Для получения модифицированной конструкции (чИФН-а-2b-6His), содержащей один 6His аффинный домен, использовали праймеры INF1 (cat atg cat cac cat cac cat cac gcg gat gat ga gat aaa) и INFrev1 (ccg aat tct tct tgc gga aagc) (рис. 1).

На краевых участках гена были введены сайты гидролиза эндонуклеазами NdeI и XhoI, необходимые для последующего переклонирования кодирующего фрагмента в экспрессионные векторы рЕТ-26Ь(+) и рЕТ-28а(+).

Фрагменты чИФН-а-2Ь и чИФН-а-2Ь-6Шз были клонированы в промежуточный вектор pBlueKS. Для получения экспрессионных векторов фрагмент чИФН-а-2Ь был переклонирован в вектор рЕТ-26Ь(+), а фрагмент чИФН-а-2Ь-6Шз - в вектора рЕТ-2бЬ(+) и рЕТ-28а(+) по сайтам гидролиза эндонуклеазами NdeI и XhoI. Конструкции получили названия рЕ126-60, рЕМ26 и рЕМ28 соответственно (рис. 2).

Поиск бактериальных клонов, содержащих правильно сформированные вектора, проводили с помощью ПЦР. Для этого использовали праймеры: рЕТ1 (tat agg gga att gtg agcgg) рЕТ2 (gga tct cag tgg tgg tgg tg).

Экспрессия рекомбинантных белков

Штамм E. coli ВЬ21(ОЕ3), трансформированный соответствующей плазмидой (рЕ126-60, рЕМ26 и рЕМ28), культивировали в течение ночи в 20 мл среды LB (0,5 % дрожжевого экстракта (Sigma, США); 1 % триптона (Sigma, США); 1 % NaCl в воде) при 37 °С. 5 мл ночной культуры переносили в 35 мл среды SOC (0,5 % дрожжевого экстракта (Sigma, США); 2 % триптона (Sigma, США); 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl; 10 mM MgCl2; 20 mM глюкозы в воде), помещали на 37 °С до достижения 0De00=0,5-0,8, после чего добавляли 1РТС до концентрации 0,5 мМ. Далее пробы инкубировали при +15-18 °С в течение 7 ч. В качестве отрицательного контроля использовали нетрансформиро-ванный штамм E. coli BL21(DE3).

Приготовление лизатов клеток

После культивирования клетки переносили в 50-миллилитровые пробирки и центрифугировали 10 мин при 4000 g. Осадок ресуспендировали в 2 мл лизирующего буфера следующего состава: 20 mM Тгаиа рН 8,0; 500 mM NaCl; 0,1% Тгйоп X-100; 0,02 % азида Na; 1mM CaCl2; 0,1 mM PMSF.

Добавляли лизоцим до концентрации 10 мкг/мл. Инкубировали при +4 °С в течение 1 ч. Качество лизирования бактериальной суспензии улучшали проведением циклов замораживания-размораживания в жидком азоте.

Для удаления вязкости лизат обрабатывали ДНКазой (Силекс, Россия) 30 мин при 37 °С. Полученную смесь центрифугировали 10 мин при 16 000 g. Надосадочную жидкость и осадок хранили при -20 °С.

Очистка телец включения

Так как тельца включения обладают относительно высокой плотностью, их возможно отделить центрифугированием. После проведения лизиса и центрифугирования лизата полученный осадок в большой степени был обогащен тельцами включения, образованными чИФН-а-2Ь.

Для удаления растворимых белков бактериальной клетки проводили серию отмывок фосфатным буфером с 0,5М NaCl и 0,5% Tween20, с добавлением мочевины до 0,5 М; 2М и 4M в каждой последующей промывке соответственно. Для дальнейшей работы тельца включения растворяли в буфере 20 мМ ТгаНа; 100 мМ NaH2P03; 0,05% Triton X-100; 6М гуанидинхлорид (GuCl), рН 8,0. Растворение проводили в течение 3-5 ч при комнатной температуре с постоянным перемешиванием.

Аффинная хроматография

Растворенные отмытые тельца включения наносили на колонку с №2+-сефарозой, собирали фракцию белков на выходе с целью последующего анализа эффективности связывания чИФН-а-2Ь-6His и чИФН-а-2Ь-12Шз с сорбентом. Удалили загрязняющие белки с колонки путем промывания 10 объемами буферного раствора (100 mM NaH2PO4 10 mM Tris-HCl, 6 M GuCl, pH 8,0).

Рефолдинг целевого белка проводили на аффинной колонке, градиентно снижая концентрацию GuCl с 6 М до 0,5 М в течение 1,5-2 ч в присутствии окислительно-восстановительных агентов (глу-татиона окисленного и восстановленного) и инкубировали ночь при +4 °С. Рефолдированный чИфН-а-2Ь элюировали буферным раствором (100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 100 mM Imidazol, pH 7,0), нерефолдированный - раствором (100 mM NaH2PO4 10 mM Tris-HCl, 6 M GuCl, 150 mM Imi-dazol, pH 7,0).

Регенерацию колонки проводили с использованием 1М NaOH, это позволяло удалить белок, задержавшийся на колонке.

Полученные элюаты концентрировали, анализировали в ПААГ-электрофорезе. Идентификацию чИФН-а-2Ь проводили при помощи Вестерн-Блоттинга с антителами против ИФН-а (MMHA-2, PBL INTERFERON SOURSE, США).

Результаты и обсуждение

Конструкция экспрессионных векторов

В результате генно-инженерных манипуляций были получены три рекомбинантные плазми-ды, содержащие гены чИФН-а-2Ь (см. рис. 2):

1. pEI26-60 (содержит ген чИФН-а-2Ь, клонированный в плазмиду рЕТ26).

2. pEM26 (содержит ген чИФН-а-2b-6His, клонированный в плазмиду рЕТ26).

3. pEM28 (содержит ген чИФН-a-2b-12His клонированный в плазмиду рЕТ28).

Экспрессия рекомбинантных белков Полученные гибридные конструкции находятся под контролем сильного вирусного Т7 промотора и lac оператора, что позволяет достигать высокого уровня экспрессии в E. coli и обеспечивает надежную регуляцию транскрипции [6]. После индукции клетки штамма E. coli BL21(DE3), содержащие плазмиды pEI26-60, pEM26, и pEM28, продуцировали рекомбинантные белки размером приблизительно 17,5 кДа, 18,5 кДа и 20,0 кДа соответственно - рис. 3: (2; 5; 8).

Результаты нашей работы показали, что наличие полигистидинового домена на N-конце последовательности значительно увеличивает уровень экспрессии рекомбинантного ИФН-а-2Ь человека. При этом увеличение аффинной последовательности до 12His на N-конце несколько снижает ее (см. рис. 3: 2; 5; 8). Это соответствует литературным данным о положительном влиянии 6His аффинного домена на уровень экспрессии [2].

Для количественной оценки экспрессии целевого белка проводили сравнение интенсивности полос на электрофореграмме при помощи программы GeneTools (Syngene, США).

В целом рекомбинантные белки, содержащие полигистидиновую систему, составляют более 30% всех белков клетки. Это высокие показатели, дающие возможность последующего внедрения процесса в промышленную технологию.

Очистка рекомбинантных белков

Агрегация рекомбинантных эукариотических белков в процессе бактериальной экспрессии является результатом нарушения конформационной структуры белка. При этом происходит взаимодействие гидрофобных участков белковой последовательности с образованием белковых глобул. В процессе экспрессии целевой белок практически полностью агрегировался в виде телец включения, и частичная очистка от бактериальных белков проходила уже на этапе центрифугирования культуральных лизатов: целевой белок полностью оставался в осадке (рис. 3: 4; 7; 10). ИФН в виде телец включения плохо растворим, что сделало возможным проведение предварительной стадии очистки, путем отмывки телец включения. В ходе работы мы выяснили, что для чИФН-а-2Ь и чИФН-а-2Ь-12Шз необходимо пересмотреть состав буферов в сторону уменьшения концентрации мочевины до 2М, т.к. часть целевого белка терялась. С другой стороны, эта стадия необходима для чИФН-а-2Ь-6Шз, т.к. в последующем это увеличивает эффективность связывания белка с сорбентом и качество отмывки от белков бактериальной клетки. Чистота рекомбинантного белка после отмывки ТВ составляет около 80% (рис. 4).

Благодаря наличию в составе гибридного целевого белка аффинного домена, обладающего выраженным сродством к №2+-сефарозе, стало возможным использование на последующем этапе очистки аффинной хроматографи. После нанесения растворенных телец включения на колонку собирали фракцию с несвязавшимися с сорбентом белками, чтобы оценить эффективность сорбции целевого белка на колонку. Было показано, что чИФН-а-2Ь-6Шз полностью связывается с №2+-сефарозой, а основная часть бактериальных белков не задерживается на колонке (рис. 5: 2). После проведения серии отмывок наносили элюирующий буфер, посредством которого происходит разрушение связи между аффинным доменом и активными центрами и никелевым сорбентом. Элюаты собирали и оценивали при помощи ПААГ-электрофореза. Конечный продукт очищен более, чем на 90% (рис. 4: 8, рис. 5: 3; 4).

Аналогичные результаты были получены и для чИФН-а-2Ь-12Шз. Был сделан вывод, что наличие дополнительной гистидиновой последовательности не влияет значительно на эффективность посадки белка на колонку и емкость сорбента.

Рефолдинг

Проведение процесса рефолдинга гибридного белка интерферона в связанном с сорбентом состоянии представляет большой интерес. Для этой цели сочетание аффинных Шз-последовательностей и металл-хелатной хроматографии является оптимальным. Одним из важных преимуществ можно считать тот факт, что эффективность специфического связывания гибридного белка с активными группами на сорбенте происходит в присутствии высоких концентраций хао-тропных агентов, таких как гуанидин гидрохлорид. Подчеркнем, что при таком подходе обеспечивается пространственное разделение молекул рефолдируемо-го белка, исключая его аггрегацию. За счет компактного, но "зафиксированного" расположения молекул белка на сорбенте отпадает необходимость в больших объемов буферных растворов и сильных разведениях, присущих классической технологии рефолдинга. Еще одним положительным преимуществом рефолдинга на колонке стала возможность в дальнейшем производить ферментативное отщепление аффинного домена также непосредственно на колонке.

Синтезированный фрагмент чИФН-а-2Ь (ifn) cat

atg tgc gat ctg ccg cag acc cat agc ctg ggt agc cgt cgc acc ctg atg ctg ctg gcc cag atg cgt cgc att agc ctg ttt agc tgc ctg aaa gat cgt cac gat ttc ggc ttt ccg caa gaa gaa ttc ggt aac cag ttt cag aaa gcg gaa acc att ccg gtg ctg cat gaa atg atc cag cag att ttt aatctg ttc agc acc aaa gat agc tca gcg gca tgg gat gaa acc ctg ctg gat aaa ttt tat act gaa ctg tac cag cag ctg aac gat ctg gaa gcg tgc gtg att cag ggt gtt ggc gtg acc gaa acc ccg ctg atg aaa gaa gac agc att ctg gca gtt cgc aaa tat ttt cag cgt att acc ctg tat ctg aaa gaa aaa aaa tac tca ccg tgc gcg tgg gaa gtg gtt cgc gcc gaa att atg cgc agc ttt agc ctg agt acc aac ctg cag gaa agc ctg cgt agc aaa gaa taat ctcgag

Модифицированный фрагмент чИФН-а^Ь-His (mod) cat

atg cat cac cat cac cat cac gcg gat gat gac gat aää tgc gat ctg ccg cag acc cat agc ctg ggt a ctg ctg gcc cag atg cgt cgc att agc ctg ttt agc tgc ctg aaa gat cgt cac gat ttc ggc ttt ccg caa gaa gaa aaa gcg gaa acc att ccg gtg ctg cat gaa atg atc cag cag att ttt aat ctg ttc agc acc aaa gajagc tca gcg gca tgg gat gaa acc ctg

agc cgt cgc acc ctg atg tc ggt aac cag ttt cag

ctg gataaa ttt tat act gaa ctg tac cag cag ctg aac gat ctg gaa gcg tgc gtg att cag ggt gaa gac agc att ctg gca gtt cgc aaa tat ttt cag cgt att acc ctg tat ctg aaa gaa aaa aaa gcc gaa att atg cgc agc ttt agc ctg agt acc aac ctg cag gaa agc ctg cgt agc aaa gaa t

cat cac cat cac cat cac - 6His;

gcg gat gat gac gat aaa - сайт гидролиза белка энтеропептидазой.

tt ggc gtg acc gaa acc ccg ctg atg aaa ac tca ccg tgc gcg tgg gaa gtg gtt cgc

Рис. 1. Генетические последовательности, кодирующие чИФН-а-2Ь.

Ndel

XhoI

pEI26-60

.^anH^У

6His

чИФН-а-2Ь

I-

Ndel

h

XhoI

pEM26

Сайт гидролиза «.энтерокиназой (DDDDKL

— 6His - j 6His чИФН-а-2Ь [

г

XhoI

pEM28

Ndel Xh

Рис. 2. Плазмидные векторы, полученные в рамках данной работы для изучения экспрессии чИФН-а-2Ь в E. Coli.

Рис. 3. Электрофореграмма проб, полученных в результате центрифугирования лизатов бактериальных клеток (стрелки - положение целевого белка в лизатах).

1 - Лизат клеток BL21(DE3) без рекомбинантной плазмиды;

2-4 - Лизат (2), супернатант (3) и осадок (4) после центрифугирования лизата клеток BL21(DE3), экспрессирующих ИФН-а-2Ь; 5-7 - Лизат (5), супернатант (6) и осадок (7) после центрифугирования лизата клеток BL21(DE3), экспрессирующих ИФН-а-2Ь-6НЬ; 8-10 - Лизат (8), супернатант (9) и осадок (10) после центрифугирования лизата клеток BL21(DE3), экспрессирующих ИФН-а-2Ь-12Нв.

1 234 5678

Рис. 4. Электрофореграмма проб, полученных в результате отмывки чИФН-а-2Ь-6Шз.

1 - Лизат клеток БЬ21(ЭЕ3), экспрессирующих ИФН-а-2Ь-6Ы1э;

2 - Супернатант после центрифугирования лизата;

3-6 Последовательные отмывки телец включения. Супернатанты после центрифугирования;

7 - Отмытые тельца включения;

8 - ИФН-а-2Ь-6Ы1э после очистки на №2+колонке.

Рис. 5. Электрофореграмма элюатов, полученных после нанесения отмытых телец включения на колонку.

1 - Отмытые тельца включения ИФН-а-2Ь-6Ы1э, наносимые на колонку;

2 - Белки бактериальной клетки, не связавшиеся с сорбентом;

3 - Элюция целевого белка, первая фракция;

4 - Элюция целевого белка, вторая фракция.

1 2 3 4 5

14,4

Рис. 6. Электрофореграмма, иллюстрирующая результат гидролиза Ь-ЫЕР чИФН-а-2Ь-6Шз.

1 - Маркер весов;

2 - чИФН-а-2Ь-6Ы1э;

3 - чИФН-а-2Ь-6Ы1з после гидролиза Ь-ЫЕР;

4 - чИФН-а-2Ь (контроль).

5 - чИФН-а-2Ь-12Ы1з после гидролиза Ь-ЫЕР;

112 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПОЛИ-HIS.

Опираясь на проведенные ранее эксперимен- Такой участок, состоящий из простых литы, было решено проводить рефолдинг по следую- нейных аминокислот, не образующих жестких щей схеме: ТВ наносили на колонку в буферном структур, является конформационно гибким и по-растворе А (0,5М NaCl, 0,5 M Tris-HCl, 6 M GuCl, зволяет крупной молекуле энтерокиназы без помех 5mM Imidazol, 1mM Oxidezed Glutathione, 4mM подойти к сайту гидролиза. reduced Glutathione, pH 8,0), а затем градиентно в течение 2-3 ч снижали концентрацию гуанидин Заключение гидрохлорида в растворе, пропускаемом через колонку до 0,5М. Такой подход обеспечил эффектив- Наши исследования показали, что наличие ность рефолдинга до 70-80%. Следует отметить, полигистидиновой системы увеличивает уровень что для чИФН^^Ь-^Шз процент восстановления экспрессии рекомбинантного ИФН-а-2Ь человека конформации белка был несколько ниже (60-70 %). (рис. 3: 2; 5; 8). При этом дополнительные 6His не-Объяснить это можно размерами аффинного доме- сколько снижает ее. В литературе приводятся дан-на (12 His), образующего конформационно более ные об увеличении растворимости белка при вклю-жесткую структуру, мешающую правильному сво- чении ряда аффинных меток. рачиванию белка. Такой результат является доста- В исследованиях, описанных в данной ста-точно высоким по сравнению с литературными дан- тье, не наблюдалось какой-либо значимой разницы ными(40-50 %) и более чем интересным с точки зре- в эффективности растворения белка с полигисти-ния его использования для разработки производст- диновой последовательностью и без нее. В любом венных технологий очистки рекомбинантных белков случае в растворах присутствовал GuCl в концен-и интерферона человека в частности. трации 6М и процесс занимал около 3-5 ч. В исследованиях была также показана раз- Удаление полигистидинового домена ница в эффективности гидролиза энтерокиназой На заключительном этапе проводили расще- (рис. 6), о чем подробно обсуждалось выше. Для пление гибридного белка легкой цепью энтероки- чИФН-a-2b-12His она была на 10-20 % ниже, чем назы (L-HEP) [с целью удаления полигистидиново- для чИФН-a-2b-6His. го домена (6 His и 12 His)]. Эффективность гидро- На основании полученных результатов мы лиза гибридного белка в случае чИФН-a-2b-6His пришли к выводу, что в отношении уровня экс-составила порядка 50%, в случае чИФН-a-2b-12His прессии и эффективности очистки наиболее удачна - 40% (рис. 6). В соответствии с литературными конструкция с одним 6His на N-конце гибридного данным возможно было получить более высокие белка интерферона человека. цифры (80-90%). Невысокую эффективность гид- Дальнейшие исследования в отношении ролиза мы объясняем отсутствием в генетической масштабирования технологического процесса по-конструкции нейтрального полилинкера между лучения рекомбинантного белка планируется про-полигистидиновой последовательностью и сайтом водить именно с конструкцией, содержащей чИФН-отрезания энтерокиназой. a-2b-6His. Литература 1. Рафальский ВВ. Клиническое применение препаратов интерферона. - Смоленск, 1997. - С. 120. 2. Arnau J., Lauhtzen C, Petersen GE, Pedersen J. Current strategies for the use of affinity tags avd tag removal for the purification of recombinant proteins // Protein Expr Purif. - 2006. - 48. - P. 1-13. 3. Ascierto P.A., Kirkwood J.M. Adjuvant therapy of melanoma with interferon: lessons of the past decade // J Transl Med. - 2008. - 6. - P. 62-73. 4. Baccarani M, Rosti G, de Vivo A. et al. A randomized study of interferon-alpha versus interferon-alpha and low-dose arabinosyl cytosine in chronic myeloid leukemia // Blood. - 2002. - 99(5). - P. 1527-35. 5. Ferrantini M, Capone I., Belardelli F. Interferon-alpha and cancer: mechanisms of action and new perspectives of clinical use // Biochimie. -2007. - 89(6-7). - P. 884-93. 6. Jana S, Deb J.K. Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli // Appl Microbiol Bio-technol. - 2005. - 67(3). - P.289-98. 7. Mills E.J., Rachlis B, O'Regan C. et al. Metastatic renal cell cancer treatments: An indirect comparison meta-analysis // BMC Cancer. - 2009. - 27. - P. 9-34. 8. Neves F.O., Ho P.L., Raw I. et al. Overexpression of a synthetic gene encoding human alpha interferon in Escherichia coli //Protein Expr Purif. -2004. - 35. - P. 353-9. 9. Parmar S. andFlatanias L.C. Interferons: mechanisms of action and clinical applications // Curr Opin Oncol. - 2003. -15. - P.431-9. 10. Zachariou M. Affinity Chromatography / Methods and Protocols // Springer. - 2007. - P. 360. (окончание литературы к статье:Н.В. Голубцовой и соавт. «ПРОГНОСТИЧЕСКОЕЗНАЧЕНИЕ...») 10. Новиков ВВ., Евсегнеева И.В.. Новые дифференцировочные антигены человека, утвержденные на VII Международном воркшопе // Российский биотерапевтический журнал. - 2003. - Т. 2, № 3. - С. 3-6. 11. Новиков ВВ., Караулов А.В., Барышников А.Ю.. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы. - М.: изд-во МИА, 2008. - 243 с. 12. Сергеева Н.С, Мишунина М.П., Силина И.А. и др. Значение уровня сывороточного белка S-100 при меланоме // Российский онкологический журнал. - 2007. - № 4. - С. 13-6. 13. Сергеева Н.С, Лазутина Т.Н., Мишунина МП. и др. Определение белка S-100 как серологического опухолеас-социированного маркера при меланоме // Российский онкологический журнал. - 2008. - №2. - С. 19-22. 14. Bottoni U, Izzo P., Richetta A. et al S-100 serum level: a tumor marker for metastatic melanoma // Melanoma Res. -2003. - 13. - P. 427-9. 15. Contini P., Zochi M.R., Pierri I. et al. In vivo apoptosis of CD8 (+) lymphocytes in acute myeloid leukemia patients: involvement of soluble HLA-I and Fas Hgand // Leukemia. - 2007. - 2. - P. 253-60. 16. Puppo F, Indiveri F, Seudeletti M, Ferrone S. Soluble HLA antigens: new roles and uses // Immunol.Today. - 1997. -18(4). - P. 154-5. 17. Puppo F, Ghio M, Contini P. et al Immunoregulatory role of soluble HLA molecules: a new skin for an old subject? // Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). - 1998. - 46(3). - P. 157-60. 18. Henze G., Dummer R., Joller-Jtmelka H. et al. Serum S-100 - a marker for disease Monitoring in metastatic melanoma // Dermatology. - 1997. - 194. - P. 208-12.

№ 4/том 9/2010 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ