Разработка набора реагентов в формате ДНК-чипа для генотипирования штаммов Vibrio cholerae Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 579.843.1:579.25].083.1

Пудова Е.А., Маркелов М.Л., Дедков В.Г., Чеканова Т.А., Сажин А.И., Кирдяшкина Н.П., Бекова М.В., Девяткин А.А., Шипулин Г.А.

разработка набора реагентов в формате днк-чипа для ГЕнотипировлния штаммов ViBRЮ етЬЕРАЕ

ФБУН "Центральный НИИ эпидемиологии" Роспотребнадзора, 111123, Москва

Продолжение 7-й пандемии холеры, таксономическое разнообразие вовлеченных в пандемию штаммов Vibrio cholerae, а также постоянная опасность завоза заболевания на территорию Российской Федерации обусловливают необходимость разработки методов генной диагностики холеры, позволяющих за сравнительно короткое время максимально подробно охарактеризовать штаммы, выделяемые от пациентов или из окружающей среды. В статье представлена информация о создании набора реагентов для генотипирования возбудителей холеры с использованием ДНК-чипа. В состав ДНК-чипа были включены олигонуклеотидные зонды, позволяющие дифференцировать штаммы V.cholerae по серогруппам и био-варам, а также определить их патогенность. Один ДНК-чип позволяет генотипировать до 12 образцов одновременно, при этом время анализа без учета стадии выделения ДНК составляет 5 ч. В ходе работы было исследовано 23 штамма холерных и нехолерных вибрионов и показано полное соответствие результатов типирования на ДНК-чипе с ранее известными характеристиками штаммов. Таким образом, есть основания говорить о перспективности дальнейшей работы над набором реагентов и возможности последующего его применения в лабораториях регионального уровня и референсных центрах.

Ключевые слова: холера; генотипирование; ДНК-чип; набор реагентов.

E.A. Pudova, M.L. Markelov, V.G. Dedkov, T.A. Tchekanova, A.I. Sadjin, N.P. Kirdiyashkina, M.V. Bekova, A.A. Deviyatkin, G.A. Shipulin

THE DEVELOPMENT OF REAGENTS SET IN THE FORMAT OF DNA-CHIP FOR GENETIC TYPING OF STRAINS OF VIBRIO CHOLERAE

The central research institute of epidemiology of Rospotrebnadzor, 111123 Moscow, Russia

The necessity of development of methods of genic diagnostic of cholera is conditioned by continuation of the Seventh pandemic of cholera, taxonomic variability of strains of Vibrio cholerae involved into pandemic and also permanent danger of delivery of disease to the territory of the Russian Federation. The methods of genic diagnostic of cholera make it possible in a comparatively .short time to maximally minutely characterize strains isolatedfrom patients or their environment. The article presents information about working out reagents set for genetic typing of agents of cholera using DNA-chip. The makeup of DNA-chip included oligonucleotide probes making possible to differentiate strains of V. cholerae on serogroups and biovars and to determine their pathogenicity. The single DNA-chip makes it possible to genetically type up to 12 samples concurrently. At that, duration of analysis without accounting stage of DNA separation makes up to 5 hours. In the progress of work, 23 cholera and non-cholera strains were analyzed. The full compliance of DNA-chip typing results to previously known characteristics of strains. Hence, there is a reason to consider availability of further development of reagents set and possibility of its further application in laboratories of regional level and reference centers.

Keywords: cholera, genetic typing, DNA-chip, reagents set.

Введение. Ситуация по заболеваемости холерой в мире на начало 2013 г. остается неблагоприятной. По данным Роспотребнадзора, в 2012 г в мире зарегистрировано более 190 тыс. случаев заболевания [1]. Сведения о многочисленных крупных вспышках в разных странах мира и формировании новых эндемичных очагов позволяют говорить о продолжении 7-й пандемии холеры [2]. Глобальное распространение получили измененные штаммы Vibrio cholerae eltor, несущие в себе фрагменты классического генотипа и характеризующиеся повышенной патогенностью. В России и странах СНГ ситуация по заболеваемости холерой характеризуется как нестабильная. Это связно с постоянно существующей опасностью завоза инфекции из неблагополучных по холере стран, а также с риском распространения возбудителей холеры водным, пищевым и контактно-бытовым путем при снижении уровня санитарно-эпидемиологического благополучия.

В настоящее время в России зарегистрированы наборы реагентов для генетической характеристики штаммов холе-

Для корреспонденции:

Пудова Елена Александровна, науч. сотр. Адрес: 111123, Москва, ул. Новогиреевская, 3а E-mail: [email protected]

ры с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующей электрофоретической детекцией либо детекцией флюоресцентного сигнала в режиме реального времени. Однако данные методы имеют определенные ограничения. Так, детекция результатов ПЦР с помощью электрофореза характеризуется невысокой чувствительностью. Вместе с тем ПЦР в режиме реального времени при гораздо более высокой чувствительности имеет инструментальные ограничения, не позволяющие анализировать более 6 локусов в ходе одной реакции. На сегодняшний день все большее распространение получают методы генодиагностики с использованием ДНК-чипов. Особенностью этой технологии является возможность проведения одномоментного мультилокусного анализа исследуемых штаммов за сравнительно короткое время при высоких уровнях чувствительности и специфичности. Наравне с ПЦР ДНК-чипы можно применять для идентификации и генетического типирования возбудителей различных инфекций в профильных лабораториях Роспотребнадзора, Россельхознадзора и иного территориального и регионального уровня, а также в мобильных лабораториях специализированных противоэпидемических бригад [3].

Целью настоящей работы являлась разработка набора реагентов на основе ДНК-чипа, предназначенного для гено-типирования холерных вибрионов.

Таблица 1

Штаммы, использованные в работе

Штамм Предоставившее штамм учреждение Время и место выделения Источник выделения

V. cholerae eltor U-1336 (Огава) ГНЦ ПМБ, Оболенск НИ НИ

V. cholerae 569В (Инаба) То же НИ НИ

V. cholerae O139, U12 " " НИ НИ

V. cholerae 16348 " " НИ НИ

V. cholerae O1 33 Дакка РосНИПЧИ "Микроб", Саратов 1958 г., Пакистан Больной

V. cholerae eltor O1 M-878 То же 1971 г., Саратов "

V. cholerae eltor O1 M-818 1! II 1970 г., Балаково

V. cholerae eltor O1 В-23 Il II 1971 г., Волгоград Проба воды р. Волги

V. cholerae eltor O1 M-1067 Il II 1972 г., Волгоград Больной

V. cholerae eltor O1 M-1289 Il II 1994 г., Дагестан "

V. cholerae eltor O139 MO-45 Il II 1993 г., Индия "

V. cholerae eltor O139 P-16064 Il II 1993 г., Азов "

V. cholerae eltor O1 KM-26 Il II 1988 г. Вода открытого водоема

V. cholerae eltor O1 M-1447 Il II 2009 г., Элиста Проба воды Колонского пруда

V. cholerae eltor O1 M-1425 Il II 2003 г., Пермь Проба стоячей воды

V. cholerae eltor O139 M-534 Il II 2010 г., Челябинская область Проба сточных вод, Шелогино

V. cholerae O32 P-9741 Il II 1972 г., р. Махино Проба воды

V. alginolyticus 281 Il II 1976 г., Новороссийск Больной

V. damsela ATCC 33539 Il II 1997 г., Институт Пастера НИ

V. fluvialis ATCC 33809 Il II 1997 г., АТСС, США НИ

V. metschnikovii NCTC 8443 Il II 1997 г., Институт Пастера НИ

V. mimicus ATCC 33653 Il II То же НИ

V. vulnificus ATCC 27562 Il II 1997 г., АТСС, США НИ

Примечание. Здесь и в табл. 3: НИ - нет информации.

Материалы и методы. Материал для исследования был предоставлен Российским научно-исследовательским противочумным институтом "Микроб" (Саратов) и ГНЦ прикладной микробиологии (Оболенск) в виде препаратов очищенной ДНК штаммов V. cholerae и других (нехолерных) вибрионов, а также в виде инактивированных культур возбудителей холеры. Список штаммов, использованных в настоящей работе, приведен в табл. 1. Для выделения ДНК из инактивированных культур использовали набор реагентов РибоПРЕП (ЦНИИ эпидемиологии, Россия).

Дизайн праймеров и зондов. Для определения патоген-ности и таксономической принадлежности возбудителей холеры с помощью ДНК-чипа были выбраны следующие локусы генома холерных вибрионов: ctxA, tcpA, hlyA, wbfR, wbeT, rstR, rstC, ctxB. Дизайн олигонуклеотидных праймеров и зондов осуществляли с использованием программного пакета Vector NTI ("Invitrogen Corporation", США) и интернет-инструментов http://www.basic.northwestern.edu/biotools/ oligocalc.html и http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/ OligoAnalyzer. В состав одного из праймеров каждой пары был включен сайт узнавания для ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага T7. Праймеры и зонды были синтезированы в ЦНИИ эпидемиологии. Для иммобилизации на слайдах использовали олигонуклеотидные зонды, содержащие аминогруппу на 5'-конце. Структура выбранных праймеров и олигонуклеотидных зондов приведена в табл. 2.

Производство ДНК-чипа. Для производства ДНК-чипов использовали слайды VALS ("Cel Associates", США), представляющие собой микроскопное стекло размером 25x75x1 мм с альдегидным покрытием. Слайд содержал 12 зон (эрреев), в каждой из которых идентичным образом иммобилизованы в виде отдельных пятен (спотов) диаметром около 300 мкм

олигонуклеотидные зонды, комплементарные определенным локусам генома V. cholerae (рис. 1). Олигонуклеотидные зонды наносили на поверхность стекла с помощью плоттера s3 ("Scienion", Германия) для бесконтактного раскапывания на-нолитровых количеств растворов. Для того чтобы в область каждого эррея можно было внести отдельный исследуемый образец, на этапе гибридизации использовали 16-луночные трафареты (16-well incubation chamber, "Whatman", Германия), слайды с трафаретами помещали в рамки-держатели (FAST-Frame, "Whatman", Германия).

Амплификация. ПЦР-амплификацию проводили в формате "мультипрайм". Праймеры группировали в 2 пробирки по 5 пар в каждой. Таким образом, для каждого образца проводили две ПЦР-реакции. В состав реакционной смеси входили 10 мкл ИЦР-смеси^кю (ЦНИИЭ, Россия), 2,5 мкл 10х dNTP-mix (ЦНИИЭ, Россия), по 0,08 мкМ прямого и обратного праймеров и 1М бетаин. Объем реакции составлял 25 мкл. Амплификацию выполняли в термоциклере Терцик ("ДНК-Технология", Россия) по следующему протоколу: начальная денатурация при 94°С в течение 2 мин, 35 циклов амплификации (15 с - денатурация при 94°С, 25 с - отжиг праймеров при 60°С, 20 с - элонгация при 72°С), завершающий этап элонгации - 2 мин при 72°С.

Транскрипция. Транскрипцию ПЦР-продукта проводили с использованием ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7. В состав реакционного буфера входили 40 мМ трис-НО-буфера (pH 8,0), 6 мМ хлорида магния, 10 мМ хлорида натрия, 10 мМ DTT, по 0,25 мМ ATP, CTP и GTP (ЗАО "Био-сан", Россия), 0,2 мМ UTP (ЗАО "Биосан", Россия), 0,05 мМ biotin-UTP ("ДНК-Синтез", Россия), 50 ед. ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага T7 (ЦНИИЭ, Россия). Для проведения транскрипции в реакцию брали 10 мкл неочищенного ПЦР-

Таблица 2

выбранные локусы, праймеры и олигонуклеотидные зонды, использованные в днк-чипе для диагностики холеры

Локус

Значимость локуса для гено-типирования

Структура праймеров

Структура зонда (ов)

ctxA

wbeT wbfR hlyA

rstR(classic) rstR(eltor) rstC ctxB

Оценка патогенности

tcpA(eltor) То же

tcpA(classic)

Принадлежность к серо-группе О1

Принадлежность к серо-группе О139

Принадлежность к виду V. сЫ1егае

Принадлежность к классическому биовару или эльтор

Принадлежность к классическому биовару

Принадлежность к эльтор-биовару

То же

Принадлежность к классическому биовару или эльтор

Forw: aat tct aat acg act cac tat agg gag at att gct cca gca gca gat ggt t

Rev: atc gat gat ctt gga gca ttc cca ca

Forw: aat tct aat acg act cac tat agg gag a gct cag cgt gcg att gat tcg cag a

Rev: tac cag tga aag gat t(c/t)t ttg cct cat c

Forw: atc atc gtt cta ggc att atg ggg

Rev: a at tct aat acg act cac tat agg gag ttt tac cta aac

taa cca agc ctg aag

Forw: ata atc gaa act tca ttt aca atg gag ag

Rev: aat tct aat acg act cac tat agg gag a cac aga aag

ttc caa cgt ttg cac cga

Forw: aat tct aat acg act cac tat agg gag a cct acg ttt

ctg gtt tcg aag ctg gct

Rev: aac caa agg ctc atc tag atc cca gt

Forw: agt cgt ccg ttc tgt aaa gat gcc

Rev: a att cta ata cga ctc act ata ggg aga tcg tat aac

tgg ctc caa act gac g

Forw: att agg gat tta aga gtt gag aga gat c

Rev: a att cta ata cga ctc act ata ggg aga tcg act ctt

act tct cat cag caa ag

Forw: tga aga taa aag aaa ggc tag cca acc

Rev: a att cta ata cga ctc act ata ggg aga aag cac cat

gat tta aga tgc tct tgg

Forw: aca ctt taa tgg atg ttt acg ata gcc

Rev: a att cta ata cga ctc act ata ggg aga tta cag tga

tgg ctc agt caa tgc

Forw: tta cag ttt tac tat ctt cag cat atg

Rev: a att cta ata cga ctc act ata ggg aga ata cta att

gcg gca atc gca tga g

ctxA: NH2-C12- ttt ttt ttt ctc caa gct cta tgc tcc

tcpA(eltor): NH2-C12- ttt ttt ttt cca agg ctg acc aaa cca t

tcpA(classic): NH2-C12- ttt ttt ttt agc gtg cga ttg att cgc ag

wbeT: NH2-C12- ttt ttt ttt ccc aga gtg cag ttg aac

wbfR: NH2-C12- ttt ttt ttt ca tca cca

gac aag cat aca

hlyA(classic): NH2-C12- ttt ttt ttt agc cgg ctg atc aac tcg g hlyA(eltor): NH2-C12- ttt ttt ttt gcc ggc att cat ctg aat g

rstR(classic): NH2-C12- ttt ttt ttt tcc gaa tga ttg aat cac ttg

rstR(eltor): NH2-C12- ttt ttt ttt tca att gat gaa cta tgc gg

rstC: NH2-C12- ttt ttt ttt ata tct gcg ttc

agg cg

ctxB-115-C:

NH2-C12-ttttttttt aca aca cac aaa tac ata cgc

ctxB-115-C (inosin):

NH2-C12- ttt ttt ttt aca aca cai aaa tac

ata cgc

ctxB-115-T:

NH2-C12- ttt ttt ttt acc aca aca cac aaa tat ata cg

ctxB-115-T (inosin):

NH2-C12- ttt ttt ttt acc aca aca cai aaa

tat ata cg

ctxB-203-C:

NH2-C12-ttttttttt tgg tgc aac ttt tca agt

ag

ctxB-203-c (inosin): NH2-C12- ttt ttt ttt tgg tgc aac ttt tci agt ag

ctxB-203-T:

NH2-C12-ttttttttt tgg tgc aat ttt tca agt

ag

ctxB-203-T (inosin): NH2-C12- ttt ttt ttt tgg tgc aat ttt tci agt ag

продукта из каждой амплификационной пробирки. Общий объем реакции составлял 50 мкл. Реакцию проводили в течение 40 мин при 37оС.

Гибридизация. В состав реакционной смеси входили 300 мМ хлорида натрия, 30 мМ цитрата натрия (2х SSC, pH 7,0), 10% формамида, 20 мМ ЭДТА, 0,5% SDS и 10 мкл продукта транскрипции. Объем гибридизационной смеси, вносимой в одну ячейку, составлял 80 мкл. Гибридизацию проводили в течение 40 мин при 37оС и 300 об/мин с использованием термостатируемого шейкера («Biosan", Латвия). После трехкратной отмывки раствором, содержащим 0,75 М хлорида

натрия, 75 мМ цитрата натрия (5х SSC-буфер, pH 7,0) и 0,1% твин-20, слайды инкубировали со стрептавидином, меченным флюоресцирующим красителем Cyanine-5 ("Имтек", Россия) в течение 30 мин при 37оС и 300 об/мин с использованием термостатируемого шейкера.

Измерение флюоресцентного сигнала и учет результатов. Изображения ДНК-чипа получали с помощью флюоресцентного сканера MArS ("Ditabis", Германия). Уровни флюоресцентных сигналов от каждого спота оценивали с помощью программы ScanArray Express ("Perkin Elmer", США) а также специализированного программного обеспечения для

©©©@©©®®®® ©®®@©©®®®® ©©©@©©©©®®

®

®®®®®®®©@®

1эррей

ДНК-чип

1-ctxA

2-tcpA-eltor

3-tcpA-classic

4-WbeT

5-WbfR

6 - HlyA - classic

7 - HlyA - eltor

8 - rstR - classic

9 - rstR - eltor 10-rstC

11 - ctxB-115 - С (inosin)

12-ctxBllS-C

13-ctxB 115-T (inosin)

14 —CtxB 115-T

15 - CtxB 203 - С (inosin)

16-CtxB203-С

17-CtxB203-T (inosin)

18-CtxB 203

M - маркер границы эррея

Рис. 1. Схема ДНК-чипа и расположения олигонуклеотидных зондов в эррее Объяснения см. в тексте.

интерпретации сигналов флюоресценции "SCAN ARRAY PARSER" разработанного в ЦНИИЭ.

Подтверждение результатов гибридизации. Специфичность результатов гибридизационного анализа подтверждали посредством электрофоретической детекции продуктов ПЦР в 1,5% агарозном геле с добавлением бромистого этидия и последующего капиллярного секвенирования фрагментов на приборе Genetic Analyzer Abi Prism 3500xl ("Life Technologies", США).

Результаты и обсуждение. В результате настоящей работы был разработан набор реагентов на основе ДНК-чипа, позволяющий определять патогенность и таксономическую принадлежность штаммов V. cholerae. Общее время анализа без учета стадии выделения ДНК возбудителя составляло 5 ч, при этом на одном слайде можно одновременно исследовать до 12 образцов (4 лунки трафарета приходятся на область бар-кода).

Для повышения эффективности ДНК-чипа нами была введена стадия транскрипции. Продуктом амплификации при проведении ПЦР является двухцепочечная ДНК, которую перед гибридизацией на ДНК-чипе необходимо денатурировать. Перевод

кусы являются традиционными для формата ПЦР и хорошо описаны в литературе [4 5]. Для определения принадлежности к классическому или эльтор-биоварам нами были использованы 4 фрагмента: ЫуА, rstR, тС и СхВ.

Фрагмент ЫуА, дифференцирующий холерные вибрионы от нехолерных, может быть использован также для дифференциации классического биовара от эльтор, поскольку у представителей классического биовара в этом гене имеется делеция размером 11 нуклеоти-дов [6]. Нами была выбрана 1 пара праймеров на фрагмент гена ЫуА, содержащий делецию, и 2 зонда на области делеции, соответствующие классическому и эльтор вариантам.

Ген rstR, входящий в состав фрагмента RS2, имеет значительные различия в структуре классических и эльтор штаммов и является биоварспецифическим [7]. На локус rstR были выбраны 2 пары праймеров: для амплификации классического и эльтор вариантов. У вибрионов эльтор, кроме того, имеется фрагмент тС, отсутствующий у классических штаммов, следовательно, определение наличия этого локуса может послужить дополнительным маркером принадлежности к биовару эльтор.

Отдельное внимание следует уделить ге-нотипированию локуса сХхВ, входящему в состав профага СТХф и кодирующему субъединицу В холерного токсина. Ген сХкВ имеет протяженность 375 пар оснований. На основе ряда однонуклеотидных полиморфизмов выделяют несколько генотипов этого локуса. Среди возбудителей 7-й пандемии холеры выделены атипичные штаммы, несущие в себе ген rstR типа эльтор и ген сХхВ классического типа [8], поэтому одновременный анализ структуры этих фрагментов является крайне актуальным. Классический и эльтор варианты гена сХхВ (обозначаемые как сХхВ1 и СхВ3 соответственно) различаются всего двумя нуклео-тидами: в положении 115 [С/Т] и в положении 203 [С/Т]. Анализ однонуклеотидных замен с помощью гибридизации на ДНК-чипе представляет определенную сложность, поскольку при наличии всего одного мисс-матча стабильность гетеродуплекса может оставаться достаточно высокой и флюоресцентный сигнал будет получен при любом варианте генотипа. Следовательно, вывод о принадлежности к тому или иному генотипу можно сделать на основании сравнения сигналов флюоресценции с двух зондов,

ДНК в одноцепочечную форму традиционно осуществляется путем прогревания или обработки щелочью. По предлагаемой нами методике получение одноцепочечного продукта за счет стадии синтеза РНК с помощью ДНК-зависимой РНК-полимеразы позволяет увеличить эффективность гибридизации на ДНК-чипе и сократить ее длительность.

На рис. 2 отражена схема генотипирования холерных вибрионов на основе выбранных для этого локусов. Подробнее следует остановиться на определении биовара, поскольку остальные ло-

Патогенность штамма

ctxA-определение наличия

tcpA-определение наличия

Принадлежность к виду Vibrio cholerae

hlyA— определение наличия

Принадлежность к серогруппам 01 или 0139

wbeT— определение наличия

wbfR-определение наличия

Принадлежность к биоварам: классический, эльтор или атипичный эльтор

hlyA-определение структуры

rstR-определение структуры

rstC-определение наличия

ctxB-определение структуры

Рис. 2. Принцип выбора локусов для генотипирования холерных вибрионов.

Таблица 3

результаты генотипирования 23 штаммов рода vibrio с помощью днк-чипа

№ Штамм Характеристика Патоген-ность Серогруп-па Биовар ctxB

ctxA tcpA wbeT/wbfR rstc rstR hlyA ctxB ll5 ctxB 203

l Vibrio cholerae eltor U-1336 (Огава) ctxA+ wbeN+ hlyAeltor/He 01 + + + wbeT + eltor eltor c c

2 Vibrio cholerae 569B (Инаба) ctxA+ wbeN+ hlyAeltcr/He 01 - + + wbeT - classic classic c c

3 Vibrio cholerae O139, u12 ctxA+ tcpA+ wbfR+ hlyAeltcr/He 01 + + + wbfR + eltor eltor T T

4 Vibrio cholerae 16348 ctxA+ tcpA+ wbeN+ hlyAeltcr/He 01 - + + wbeT - classic classic c c

5 Vibrio cholerae cholerae O133 Дакка ctxA+ tcpA+ wbeN+ hlyAeltcr/He 01 - + + wbeT - classic classic c c

б Vibrio cholerae eltor O1 M-878 ctxA+ tcpA+ wbeN+ hlyAeltcr/He01 + + + wbeT + eltor eltor T T

7 Vibrio cholerae eltor O1 M-818 ctxA+ tcpA+ wbeN+ hlyAeltcr/He 01 + + + wbeT + eltor eltor T T

8 Vibrio cholerae eltor O1 B-23 ctxA+ tcpA+ wbeN+ hlyAeltcr/He 01 + + + wbeT + eltor eltor T T

9 Vibrio cholerae eltor O1 M-1067 ctxA+ tcpA+ wbeN+ hlyAeltcr/He 01 + + + wbeT + eltor eltor T T

l0 Vibrio cholerae eltor O1 M-1289 ctxA+ tcpA+ wbeN+ hlyAeltcr/He 01 + + + wbeT + eltor + classic eltor c С

ll Vibrio cholerae eltor O139 MO-45 ctxA+ tcpA+ wbfR+ hlyAeltcr/He 01 + + + wbfR + eltor eltor T T

l2 Vibrio cholerae eltor O139 P-16064 ctxA+ tcpA+ wbfR+ hlyAeltcr/He 01 + + + wbfR + eltor eltor T T

l3 Vibrio cholerae eltor O1 KM-26 ctxA- tcpA- wbeN+ hlyAeltcr/He 01 + - - wbeT - eltor eltor - -

l4 Vibrio cholerae eltor O1 M-1447 ctxA- tcpA- wbeN+ hlyAeltcr/He 01 + - - wbeT - eltor eltor - -

l5 Vibrio cholerae eltor O1 M-1425 ctxA- tcpA- wbeN+ hlyAeltcr/He 01 + - - wbeT - - eltor - -

^ Vibrio cholerae eltor O139 M-534 ctxA- tcpA- wbfR+ hlyAeltcr/He 01 + - - wbfR - - eltor - -

l7 Vibrio cholerae O32 P-9741 ctxA- tcpA- wbeN- wbfR- hlyAeltcr/He 01 + - - - - - eltor - -

l8 V. alginolyticus 281 НИ - - - - - - - -

l9 V. damsela ATCC 33539 НИ - - - - - - - -

20 V. fluvialis ATCC 33809 НИ - - - - - - - -

2l V. metschnikovi NCTC 8443 НИ - - - - - - - -

22 V.mimicus ATCC 33653 НИ - - - - - - - -

23 V. vulnificus ATCC 27562 НИ - - - - - - - -

соответствующих двум разным вариантам полиморфизма. Для того чтобы получить достоверную разницу между сигналами, нами были протестированы несколько вариантов зондов: зонды, полностью комплементарные исследуемым фрагментам гена ctxB; зонды, содержащие мутацию в следующем за полиморфизмом положении; зонды, содержащие мутацию на расстоянии 5-6 нуклеотидов от места полиморфизма; зонды, содержащие инозин на расстоянии 5-6 нуклеотидов от места полиморфизма. Общая длина комплементарной части зондов равнялась 19 основаниям. Эмпирически за достоверную разницу нами было принято превышение сигнала флюоресценции одного зонда из пары над другим в 2 раза и более. Наибольшая информативность была показана для одновременного использования

пар зондов, полностью комплементарных ДНК холерного вибриона, и пар зондов, содержащих инозин.

В ходе работы нами было протестировано 23 образца ДНК холерных и нехолерных вибрионов. Результаты представлены в табл. 3.

По результатам генотипирования холерных штаммов с помощью ДНК-чипа к виду V. cholerae по наличию гена hlyA были отнесены 17 штаммов (№ 1-17). К эпидемиологически значимым по наличию локусов tcpA и ctxA были отнесены 12 образцов (№ 1-12). К группе О1 по наличию фрагмента wbeT были отнесены 12 штаммов (№ 1, 2, 4-10, 13-15), к группе О139 по наличию фрагмента wbfR - 4 штамма (№ 3, 11, 12, 16). К классическому биовару по наличию классического варианта локуса rstR и классического варианта ctxB были от-

несены 3 штамма (№ 2, 4, 5). К биовару эльтор по наличию фрагмента rstR типа эльтор следует отнести 11 штаммов (№ 1, 3, 5-13). При этом штамм № 1 (V cholerae eltor U-1336 (предоставлен ГНЦ ПМБ, Оболенск) содержит фрагмент rstR типа эльтор и классический вариант локуса ctxB, на основании чего он отнесен к измененным штаммам эльтор. Штамм № 10 (V. cholerae eltor 01 М-1289) (предоставлен РосНИПЧИ "Микроб", Саратов) содержит одновременно и классический, и эльтор варианты фрагмента rstR, а также классический вариант ctxB, что соответствует характеристикам гибридных штаммов холеры [9].

Анализ однонуклеотидных замен в локусе ctxB с помощью ДНК-чипа в некоторых случаях остается трудно решаемой задачей. С целью увеличения разности уровней флюоресценции помимо введения в состав зондов инозина целесообразно также уменьшить длину самих зондов. Однако существуют штаммы возбудителей холеры, которые несут в себе одновременно как классический, так и эльтор варианты гена ctxB [9], и в этом случае генотипирование полиморфизмов в локусе ctxB с помощью ДНК-чипа может оказаться затруднительным или невозможным.

В дальнейшем предполагается оптимизировать зонды для определения полиморфизмов локуса ctxB, а также включить в состав ДНК-чипа зонды для определения антибиотикорези-стентности холерных штаммов.

Заключение. В большинстве случаев результаты геноти-пирования возбудителей холеры, полученные с помощью тестового варианта ДНК-чипа, совпадали с характеристиками исследуемых холерных штаммов. В дальнейшем предстоит определить чувствительность ДНК-чипа, а также включить в его состав локусы для определения антибиотикорезистентно-сти возбудителей. Наши результаты дают основание предполагать, что разрабатываемый ДНК-чип может впоследствии найти применение в референсных центрах и лабораториях регионального уровня для генодиагностики холерных штаммов, полученных из внешней среды или от пациентов.

Работа проводилась в 2012-2013 гг в рамках Федерально-целевой программы "Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (20092014 годы)".

ЛИТЕРАТУРА

1. Об эпидемиологической ситуации по холере в мире и прогнозе на 2013 год. М.: Роспотребнадзор. Available at: http://67. rospotrebnadzor.ru/c/journal/view_article_content?groupId= 10156 &articleId=152112&version=1.0

2. Москвитина Э.А., Мазрухо А.Б., Адаменко О.Л., Арешина О.А., Назаретян А.А., Кругликов В.Д. и др. Характеристика эпидемиологической обстановки по холере в мире. Проблемы особо опасных инфекций. 2013; 1: 11-7.

3. Куличенко А.Н., Кутырев В.В., Таран А.В. Проблемные вопросы развития молекулярной диагностики особо опасных инфекций. В кн.: Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика - 2010". М.; 2010; ч. 1: 397-400.

4. Huang J., Zhu Yu., Wen H., Zhang J., Huang Sh., Niu J. et al. Quadruplex real-time PCR assay for detection and identification of Vibrio cholerae 01 and 0139 strains and determination of their toxigenic potential. Appl. Environ. Microbiol. 2009; 75 (22): 6981-85.

5. Faruque Shah M., Nair Balakrish G., eds. Vibrio cholerae: genomics and molecular biology. Poole: Horizon Scientific Press; 2008: 101-23.

6. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., ред. Лабораторная диагностика особо опасных инфекций. Практическое руководство. М.: Медицина; 2009.

7. Смирнова Н.И., Челдышова Н.Б., Горяев А.А., Лозовский Ю.В., Кутырев В.В. Эволюция генома Vibrio cholerae: пути формирования атипичных штаммов. Проблемы особо опасных инфекций. 2008; вып. 97: 5-11.

8. Safa A., Nair Bakarish G., Kong R.Y.C. Evolution of new variants of Vibrio cholerae 01. Cell. 2009; 18 (1): 46-54.

9. Смирнова Н.И., Горяев А.А., Кутырев В.В. Эволюция генома возбудителя холеры в современный период. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2010; 4: 11-9.

REFERENCES

1. About the epidemiology of cholera in the world and predictions for 2013. Available at: http://67.rospotrebnadzor.ru/c/journal/view_ar-ticle_content?groupId=10156&articleId=152112&version=1.0 (in Russian)

2. Moskvitina E.A.,Mazrukho A.B., Adamenko O.L, Areshina O.A., Nazaretyan A.A., Kruglikov V.D. et al. Characteristics of the epidemiologic situation for cholera in the world. Problemy osobo opas-nykh infektsiy. 2013; 1: 11-7. (in Russian)

3. Kulichenko A.N., Kutyrev V.V., Taran A.V. Development problems of molecular diagnostics of extremely dangerous infections. In: Proc. 7-th All-Russian conference «Molecular Diagnostics - 2010». Мoscow; 2010; part 1: 397-400. (In Russian)

4. Huang J., Zhu Yu., Wen H., Zhang J., Huang Sh., Niu J. et al. Quadruplex real-time PCR assay for detection and identification of Vibrio cholerae 01 and 0139 strains and determination of their toxi-genic potential. Appl. Environ. Microbiol. 2009; 75 (22): 6981-85.

5. Faruque Shah M., Balakrish Nair G., eds. Vibrio cholerae: genomics and molecular biology. Poole: Horizon Scientific Press; 2008: 101-23.

6. Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., eds. Laboratory diagnosis of especially dangerous infections. Practical guide. Moscow: Medizina; 2009. (In Russian)

7. Smirnova N.I., Cheldyshova N.B., Goryaev A.A., Lozovskiy Yu.V., Kutyrev V.V. The evolution of the genome of Vibrio cholerae: the way of formation of atypical strains. Problemy osobo opasnykh in-fektsiy. 2008; 97: 5-11. (In Russian)

8. Safa A., Bakarish Nair G., Kong R. Y. C. Evolution of new variants of Vibrio cholerae 01. Cell. 2009; 18 (1): 46-54.

9. Smirnova N.I., Goryaev A.A., Kutyrev V.V. The evolution of the genome of Vibrio cholerae in the modern period. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya. 2010; 4: 11-9. (In Russian)

Поступила 10.10.13