CC BY-ND
18
22
ЗНиСО
МАЙ №5 (254)
Сухарева Л.М. и др. Состояние здоровья московских школьников и факторы, влияющие на его формирование / Л.М. Сухарева, И.К. Раппопорт, М.А. Поленова //Здоровье населения и среда обитания. 2014. №3 (252). С. 28 -30.
Шишова А. В. и др. Способ оценки хронобиологического типа у детей / А.В. Шишова, Л.А. Жданова, С.И. Ман-дров //Изобретения. Полезные модели. 2010. № 28 (I ч.). С. 23.
Шишова А.В. Формирование здоровья детей 7—11 лет и дифференцированная система их медико-педагогического
сопровождения при различных программах обучения: ав-тореф. дис. ... докт. мед. наук. Иваново, 2011. 48 с.
Контактная информация:
Ланина Елена Александровна, тел.: 8 (4932) 30-02-28, e-mail: shishova@inbox.ru
Contact information: Lanina Elena, phone: (4932) 30-02-28, e-mail: shishova@inbox.ru
r-b
УДК 616.932:616—07
АПРОБАЦИЯ АМПЛИФИКАЦИОННЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ В РАЗЛИЧНЫХ РЕГИОНАХ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
А.С. Абдрашитова, Н.А. Осина, И.А. Касьян, А.М. Сеничкина, С.А. Щербакова ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора, г. Саратов
Проведена идентификация 177 штаммов холерных вибрионов, выделенных из воды открытых водоемов и от людей с 2009—2012 гг. на различных территориях Российской Федерации методом ПЦР с использованием трех генодиагностических препаратов. Показана эффективность данных амплифи-кационных тест-систем при определении таксономического положения и эпидемической значимости изученных культур вибрионов. Результаты идентификации, по данным молекуляно-генетического и бактериологического анализа, полностью совпали. Ключевые слова: холерный вибрион, идентификация, генетическая характеристика, ПЦР, генодиагностические препараты.
A.S. Abdrashitova, N.A. Osina, I.A. Kasyan, A.M. Senichkina, S.A. Shcherbakova □ TESTING OF AMPLIFICATION ASSAYS FOR THE IDENTIFICATION OF CHOLERA VIBRIOS, ISOLATED IN DIFFERENT REGIONS OF RUSSIAN FEDERATION □ FGHI «Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe» of the Rospotrebnadzor, Saratov □ Identification of 177 cholera vibrio strains isolated from surface waters and humans in 2009—2012 in the different territories of the Russian Federation by means of PCR has been carried using three assays for gene diagnostics. Amplification assays used demonstrated their efficiency for the determination of taxonomic status and epidemical significance of the strains under study. The results of identification by molecular genetic and bacteriological analysis fully coincided. Key words: Vibrio cholerae, identification, genetic characteristics, PCR, assay for gene diagnostics.
В большинстве случаев решающую роль в передаче возбудителя холеры играет водный фактор, в результате загрязнения поверхностных водоемов неочищенными, хозяйственно-бытовыми сточными водами. В результате этого возникает необходимость постоянного мониторинга объектов окружающей среды (в том числе воды поверхностных водоемов, используемых для питьевых и хозяйственных целей) на наличие возбудителя холеры [7]. В настоящее время идентификация выделенных культур холерных вибрионов проводится в соответствии с действующими нормативными документами [2, 3]. Для выполнения таких исследований предусмотрено использование бактериологических, иммунологических, биологических и молекулярно-генетических методов. Для выявления и характеристики штаммов возбудителя холеры методом ПЦР в последние годы разработаны и зарегистрированы три новых генодиагностических препарата: «АмплиСенс Vibrio cholerae — FL» (рег уд. № ФСР 2011/11139), «Ген Vibrio cholerae — идентификация — РЭФ» (рег. уд. № ФСР 2012/13430), «Ген Vibrio cholerae вариант ctxB-РЭФ» (рег. уд. № ФСР 2012/13427), которые позволяют определить не только эпидемическую значимость патогена, но и его таксономическое положение (принадлежность к серогруппам О1, О139, биовару). Данных об эффективности применения препаратов при исследовании штаммов холерных вибрионов, выделенных в различных регионах Российской Федерации, не достаточно. Вопросы адаптации амплификационных технологий для выявления и идентификации возбуди-
телей инфекционных болезней до сих пор остаются крайне важными [1—8].
Цель работы: оценка диагностической эффективности новых генодиагностических препаратов при идентификации штаммов холерных вибрионов, выделенных из водных экосистем и от больных людей в различных регионах Российской Федерации.
Материалы и методы. Для исследования использовали 177 штаммов холерных вибрионов, выделенных на территории Российской Федерации с 2009—2012 гг., их них 155 культур изолированы в Республике Калмыкия, 5 — в Республике Татарстан, 7 — в Челябинской области, 8 — в Астраханской области, 2 — в г. Химки.
Идентификацию штаммов холерных вибрионов с помощью бактериологического и иммунологического анализа осуществляли в соответствии с действующими нормативными документами [2]. ПЦР проводили в соответствии с инструкциями к диагностическим препаратам на приборах RotoGene 6000 (Corbett Research), Терцик МС-2 (ДНК-технология), БИС 111 (ООО «БИС-Н»).
Секвенирование фрагментов ДНК осуществляли на автоматическом секвенаторе «ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer» в соответствии с рекомендациями производителя.
Результаты исследований. По своему назначению наборы реагентов «АмплиСенс Vibrio cholerae — FL» и «Ген Vibrio cholerae — идентификация — РЭФ» позволяют выявить ДНК холерных вибрионов и определить эпидемическую значимость и таксономическое положение патогена методом
МАЙ № (254)
23
r-Ь
ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным и электрофоретическим учетом результатов, соответственно.
Для установления эпидемической значимости штаммов возбудителя холеры в обоих препаратах выбраны йхА и 1ерА гены, отвечающие за синтез холерного энтеротоксина и токсин-коррегулируемых пилей адгезии, соответственно, и являющиеся основными генетическими маркерами данного признака. Определение принадлежности вибрионов к О1 серогруппе осуществляется за счет выявления генов шЪеТ и «Ъе^ расположенных в кластере генов gmd - «ЪеО, «Ъе^ шЪеТ и шЪеи, который, по данным ТашазаЫ & а1. [8], встречаются только у холерных вибрионов О1 се-рогруппы. Для дифференциации биоваров предложено использование ЫуА гена, имеющего 11 п.н. делецию у штаммов V. ско!егае классического биовара, а О139 серогруппы — гена «ЪЖ, встречающегося только у культур V. ско!егае О139.
Поэтому в нашей работе с использованием этих препаратов была определена эпидемическая значимость и таксономическое положение (серо-группа и биовар) 177 штаммов холерных вибрионов, выделенных из различных источников на территории Российской Федерации. Результаты исследования представлены в таблице.
Таблица. Результаты исследования штаммов холерных вибрионов с помощью амплификационных тест-систем
Регион выделения Источник выделения Количество штаммов «АмплиСенс Vibrio cholerae — FL» «Ген Vibrio cholerae — идентификация — РЭФ»
ctxA tcpA hlyA wbeT g •I ctxA tcpA wbeN O wbfR
Республика Калмыкия В 132 0 0 132 132 0 0 0 132 132 0
В 20 0 20 20 20 0 0 20 20 20 0
Ч 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0
В 2 0 0 2 0 0 0 0 0 2 0
Республика Татарстан В 5 0 0 5 5 0 0 0 5 5 0
Челябинская область В 6 0 0 6 0 0 0 0 0 6 0
В 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0
Астраханская область В 5 0 0 5 5 0 0 0 5 5 0
Ч 3 0 0 3 0 0 0 0 0 3 0
г. Химки Ч 2 2 2 2 2 0 2 2 2 2 0
Примечание: * В — пробы воды открытых водоемов, Ч — пробы от больных людей
Установлено, что из 155 культур холерных вибрионов, выделенных в Республике Калмыкия, у 132 изолятов отмечена амплификация фрагмента Ы1уА гена, в том числе и участка специфичного для холерных вибрионов биовара эльтор, «ЪеТ и wbeN генов, и отсутствие образования фрагментов генов йхА, 1ерА и «ЪЖ На основании полученных результатов данные штаммы холерных вибрионов идентифицированы как V. ско!ете О1 серогруппы биовара эльтор эпидемически безопасные (йхАЧерА-). Для 21 культуры вибрионов из этого региона, изолированных из воды открытых водоемов и от больного с острым инфекционным гастероэнтеритом, характерно наличие генов Ы1уА, «ЪеТ, «Ье^ 1ерА и отсутствие — йхА, «ЪЖ,
что указывает на их принадлежность к V. cholerae O1 eltor (ctxA-tcpA+) [4]. Специфичность ампли-конов tcpA гена была подтверждена их секвени-рованием. Во всех случаях нуклеотидная последовательность образовавшихся фрагментов tcpA гена полностью совпадала с таковой у штамма V. cholerae N16961 (GenBank № AE 003853.1). Два оставшихся штамма идентифицированы как V. cholerae не-О1 не-О139 серогруппы эпидемически безопасные (ctxA-tcpA-), поскольку при их исследовании выявлена амплификация только фрагмента hlyA гена.
Наличие амплификации участка hlyA гена, специфичного для холерных вибрионов биовара эльтор, а также генов wbeT и wbeN из кластера генов, отвечающих за синтез О1 антигена возбудителя холеры, отмечено при исследовании 11 штаммов V. cholerae, выделенных на территории Республики Татарстан, Челябинской и Астраханской областей. У всех штаммов амплификации ctxA и tcpA генов не выявлено. На основании полученных данных, эти штаммы идентифицированы как V. cholerae О1 серогруппы биовара эльтор эпидемически безопасные (ctxA-tcpA-). При анализе ДНК 9 штаммов холерных вибрионов, изолированных из объектов окружающей среды в Челябинской области и от человека в Астраханской области, зафиксировано образование специфичного фрагмента только hlyA гена, что указывает на их принадлежность к V. cholerae не-О1 не-О139 серогруппы эпидемически безопасные (ctxA-tcpA-).
Специфическая амплификация ctxA и tcpA генов выявлена при исследовании 2 культур возбудителя холеры, выделенных от больных в г. Химки. У этих штаммов также отмечено наличие фрагментов hlyAeltor/не- 01 гена, wbeT и wbeN генов, и отсутствие — wbfR гена. Исходя из результатов анализа оба штамма относятся к V. cholerae О1 серогруппы биовара эльтор эпидемические опасные (ctxA+ tcpA+). Наличие у двух культур от больных фрагмента ctxA гена было подтверждено также при проведении исследований с помощью тест-системы «ГенХол».
При использовании набора реагентов «Ген Vibrio cholerae вариант ctxB-РЭФ», показано, что оба изолята являются токсигенными генетически измененными по ctxB гену вариантами холер -ных вибрионов О1 серогруппы биовара эльтор. Результаты исследования были полностью подтверждены при секвенировании ctxB гена у этих штаммов возбудителя холеры — выявлена ctxB1 аллель.
Данные по идентификации изученных культур возбудителя холеры с помощью ПЦР при использовании новых генодиагностических пре-
24
ЗНиСО
МАЙ №5 (254)
паратов в 100 % случаях совпали с результатами бактериологического анализа.
Таким образом, проведенная апробация новых препаратов для генной диагностики холеры: «АмплиСенс Vibrio cholerae — FL», «Ген Vibrio cholerae — идентификация — РЭФ», «Ген Vibrio cholerae вариант ctxB-РЭФ» при исследовании штаммов холерных вибрионов, выделенных на различных территориях Российской Федерации, показала, что данные наборы реагентов позволяют быстро и точно определить таксономическое положение (принадлежность к О1 и 0139 серо-группе, биовар) и эпидемическую значимость вибрионов, а также принадлежность эпидемически значимых штаммов V. cholerae к генетически измененным по ctxB гену вариантам. Представляется перспективным применение данных препаратов в лабораториях территориального и регионального уровней при проведении мониторинга водных экосистем и при исследовании биологического материала от людей, что будет способствовать сокращению сроков получения ответа о наличии в пробах токсигенных и эпидемически значимых штаммов холерных вибрионов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ваганова А.Н. и др. Адаптация полимеразной цепной реакции для диагностики лептоспироза и эпидемиологического надзора за лептоспирозной инфекцией / А.Н. Ваганова, Н.А. Стоянов, Н.К. Токаревич //Здоровье населения и среда обитания. 2012. № 1 (226). С. 42—44.
Лабораторная диагностика холеры: МУК 4.2.2218—07. М., 2007.
Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней: МУК 4.2.2870—11. М., 2011.
Осина Н.А. и др. Результаты мониторинга холерных вибрионов в водных экосистемах на территории Республики Калмыкия / Н.А. Осина, Т.Б. Каляева, Т.В. Бугор-кова, И.А. Касьян, Н.Ф. Оброткина //Здоровье населения и среда обитания. 2013. № 2 (239). С. 28-30. Семиотрочев В.Л. и др. Классификация заболеваний, вызванных микроорганизмами рода Vibrio / В.Л. Семиотро-чев, Ю.З. Ривкус //Здоровье населения и среда обитания. 2012. № 2 (227). С. 32—36.
Сизова Ю.В. и др. Роль температуры в реализации анти-лизоцимной активности холерных вибрионов / Ю.В. Сизова, И.Я. Черепахина, Е.В. Сизова, В.В. Балахнова //Здоровье населения и среда обитания. 2013. № 5 (242). С. 30—32.
Черкасский Б.Л. и др. Взаимосвязь систем эпидемиологического надзора и социально-гигиенического мониторинга / Б.Л. Черкасский, Е.Н. Беляев //Эпидемиол. и инфекцион. болезни. 2003. № 4. С. 8—11. Yamasaki S. et al. Distribution of Vibrio cholerae O1 antigen biosynthesis genes among O139 and other non-O1 serogroups of Vibrio cholerae / S. Yamasaki, S. Garg, G.B. Nair, Y. Takeda //FEMS Microbiol. Letters. 1999. Vol. 179. P. 115—121.
Контактная информация:
Абдрашитова Адиля Саберьжановна, тел.: 8 (8452) 51-52-11, 8 (917) 315-46-09, e-mail: rusrapi@microbe.ru
Contact information:
Abdrashitova Adilja,
phone: 8 (8452) 51-52-11, 8 (917) 315-46-09, e-mail: rusrapi@microbe.ru
УДК 616.9-036.2
ХРОНИЧЕСКИЕ ДИФФУЗНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ ПЕЧЕНИ И АМБУЛАТОРНАЯ ПОМОЩЬ
О.С. Саурина1, А.Б. Бочкарев2, А.С. Макарян3, Л.В. Максименко3, Д.И. Кича3, А.В. Иваненко4 'ФГБОУ ВПО «Орловский государственный университет», г. Орел 2ГУЗ Поликлиника № 2, г. Орел 'Российский университет дружбы народов, г. Москва 4ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве» Представлены клинико-организационные аспекты амбулаторно-поликлинической помощи пациентам с хроническими диффузными заболеваниями печени и эффективность их лечения, расширение доступа к специфической противовирусной терапии. Проанализированы результаты эластографии 63 пациентов с хроническими вирусными гепатитами в Орловской области. Своевременная диагностика стадии фиброза позволяет своевременно выделять группы риска по неблагоприятным исходам ХВГ и определять показания к противовирусному лечению. Ключевые слова: клинико-организационные аспекты; амбулаторно-поликлиническая помощь; хронические диффузные заболевания печени; фиброз печени; эластография; лекарственная устойчивость.
O.S. Saurina, A.B. Bochkarev, A.S. Makaryan, L.V. Maksimenko, D.I. Kicha, A.V. Ivanenko □ CHRONIC DIFFUSE LIVER DISEASES AND OUTPATIENT CARE □ Federal public budgetary educational institution of higher education «Oryol state university». Oryol; State Healthcare Institution Policlinic No. 2. Oryol; Russian university of friendship of the people, Moscow; Federal budgetary healthcare institution «The hygiene and epidemiology center in the city of Moscow» □
The study shows the clinical and organizational aspects of outpatient care for patients with chronic diffuse liver diseases and the effectiveness of their treatment, increased access to specific antiviral therapy. The results of elastography 63 patients with chronic viral hepatitis (CVH) in the Oryol region. Early diagnosis of fibrosis stage allows to allocate risk for adverse outcomes of chronic viral hepatitis and to determine the indications for antiviral treatment. Key words: clinical and organizational aspects, outpatient care, chronic diffuse liver disease, fibrosis of the liver elastography, drug resistance.
Хронические диффузные заболевания печени, включающие в себя жировой гепатоз, хронические гепатиты, в том числе и вирусной этиологии, цирроз печени остаются одной из центральных проблем для здравоохранения всего мира и России. В мире насчитывается около 2 000 млн чел., инфицированных вирусом гепатита В, из которых более 350 млн инфицированы хронически и от 500 000 до 700 000 чел. ежегодно умирают от инфекции вируса гепатита В. Около 130—170 млн чел. хронически инфицируют-
г-Ь
ся вирусом гепатита С, и, согласно оценкам, ежегодно от болезней печени, связанных с гепатитом С, умирают более 350 000 чел. [4, 5]. Заболеваемость впервые выявленным в Российской Федерации хроническим вирусным гепатитом колеблется в пределах от 47,5 в 2001 г. до 54,5 чел. на 100 тыс. населения в 2010 г. [3]. В Орловской области этот показатель составил 14,2 чел. на 100 тыс. населения.
В качестве одного из стратегических направлений лечения вирусных гепатитов ВОЗ
