Измененные варианты возбудителя холеры, выделенные на территории Российской Федерации

Горяев А.А.; Заднова С.П.; Шубина А.В.; Краснов Я.М.; Смирнова Н.И.

УДК 616.932:575.191.(471)

А.А.Горяев, С.П.Заднова, А.В.Шубина, Я.М.Краснов, Н.И.Смирнова

ИЗМЕНЕННЫЕ ВАРИАНТЫ ВОЗБУДИТЕЛЯ ХОЛЕРЫ,

ВЫДЕЛЕННЫЕ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов

Проведен ретроспективный генетический анализ штаммов холерного вибриона, вызвавших вспышки и спорадические случаи холеры на территории Российской Федерации с 1993 по 2006 год. Установлено, что уже с 1993 г. заболевание вызывали измененные штаммы Vibrio cholerae биовара эльтор, содержащие в геноме профага СТХф ген ctxB классического типа, кодирующий В-субъединицу холерного токсина. Кроме того, обнаружено два штамма, у которых в геноме профага присутствовал ген rstR классического типа.

Ключевые слова: Vibrio cholerae, профаг СТХф, измененные варианты.

В настоящее время известно более 200 серо-групп холерных вибрионов, однако возбудителем холеры являются только токсигенные штаммы Vibrio cholerae О1 и О139 серогрупп. На основании фенотипических и генетических признаков холерные вибрионы О1 серогруппы разделяют на два биова-ра - классический и эльтор. Штаммы классического биовара были, по-видимому, возбудителями первых шести пандемий холеры (1817-1923 гг.), в то время как штаммы биовара эльтор вызвали седьмую пандемию, начавшуюся в 1961 г. и продолжающуюся по настоящее время [1, 4]. Фенотипические различия штаммов двух биоваров связаны со способностью эльтор вибрионов продуцировать термолабильный гемолизин, агглютинировать куриные эритроциты, ферментировать глюкозу до образования ацетилме-тилкарбинола в реакции Фогес-Проскауэра, расти на средах, содержащих полимиксин В, и лизироваться диагностическим холерным бактериофагом эльтор. Несмотря на значительные фенотипические различия, сравнительный генетический анализ штаммов двух биоваров показал высокую степень сходства их геномов [3]. Выявленные различия связаны с неодинаковыми нуклеотидными последовательностями гена tcpA, основного белка токсин-корегулируемых пилей адгезии, необходимого холерным вибрионам для колонизации кишечника человека, гена rstR, ре-прессора профага СТХф, а также гена hlyA, ответственного за синтез термолабильного гемолизина. Кроме того, разная нуклеотидная последовательность гена ctxB у холерных вибрионов классического и эльтор биоваров (две нуклеотидные замены в 115 и 203 положениях у вибрионов эльтор) определяет биосинтез холерного токсина (ХТ) разных типов -1-го и 2-го. Также в геноме V. cholerae биовара эльтор присутствуют два острова пандемичности (VSP-I и VSP-II) и гены rstC и rtxC, входящие в состав профага RS^ и RTX-оперона [1, 3].

Вместе с тем, по литературным данным, известно, что начиная с 1991 г. в странах Юго-Восточной Азии обнаружены атипичные штаммы V. cholerae биовара эльтор, отличительной особенностью которых явилось наличие аллелей классического типа в

генах tcpA, rstR и ctxB. При этом некоторые штаммы совмещали фенотипические признаки классического и эльтор биоваров. Такие измененные штаммы эльтор вибрионов, отличающиеся повышенной вирулентностью, стали доминирующими и вытеснили типичные эльтор вибрионы на территории стран Азии и Африки [9, 10].

Целью данной работы был ретроспективный генетический анализ штаммов V cholerae биовара эльтор, выделенных с 1993 по 2006 год в период эпидемических вспышек и при единичных заносах холеры на территорию Российской Федерации.

Материалы и методы

В работе были использованы 10 клинических штаммов V. cholerae О1 серогруппы, полученных из Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб». В качестве контрольных штаммов использовали V. cholerae М818 биовара эльтор и V. cholerae 569В классического биовара. Для культивирования бактерий применяли бульон и агар LB (рН 7,2), а также бульон AKI (рН 8,4).

Определение чувствительности к холерным диагностическим фагам, продукции гемолизина, чувствительности к полимиксину В и реакцию Фогес-Проскауэра проводили согласно МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры».

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в микропробирках объемом 600 мкл на амплификаторе «РТС-150» (MJ Research, США) и iCycler IQ5 (Bio-Rad, США). В реакционную смесь объемом 15 мкл (2,5 мкл буфера 3a - 0,67 М Трис-HCl pH 8,4, 0,166 М (NH4)2SO4, 0,1 % Twin 20, 200 мкг/мл BSA, 0,02 М MgCl2; 2,5 мкл смеси 2 мМ dNTP («Сибэнзим»); 0,25 мкл 5 ед/мкл Taq-полимеразы («Бионем»); по 0,5 мкл специфических праймеров; и 8,75 мкл деионизованной воды) добавляли 10 мкл анализируемой ДНК. Последовательности праймеров, использованные в работе, представлены в табл. 1.

Секвенирование генов rstR и ctxB проводили на приборе «CEQ8000» (Beckman Coulter, США). Для

Результаты и обсуждение

Для проведения анализа нами были использованы штаммы, выделенные от больных во время эпидемических вспышек холеры в Дагестане (1993 г.). Приморье (1997 г.) и Казани (2001 г.), а также при единичных заносах холеры в Пермь (1993 г.), Белорецк (2004 г.), Тверь (2005 г.) и Мурманск (2006 г.).

При изучении фенотипических свойств установлено, что все анализируемые изоляты относятся к штаммам холерного вибриона биовара эльтор: чувствительны к эльтор и резистентны к классическому диагностическим холерным бактериофагам, растут на среде с полимиксином В, продуцируют гемолизин и образуют ацетилметилкарбинол из глюкозы в реакции Фогес-Проскауэра (табл. 2).

На следующем этапе был проведен ПЦР-анализ, который показал наличие у всех штаммов генов ctxA, rstC и rtxC. При использовании аллель-специфических праймеров было установлено присутствие у всех изучаемых штаммов генов tcpA и rstR эльтор типа или tcpAE1 и rstREl (табл. 2). Однако в хромосоме двух штаммов - V. cholerae М1266 и М1293, наряду с геном rstREl, также присутствовал rstR классического типа или rstRClass (табл. 2). Для выявления генотипа ctxB был проведен Mismatch Amplification Mutation Assay PCR (MAMA-PCR), позволяющий дифференцировать однонуклеотидные различия в положении 203 гена ctxB. По результатам MAMAPCR-анализа все изучаемые штаммы содержали ctxB классического типа или ctxBClass (табл. 2).

Для подтверждения полученных результатов нами было проведено секвенирование генов rstR и ctxB. Анализ нуклеотидных последовательностей подтвердил данные ПЦР-анализа. Ген rstR штаммов

Таблица 2

Фенотипические и генетические особенности штаммов V еко1егае О1 серогруппы биовара эльтор, выделенные на территории Российской Федерации с 1993 по 2006 гг.

Место выделения Год выделения Фенотип* Генотип

Штамм Биовар фаг С фаг эльтор Ф-П полими-ксин В ctxA ctxB rstR tcpA rstC rtxC

М1266 Пермь 1993 эльтор R S + R + Class El/Class El + +

М1293 Дагестан 1994 эльтор R S + R + Class El/Class El + +

Р17647 Красноярский край 1997 эльтор R S + R + Class El El + +

Р17644 Красноярский край 1997 эльтор R S + R + Class El El + +

М1344 Казань 2001 эльтор R S + R + Class El El + +

М1345 Казань 2001 эльтор R S + R + Class El El + +

М1349 Казань 2001 эльтор R S + R + Class El El + +

М1429 Белорецк 2004 эльтор R S + R + Class El El + +

М1430 Тверь 2005 эльтор R S + R + Class El El + +

Р18899 Мурманск 2006 эльтор R S + R + Class El El + +

М818 Саратов 1970 эльтор R S + R + El El El + +

569В Индия 1948 Классический S R - S + Class Class Class - -

* R или S - резистентность или чувствительность к полимиксину или к диагностическим холерным бактериофагам С (классическому) или эльтор; Ф-П - реакция Фогес-Проскауэра;

** Class - аллель классического биовара, El - аллель биовара эльтор.

Таблица l

Последовательности олигонуклеотидных праймеров, использованные в работе

Название

Последовательность (5’-3’)

Ссылка

ctxA-F ctxA-R CGGGCAGATTCTAGACCTCCTG CGATGATCTTGGAGCATTCCCAC [5]

ctxB-F ATGATTAAATTAAAATTTGG Рассчитан

ctxB-R TTAATTTGCCATACTAATTG авторами

Ig-l-F rrtR-lF-clas rttR-2F-eltor rstA-3R GAGCCTGTGACACTCACCTTGTAT CTTCTCATCAGCAAAGCCTCCATC GCACCATGATTTAAGATGCTC TCGAGTTGTAATTCATCAAGAGTG [2]

Fw-con Rv-clas Rv-eltor ACTATCTTCAGCATATGCACATGG CCTGGTACTTCTACTTGAAACG CCTGGTACTTCTACTTGAAACA [8]

rtxC-F rtxC-R CGACGAAGATCATTGACGAC CATCGTCGTTATGTGGTTGC [7]

rstC-1 rstC-2 AACAGCTACTGGCTTATTC TGAGTTGCGGATTTAGGC [12]

tcpA-F tcpA-R-eltor tcpA-R-clat CACGATAAGAAAACCGGTCAAGAG CGAAAGCACCTTCTTTCACGTTG TTACCAAATGCAACGCCGAATG [6]

сравнения использовали нуклеотидные последовательности изучаемых генов штаммов V. cholerae N16961 биовара эльтор и V. cholerae О395 классического биовара, представленные в GenBank. Анализ последовательностей ДНК осуществляли с использованием программ «Genetic Analysis System Software Version 9.0» и «Mega4» [11].

N16961

М818

0395

569В

М12 6 6

М1293

Р17644

Р17647

М1344

М1345

М1349

М142 9

М143 0

Р18899

N16961

М818

0395

569В

М12 6 6

М1293

Р17644

Р17647

М1344

М1345

М1349

М142 9

М143 0

Р18899

ATGATTAAAT

140

---I-----I

AGATATTTTC

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

AGATATTTTC

20 3C

----I------I ------I-----I

TAAAATTTGG TGTTTTTTTT TAAAATTTGG TGTTTTTTTT TAAAATTTGG TGTTTTTTTT TAAAATTTGG TGTTTTTTTT TAAAATTTGG TGTTTTTTTT TAAAATTTGG TGTTTTTTTT TAAAATTTGG TGTTTTTTTT TAAAATTTGG TGTTTTTTTT TAAAATTTGG TGTTTTTTTT TAAAATTTGG TGTTTTTTTT TAAAATTTGG TGTTTTTTTT TAAAATTTGG TGTTTTTTTT TAAAATTTGG TGTTTTTTTT TAAAATTTGG TGTTTTTTTT

150

40 50 60 70 80 90

---I-----I -----I----I -I-I -I-I -I-I -I-I

ACAGTTTTAC TATСTTСAGС ATATGCACAT GGAACACCTC AAAATATTAC TGATTTGTGT

200 203 210

100 110 115 120 130

— I — і — і — і ... JT]... I — I — I

GCAGAATACC ACAACACACA AATJ.TATACG CTAAATGATA GCAGAATACC ACAACACACA AATJ.TATACG CTAAATGATA GCAGAATACC ACAACACACA AATJ.CATACG CTAAATGATA GCAGAATACC ACAACACACA AATJ.CATACG CTAAATGATA GCAGAATACC ACAACACACA AATJ.CATACG CTAAATGATA GCAGAATACC ACAACACACA AATJ.CATACG CTAAATGATA GCAGAATACC ACAACACACA AATJ.CATACG CTAAATGATA GCAGAATACC ACAACACACA AATJ.CATACG CTAAATGATA GCAGAATACC ACAACACACA AATJ.CATACG CTAAATGATA GCAGAATACC ACAACACACA AATJ.CATACG CTAAATGATA GCAGAATACC ACAACACACA .AATJ.CATACG CTAAATGATA GCAGAATACC ACAACACACA AATJ.CATACG CTAAATGATA GCAGAATACC ACAACACACA AATJ.CATACG CTAAATGATA GCAGAATACC ACAACACACA AATJ.CATACG CTAAATGATA

• I

160 170 180 190

---I-----I -----I----I -----I-----I -----I----I -----I-----I . .

GTATACAGAA TCTCTAGCTG GAAAAAGAGA GATGGCTATC ATTACTTTTA AGAATGGTGC JU.T

GTATACAGAA TCTCTAGCTG GAAAAAGAGA GATGGCTATC ATTACTTTTA AGAATGGTGC AJ.C

GTATACAGAA TCTCTAGCTG GAAAAAGAGA GATGGCTATC ATTACTTTTA AGAATGGTGC AJlC

GTATACAGAA TCTCTAGCTG GAAAAAGAGA GATGGCTATC ATTACTTTTA AGAATGGTGC .AJlC

GTATACAGAA TCTCTAGCTG GAAAAAGAGA GATGGCTATC ATTACTTTTA AGAATGGTGC JU.C

GTATACAGAA TCTCTAGCTG GAAAAAGAGA GATGGCTATC ATTACTTTTA AGAATGGTGC AliC

GTATACAGAA TCTCTAGCTG GAAAAAGAGA GATGGCTATC ATTACTTTTA AGAATGGTGC AJlC

GTATACAGAA TCTCTAGCTG GAAAAAGAGA GATGGCTATC ATTACTTTTA AGAATGGTGC AJ.C

GTATACAGAA TCTCTAGCTG GAAAAAGAGA GATGGCTATC ATTACTTTTA AGAATGGTGC AJlC

GTATACAGAA TCTCTAGCTG GAAAAAGAGA GATGGCTATC ATTACTTTTA AGAATGGTGC JU.C

GTATACAGAA TCTCTAGCTG GAAAAAGAGA GATGGCTATC ATTACTTTTA AGAATGGTGC AJ.C

220 230 240 250 260

I----I -----I-----I -----I-----I -----I----I -----I-----I -----I-----I

CTTTCJlA gtagj^agtac caggtagtca acatatagat tcacaaaaaa AAGCGATTGA