CC BY
29
УДК 616.932
А.В.Шашкова, А.А.Горяев, С.П.Заднова, Я.М.Краснов, Н.И.Смирнова, В.В.Кутырев
конструирование пцр тест-системы для идентификации тоКсигЕнных штаммов ViBRiO CHOLERAE о1, определения их БиовАрА и дифференциации штаммов эльтор вибрионов на типичные и измененные
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»,Саратов
Разработана мультилокусная ПЦР тест система, позволяющая идентифицировать штаммы Vibrio cholerae О1 серогруппы при выделении чистой культуры на основе выявления гена rfbO, определять их биовар - классический или эльтор при тестировании соответственно генов cas3 и rtxC и одновременно проводить дифференциацию эльтор вибрионов на типичные токсигенные штаммы, содержащие в геноме ген ctxBEltor, и генетически измененные варианты, имеющие ctxBClass. Эффективность и специфичность тест-системы экспериментально доказана при анализе 64 природных штаммов Vcholerae разных серогрупп и биоваров и 13 штаммов энтеробактерий и других видов рода Vibrio. Принадлежность изученных штаммов V. cholerae биовара эльтор к типичным или измененным вариантам подтверждена секвенированием гена ctxB.
Ключевые слова: Vibrio cholerae, мультилокусная ПЦР тест-система, идентификация и дифференциация, генетически измененные варианты.
A.V.Shashkova, A.A.Goryaev, S.P.Zadnova, Ya.M.Krasnov, N.I.Smirnova, V.V.Kutyrev
Construction of the PCR Test-System for the Detection of Vibrio cholerae O1 Toxigenic Strains, for Indication of Their Biovar and for Differentiation between Typical and Altered El Tor-Vibrio Strains
Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”, Saratov
Worked out is the multilocus PCR test-system which makes it possible to identify Vibrio cholerae O1 strains on the basis of rfb gene detection, to determine their biovar - either Classical or El Tor by testing cas3 or rtxC genes respectively, and at the same time to differentiate them into typical (which carry ctxBEltor gene) and genetically altered (which carry ctxBClass gene) variants. Efficacy and specificity of the test-system is demonstrated by the analysis of 64 natural V. cholerae strains of various serogroups and biovars, and 13 strains of enterobacteria and other species of Vibrio genus. Relation of the studied V. cholerae El Tor isolates to the typical or altered vibrio variants is proved out by ctxB gene sequencing.
Key words: Vibrio cholerae, multilocus PCR test-system, identification and differentiation, genetically altered vibrio variants.
Холера - особо опасное инфекционное заболевание с диарейным синдромом, возбудителем которого являются токсигенные штаммы Vibrio cholerae. Несмотря на то, что существуют более 200 различных серогрупп холерных вибрионов, эпидемии и пандемии холеры способны вызывать только токсигенные штаммы V. cholerae О1 серогруппы классического и эльтор биоваров, а также V.cholerae О139 серогруппы. Холерные вибрионы классического биовара считаются возбудителями первых шести пандемий азиатской холеры (1817-1923 гг.). Возбудителем 7-й пандемии холеры, начавшейся в 1961 г. и продолжающейся до сих пор, являются штаммы V. cholerae биовара эльтор. Токсигенные штаммы V.cholerae О139 серогруппы вызывают спорадические случаи холеры. Холерные вибрионы классического и эльтор биоваров отличаются по ряду фенотипических и генетических свойств [1, 4, 11]. Одним из основных генетических отличий холерных классических и эльтор вибрионов является различие нуклеотидных последовательностей гена ctxB из оперона ctxAB, кодирующего биосинтез холерного токсина (ХТ). Разная нуклеотидная последовательность генов ctxB классического и эльтор вибрионов определяет неодинаковую аминокислотную последовательность В-субъединиц их токсинов, вследствие чего различают ХТ классического (или 1-го) типа, продуцируемый класси-
ческими вибрионами, и ХТ эльтор (или 2-го) типа, характерный для вибрионов эльтор [15].
Несмотря на широкое распространение типичного возбудителя 7-й пандемии холеры на ее первом этапе (1960-1990 гг.), в последние годы в процессе эволюции возникли и заняли доминирующее положение новые варианты V. ско1егае биовара эльтор с повышенной вирулентностью, получившие обозначение генетически измененных вариантов. Геном типичных токсигенных штаммов эльтор вибрионов содержит ген с^Бв1‘ог, тогда как у измененных вариантов присутствует ген с^Б01^' [5, 8, 13]. Продукция измененными вариантами V. ско1егае 01 биовара эльтор ХТ классического типа приводит к повышению их вирулентности по сравнению с типичными штаммами. Именно с холерными вибрионами, относящимися по всем фенотипическими признакам к биовару эльтор. но несущими классический аллель гена сиБ, связана в настоящее время эпидемия холеры на Гаити [9].
Для генной диагностики холеры разработано значительное количество ПЦР тест-систем, позволяющих не только выявлять токсигенные штаммы холерного вибриона, но и определять их серогруппу, биовар и эпидемическую значимость. Для детекции ДНК вирулентных штаммов V. ско1егае на основе амплификации фрагмента с^Л гена, кодирующего биосинтез А-субъединицы холерного токсина,
используется сертифицированная «ГенXол - тест-система» (ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб», Саратов). Ростовским НИПЧИ совместно с НИИ микробиологии Минобороны России разработана тест-система для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+ tcpA+) методом полимеразной цепной реакции. Для выявления холерного вибриона 01 серогруппы, определения биовара и эпидемической значимости используются мультиплексные тест-системы «Ген V. cholerae Мульти-ЭФ» (ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб», Саратов), «АмплиСенс V. cholerae-FRT» (ФГУН ЦНИИ эпидемиологии, Москва) и т.д. [2, 3, 6, 7]. 0днако все известные ПЦР тест-системы предназначены для выявления типичных штаммов холерного вибриона и не позволяют идентифицировать измененные варианты с повышенной вирулентностью.
Taким образом, в связи с возникновением высоковирулентных измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор, продуцирующих XT классического типа, и опасностью их завоза на территорию Российской Федерации и граничащих с ней стран, актуальна разработка мультилокусной ПЦР тест-системы для быстрой и достоверной идентификации штаммов V. cholerae 01 серогруппы, определения их биовара и дифференциации токсигенных штаммов V. cholerae 01 биовара эльтор на типичные изоляты и измененные варианты.
Материалы и методы
В работе использованы 49 клинических штаммов V. cholerae 01 и 0139 серогрупп, 15 штаммов V. cholerae не01/не0139 серогрупп, 4 вида энтеробактерий и 9 штаммов бактерий близкородственных видов, полученных из Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб». Для культивирования бактерий применяли бульон и агар LB (рН 7,2), а также бульон AKI (рН 8,4).
Подготовку проб осуществляли согласно МУ 1.3.2569-09 «0рганизация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение ДНК проводили методом нуклеосорбции на силикагеле с использованием гуанидинизотиоционата.
Амплификацию ДНК проводили с использованием программируемого термостата ^ерцик» (ДНК-технология, Россия).
Анализ и оценку результатов осуществляли путем сравнения полученных в ПЦР ампликонов с аналогичными фрагментами типичных токсигенных штаммов V. cholerae классического и эльтор биова-ров методом электрофореза в агарозном геле.
Секвенирование гена ctxB проводили на приборе «CEQ8000» (Beckman Coulter, США). Для сравнения использовали нуклеотидные последовательности генов штаммов V. cholerae N16961 биовара эльтор и V. cholerae 0395 классического биовара, представленных в GenBank. Анализ последовательностей ДНК
осуществляли с использованием программ «Genetic Analysis System Software Version 9.0» и «Mega4».
Результаты и обсуждение
При конструировании мультилокусной ПЦР тест-системы были использованы как применяемые ранее праймеры, так и разработанные впервые. С целью определения принадлежности выявленного штамма V. cholerae к 01 серогруппе были выбраны праймеры на локус rfbO, кодирующий синтез 01 антигена [12]. Для дифференциации типичных изоля-тов и генетически измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор использовали аллельспецифичные праймеры на ген ctxB [14]. Как известно, ген ctxB входит в состав оперона ctxAB, кодирующего продукцию холерного токсина, и выявление гена ctxB также указывает на токсигенность изучаемого штамма. Дифференциацию биоваров проводили с помощью праймеров на ген rtxC, который определяется только в штаммах V. cholerae эльтор биовара [10], и на ген cas3, кодирующий хеликазу и присутствующий у холерных вибрионов классического биовара.
В ходе работы было экспериментально установлено соотношение всех компонентов реакционной смеси, а также подобрано сочетание праймеров, позволяющее получать четкие и легко интерпретируемые результаты ПЦР анализа. Для проведения анализа использовали ПЦР параллельно в двух реакционных смесях. Первая смесь содержала праймеры к генам классических вибрионов, вторая - эльтор. В качестве контрольных штаммов использовали типичные токсигенные штаммы классического и эльтор биоваров соответственно - V. cholerae 569В (rfbO1+, cas3+, ctxBClass+ и rtxC-, ctxBEltor-) и V. cholerae М818 (rfbO1+, rtxC+, ctxBEltor+ и cas3-, ctxBClass ).
Специфичность разработанной тест-системы была подтверждена на основе использования штаммов близкородственных видов - V. mimicus, V. anguillarum, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. alginoliticus, V. al-bensis, а также энтеробактерий - E. coli, S. enteritidis, Sh. flexneri, A. hydrofilae. При проведении ПЦР тестирования указанных штаммов был получен отрицательный результат (отсутствие ампликонов). При анализе штаммов V. cholerae 0139 и не01/не0139 серогрупп отсутствовали фрагменты, соответствующие локусу rfbOl (638 п.н.). Полученные данные подтверждают специфичность разработанной тест-системы в отношении штаммов V. cholerae 01 серогруппы.
Для определения эффективности сконструированной тест-системы исследовали 47 клинических штаммов V. cholerae 01 серогруппы, выделенных в разные годы на территории России и сопредельных государств. Данные по определению специфичности и эффективности сконструированной тест-системы с использованием некоторых штаммов энтеробактерий и видов рода Vibrio приведены в таблице и на рис. 1. У всех исследованных штаммов присутствовал ам-пликон размером 638 п.н., соответствующий локусу
Специфичность и эффективность сконструированной мультилокусной ПЦР-тест-системы
Вид Серогруппа и биовар Штамм Место выделения Год выделения Реакционная смесь № 1 Реакционная смесь № 2
г(Ь01 саэЗ сґхБсіа' ф01 НхС сїхБЕІіог
Е. соїі М17 н/и н/и -
S. enteritidis ВОЗ н/и н/и -
V тітісиз АТСС 33653 Институт Пастера н/и -
V шіпфсш АТСС27562 Калифорнийский унив. н/и + -
V. рагакаєтоііґісш 745 Новороссийск н/и -
V аіЬєпхіх 37263 Ставрополь н/и + -
V скоієгає 037 1322-69 Коллекция Саказаки н/и + -
V скоієгає 020 10332-62 Коллекция Саказаки н/и -
V скоієгає 062 КМ3 Узбекистан 1971 + + -
V скоієгає 041 14520 Астрахань 1976 + -
V скоієгає 042 13030 Астрахань 1976 + -
V скоієгає 09 Р-16140 Узбекистан 1990 + + -
V скоієгає 0139 М028 Индия 1993 + +
V скоієгає 0139 55 Франция 1994 + +
V скоієгає О1 классический М8 Волгоград 1942 + + + + -
V скоієгає О1 классический 569В Индия 1950 + + + + -
V скоієгає О1 эльтор М295 Туркменистан 1965 + + + +
V скоієгає О1 эльтор М818 Саратов 1970 + + + +
V скоієгає О1 эльтор М1013 Башкирия 1972 + + + +
V скоієгає О1 эльтор Р13762 Узбекистан 1988 + + + + -
V скоієгає О1 эльтор М 1259 Пермь 1990 + + + +
V скоієгає О1 эльтор Р15384 Украина 1991 + + + + -
V скоієгає О1 эльтор М1264 Краснодар 1993 + + + + -
V скоієгає О1 эльтор М1293 Дагестан 1994 + + + + -
V скоієгає О1 эльтор Р17644 Ачинск 1997 + + + + -
V скоієгає О1 эльтор М1344 Казань 2001 + + + + -
V скоієгає О1 эльтор М1429 Башкирия 2004 + + + + -
V скоієгає О1 эльтор М1430 Тверь 2005 + + + + -
V скоієгає О1 эльтор Р18899 Мурманск 2006 + + + + -
т^01 и свидетельствующий о принадлежности этих штаммов к 01 серогруппе. При этом было показано, что 5 из этих 47 изолятов относятся к токсигенным штаммам классического биовара, так как у них происходила амплификация фрагментов ДНК размером 415 и 189 п.н. в первой реакционной смеси, что указывает на присутствие в их геноме соответственно биовароспецифического гена саз3, а также гена с1хЕС1а33, связанного с продукцией ХТ классического типа (рис. 1, дорожки 11-14).
8« м
сШсш7сіхВшг
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Рис. 1. Электрофореграмма типичных изолятов и измененных вариантов V. ско1егае, полученная с использованием разработанной мультилокусной ПЦР тест-системы:
Измененные варианты эльтор вибрионов: 1, 2 - V сИо1егае М1266,
5, 4 - М1293, 5, 6 -- V Метав М1349, 7, § - V ско1етае М1430; типичные штаммы эльтор вибрионов: 9, 10 - V ско1етае М1013,
15, 16- V. ско1етае М818; типичные штаммы классических вибрионов: 11, 12 - V сИоЬетае J89, 13, 14 - V сИо1етае 569В.
Нечетные числа - ампликоны, полученные в первой реакционной смеси, содержащей праймеры к генам классических вибрионов; четные - ампликоны, полученные во второй реакционной смеси, содержащей праймеры к генам эльтор вибрионов
У 42 штаммов V. ско1етае при ПЦР-анализе наблюдалась иная картина. В их геноме присутствовал биовароспецифический ген т^С, выявляемый с помощью второй реакционной смеси, поскольку во всех случаях формировался ампликон размером 265 п.н. (тЫС), что указывает на их принадлежность к холерным вибрионам биовара эльтор. При этом 20 штаммов относились к типичным токсигенным штаммам V. ско1етае 01 биовара эльтор, так как для них было характерно наличие ампликона размером 189 п.н во второй реакционной смеси, что указывает на наличие в их геноме гена с^Бв1‘от (рис. 1, дорожки 9-10, 15-16). В то же время у 22 изолятов обнаружено присутствие в геноме гена с^Б классического типа (ctxБC1ass), о чем свидетельствует образование ампликона к гену с1хЕС1а33 в первой реакционной смеси (рис. 1, дорожки 1-8).
Для подтверждения полученных с помощью сконструированной мультилокусной ПЦР тест-системы результатов был секвенирован ген ^Б некоторых штаммов. В результате проведенного анализа в последовательности гена ^Б у 13 взятых для анализа изолятов обнаружены две нуклеотидные замены тимина (Т) на цитозин (С) в положениях 115 и 203, что указывает на присутствие в их геноме гена сХхБ классического типа (с^хБС1а3'), рис. 2. Данные секвенирования полностью подтвердили результаты, полученные с использованием разработанной муль-
-------|----------| ----------I----------I ----------|----------I -----------|---------I -----------I---------| -----------I----------| ----------|----------I ----------|----------| ----------|----------| -----------I---------|
N818 AATATATACG CTAAATGATA AGATATTTTC CTATACAGAA ТСТСТАССТС GAAAAACAGA GATGGCTATC ATTACTTTTA AGAATCCTCC ААТТТТТСАА GTACAAGTAC
N8 ....С С
ни ....С.................................................................................................................................с.
Р13762 . ...С С
Н1259
N1261
Р18899 ....С С
Рис. 2. Фрагменты секвенированной последовательности гена ctxB. Очками отмечены одинаковые нуклеотиды
тилокусной ПЦР тест-системы, указав на принадлежность выявленных 13 штаммов холерного вибриона биовара эльтор к измененным вариантам.
Таким образом, полученные данные свидетельствует о том, что исследование природных штаммов холерных вибрионов с помощью сконструированной мультилокусной ПЦР тест-системы позволяет не только идентифицировать штаммы V. скоієгає О1 серогруппы, определять их биовар и токсигенность, но и дифференцировать штаммы V. скоієгає биовара эльтор на типичные изоляты и измененные варианты, несущие в геноме ген сїхБ классического типа.
На созданную мультилокусную ПЦР тест-систему подана заявка на получение патента на изобретение (№ 2011109469 от 14.03.2011 г.).
Работа выполнена по государственному контракту № 70-Д от 25.07.2011 г. в рамках федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 годы)».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бароян О.В. Холера Эль-Тор. М.: Медицина; 1971. 254 с.
2. Заднова С.П., Ливанова Л.Ф., Крепостнова И.М., Захарова Т.Л., Осин А.В., Смирнова Н.И. Комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система для идентификации холерных вибрионов О1 и О139 серогруппы и оценки их вирулентности. Патент РФ № 2404257.
3. Осина Н.А., Бугоркова Т.В., Коннова С.С., Куклев В.Е., Кутырев В.В. Способ детекции и определения биотипа, серогруппы и токсигенности возбудителя холеры и набор для его осуществления. Патент РФ 2360972.
4. Смирнова Н.И., Кириллина О.А., Челдышова Н.Б., Кутырев В.В. Дифференциация штаммов Vibrio cholerae eltor по их эпидемической значимости с помощью новых диагностических холерных бактериофагов эльтор ctx- и ctx+ и полимеразной цепной реакции. Журн. эпидемиол., микробиол. и иммунобиол. 2001; 6:11-6.
5. Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Эволюция генома возбудителя холеры. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2004; 4:3-13.
6. Смирнова Н.И., Челдышова Н.Б., Горяев А.А., Лозовский Ю.В., Кутырев В.В. Эволюция генома Vibrio cholerae: пути формирования атипичных штаммов. Пробл. особо опасных инф. 2008; 3(97):3-12.
7. Яцышина С.Б., Осина Н.А., Астахова Т.С., ИльичевЮ.А., Куличенко А.Н., Хайтович А.Б., Шипулин ГА. Разработка тест-систем на основе мультиплексной ПЦР для обнаружения эпидемически значимых холерных вибрионов. URL: http://www. mterlabservice.ru/consultmg/index.php?id=1961 (дата обращения 15.03.2011 г.).
8. Bhattacharya T., Chatterjee S., Maiti D. et al. Molecular analysis of the rstR and orfU genes of the CTX prophages integrated in the small chromosomes of environmental Vibrio cholerae non-O1, non-O139 strains. Environ. Microbiol. 2006; 8:526-34.
9. Chin C.-S., Sorenson J., Harris J.B. et al. The origin of the Haitian cholera outbreak strain. N. Engl. J. Med. 2010; 364:33-42.
10. Chow K.H., Ng T.K., Yuen K.Y., Yam W.C. Detection of RTX toxin gene in Vibrio cholerae by PCR. J. Clin. Microbiol. 2001; 39:2594-7.
11. Faruque S.M., Albert M.J., Mekalanos J.J. Epidemiology, genetics an ecology of toxigenic Vibrio cholerae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998; 62:1301-14.
12. Goel A.K., Ponmariappan S., Kamboj D.V., Singh L. Single multiplex polymerase chain reaction for environmental surveillance of toxigenic-pathogenic O1 and non-O1 Vibrio cholerae. Folia Microbiol (Praha). 2007; 52:81-5.
13. Kumar P., Jain M., Goel A. K., Bhadauria S., Sharma S. K., Kamboj D. V et al. A large cholera outbreak due to a new cholera toxin variant of the Vibrio cholerae O1 El Tor biotype in Orissa, Eastern India. J. Med. Microbiol. 2009; 58:234-8.
14. Morita M., Ohnishi M., Arakawa E., Bhuiyan N.A., Nusrin S., Alam M. et al. Development and validation of a mismatch amplification mutation PCR assay to monitor the dissemination of an emerging variant of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor. Microbiol. Immunol. 2008, 52:314-7.
15. Olsvik Q., Wahlberg J., Petterson B., Uhlen M., Popovic T., Wachsmuth I.K. et al. Use of automated sequencing of polymerase chain reaction-generated amplicons to identify three types of cholera toxin subunit B in Vibrio cholerae O1 strains. J. Clin. Microbiol. 1993; 31:22-35.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)
1. Baroyan O.V. [El Tor Cholera]. M.: Meditsina; 1971. 254 p.
2. Zadnova S.P., Livanova L.F., Krepostnova I.M., Zakharova T.L., Osin A.V, Smirnova N.I. [Complex geno- and immunodiagnostic test-system for Vibrio cholerae O1 and O139 serotypes identification and evaluation of their virulence]. RF Patent 2404257.
3. Osina N.A., Bugorkova T. V., Konnova S.S., Kuklev V.E., Kutyrev V.V. [Method of detection and identification of the cholera agent biotype, sero-group and toxigenicity, and the kit for its application]. RF Patent 2360972.
4. Smirnova N.I., Kirillina O.A., Cheldyshova N.B., Kutyrev V.V. [Differentiation of Vibrio cholerae El Tor Strains on the basis of their epidemic value using the new diagnostic ctx- and ctx+ El Tor cholera bacteriophages and polymerase chain reaction]. Zh. Epidemiol. Mikrobiol. Immunobiol. 2001; 6:11-6.
5. Smirnova N.I., Kutyrev V.V. [Evolution of the cholera agent genome]. Mol. Genet. Mikrobiol. Virusol. 2004; 4:3-13.
6. Smirnova N.I., Cheldyshova N.B., Goryaev A.A., Lozovsky^ Yu.V, Kutyrev V.V. [Vibrio cholerae genome evolution: ways of atypical strains formation]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2008; 97:3-12.
7. Yatsyshina S.B., Osina N.A., Astakhova T.S., Il'ichev Yu. A., Kulichenko A.N., Khaitovich A.B., Shipulin G.A. [Development of the test-systems on the basis of multiplex PCR for the detection of Vibrio cholerae with epidemic potential]. Available from: http://www.interlabservice.ru/con-sulting/index.php?id=1961 [cited 15 Mar 2011].
Authors:
ShashkovaA.V., GoryaevA.A., Zadnova S.P., Krasnov Ya.M., Smirnova N.I., Kutyrev V.V. Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”. Universitetskaya St., 46, Saratov, 410005, Russia. E-mail: rusrapi@microbe.ru
Об авторах:
ШашковаА.В., Горяев А.А., Заднова С.П., Краснов Я.М., Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: rusrapi@microbe.ru
Поступила 05.04.11.
