Сенсор на основе слитого белка LacZ с плексин-семафориновым доменом бета-3-интегрина — маркера эндотелиоцитов капилляров сетчатки и потенциального рецептора хантавирусов Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ИЮЛЬ №7 (244)

31

Ц СЕНСОР НА ОСНОВЕ СЛИТОГО БЕЛКА LACZ С ПЛЕКСИН-

о СЕМАФОРИНОВЫМ ДОМЕНОМ БЕТА-3-ИНТЕГРИНА -

сБ МАРКЕРА ЭНДОТЕЛИОЦИТОВ КАПИЛЛЯРОВ СЕТЧАТКИ

И ПОТЕНЦИАЛЬНОГО РЕЦЕПТОРА ХАНТАВИРУСОВ

¡—у

■^Т М.С. Смирнова1, О.А. Леонович1, А.В. Шибаева2, Ю.К. Кудыкина1, А.Б. Шевелев1

LACZ DERIVED FUDSION PROTEIN PROBE BASED ON PLEXINE-SEMAPHORINE DOMAIN OF BETA-3 INTEGRIN, A MARKER OF RETINA CAPILLAR ENDOTHELIOCYTES AND PUTATIVE RECEPTOR OF HANTAVIRUSES

M.S. Smirnova, O.A. Leonovich, A.V. Shibaeva, Yu.K. Kudykina, A.B. Shevelev

'ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» РАМН, г. Москва; 2ФГБУН «Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля» РАН, г. Москва

Описано конструирование продуцента, очистка и испытания ферментативной активности белка-зонда, представляющего собой слитой продукт на основе плексин-семафоринового домена бетаЗ-интегрина и бета-галактозидазы E. coli. Зонд предназначен для выявления повреждений сосудов сетчатки, включая фотоповреждения, in vivo и in vitro, для количественного и качественного определения хантавирусных частиц, прежде всего в вакцинных субстанциях.

Ключевые слова: интегрин, сетчатка, хантавирусы, рекомбинантный белок, LacZ, PSI

Producer strain engineering, purification and testing enzymatic activity of a probe protein based on LacZ and plexine-semaphorine domain of human beta3-integrin are disclosed. The probe may be used for detection of in vivo and in vitro damage of retina capillaries as well as for identification and quantification of hantavirus particles in vaccine substances.

Keywords: integrin, retina, hantavirus, recombinant protein, LacZ, PSI

Интегрины — семейство распространённых поверхностных гликопротеинов эукариотических клеток [4]. Они отвечают за многие клеточные реакции, в том числе за васкуляризацию тканей, запуск свертывания крови при повреждении сосудов, мобилизацию и демобилизацию клеток крови из сосудистого русла. На внешней мембране интегрины, как правило, находятся в форме гете-родимеров или гетеромультимеров, включающих субъединицы а- и в-типов. Интегрин в3-типа является маркером сосудов. Он играет важную роль в функционировании сосудов сетчатки, в том числе при фотоповреждении монохроматическими источниками света (диодные лазеры) [1]. Одновременно в3-интегрин является потенциальным рецептором, обеспечивающим проникновение в клетки аденовирусов и хантавирусов [2]. Это обстоятельство может использоваться для создания систем доставки макромолекул, обеспечивающих лечение опухолей сетчатки (вирусные векторы, фотодинамическая терапия), а также для восстановления фотоповреждений сосудов по принципу генной терапии.

На N-конце интегринов находится плексин-семафориновый (plexine-semaphorine domain of beta3-integrin) (PSI) домен, длиной 43 а.о. Этот домен может находиться в двух различных пространственных конформациях: релаксированной (выпрямленной) и напряженной (изогнутой). В условиях ex vivo переход Ь3-интегрина на поверхности клеток в изогнутую (активную) конфор-мацию может быть достигнут путем инкубации культуры в среде с избыточным содержание ионов Ca2+. Выпрямленная (неактивная) конформация стабилизируется ионами Mn2+. Проникновение вируса в клетку требует наличия интегринов в изогнутой конформации, причем сайтом связывания является N-концевой PSI домен, длиной 43 а.о.

[4]. Экспериментально доказано, что взаимные точечные замены в PSI домене человека и мыши изменяют специфичность распознавания штаммов хантавирусов, имеющих тропность к клеткам человека и мыши [З].

В рамках нашей работы была поставлена цель разработать белок-зонд для исследования поведения рЗ-интегрина в условиях фотоповреждения сетчатки и при вирусной инфекции. Для этого последовательность геномного гена человека, кодирующая PSI, была слита с геном LacZ (beta-galactosidase from E. coli). Полученный слитой ген экспрессировали в клетках E. coli, белок частично очищали и исследовали его связывающую способность, пользуясь наличием ферментативной активности в отношении хромогенного субстрата LacZ.

Конструкцию, кодирующую искусственный ген PSI-домена ^З-интегрина, получали по следующей схеме: на матрице выделенной ДНК клеточной линии Vero E6 эмбриональной почки зеленой мартышки (Cercopithecus aethiops) проводили двухстадийную ПЦР для получения интегриновых экзонов (два) и их последующего объединения. Для проведения реакции использовались праймеры INTl (BamHI) ggggatccGGGCCCAACATCTGTACCACG, INT2 CCTCATCAGAGCACCAGGCACA, ЮТЗ TGTG CCTGGTGCTCTGATGAGGAGGCCCTGCCTCT GGGCTCA и Int4 (SalI) gggtcgacctcgatggattctggggca; с помощью MinElute Gel Extraction Kit (MBI Fermentas) проводилась очистка ПЦР-продукта длиной l68 п.н. из агарозного геля. Очищенный фрагмент клонировали в экспрессионный вектор pQE-LacZ, содержащий ген ß-галактозидазы, по сайтам BamHI- SalI. Карта и последовательность вставки, полученной таким образом, представлена на рис. l, 2.

32

ЗНиСО ИЮЛЬ №7 (244)

INT

Sad (6548) ApaI (6519) BamHI (6509 Eco RI (6452) T5start

MunI (6423) MfeI (6423) T5promoter XhoI (6365) ScaI (5852) Amp

Ц

Pvu II (115)

HpaI (449) ClaI (847) HpaI (1073) Eco RV (1136 LacZ

Sad (1963)

Pvu II (2672) Ndâ (2980) Eco RI (3027) Pvu II (3035) Hindm (3090) To term NM (3210)

Рис. 1. Карта конструкции pQL-Int, предназначенной для получения белка-зонда на основе слитого белка PSI-домена р3-интегрина. Последовательность аминокислот PSI-домена выделена серым. Опорные сайты

рестрикции выделены рамками

ColEori

NdeI (4302) XbaI (4066) rrnT 1 termin

ScaI (3879) NcoI (3763)

Pvu II (3362)

ДНК конструкции pQL-Int вводили в клетки E. coli штамм TG1, наращивали биомассу реком-бинантного штамма в стандартных условиях: 10 колб объемом 750 мл содержали по 50 мл среды LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина; их засевали свежеполученными колониями трансформантов (изначальная доза засева около 106 к.о.е. на мл), выращивали в течение 18 ч при 30 °С в присутствии 1 мМ ИПТГ. Биомассу собирали центрифугированием в 40 мл флаконах (8 000 об./мин 30 мин, центрифуга «Beckman» model J-21C). Биомассу промывали стерильным физиологическим раствором, переосаждали и ресуспендиро-вали в буфере (0,005М ЭДТА, 0,05 М Трис-HCl, рН = 8,0), содержащим лизоцим (1 мг/мл). Клетки

инкубировали в течение 1—2 ч при температуре 30 °С. Затем клетки разрушали при помощи стеклянных шариков в течение 10 мин. Полученную клеточную суспензию разделяли на растворимую и нерастворимую фракции при помощи центрифугирования (8 000 об/мин, 60 мин, центрифуга «Beckman» model J-21C). Нерастворимую фракцию ресуспендировали в буфере (0,005М ЭДТА, 0,05 М Трис-HCl, рН = 8,0).

Во фракциях клеточного лизата определяли активность в-галактозидазы. Для этого в лунках 96-луночного иммунологического планшета Costar смешивали по 20 мкл фракции (раствор или суспензия) и 50 мкл субстратной смеси (Трис-глициновый буфер pH 8,6, содержащий 0,02 %

¿МЦСМИОЛОГМ

г

о

0 я

СП о

а Р

м н

й g » §

hj в

ÏÏH

1 О

° Е g И о о я 2

™ S

Khol

Ее:. EI

____H

C[m]ÍÁG]AAATCATAAAAAATTTATTTGC TTTGTGA DC С GAT AAC A ATT ATA ATA GATT CAATTGTGAGC GGATAAC AATTTCAC AC A|GAATT C|ATTAAA GAG GAGAAATTAA CT AT G

SIE I

И I С T T E G V 3 3 ААС АТС TGT AC С ACG С GA GGT GT|G AGC Д]С

E G 3 H H AGA GGA TCG CAT CAC

Eil,, HI

H H H- H G S G P CAT CAC CAT CAC |GOA TCC| GGG CCC

С

С

V 3

H С

И С 3

С

К «

к s s

M №

h §

о К

(71

S й № к

о о H

№

р

g

S К

чз о

S «

g S

G p M w

P i-4

TGC CA G С AG TGC □ ill

"5 w я s я

О к 2

« Й >3

К 2 Ц

Е >3 й

о S К

о Д g ppS

S До

2 м

ч « V

О Й ьн

2 S 3

>3 о -м а S -3

S я

о о Н Й

й s

V К

h g о и

g СП

о о

« а

p W м »

L К D 11 С A P E S I E ■D M

CTG AAG GAT AAC TGT GCC С CA GAA ТС С АТС GAG |ИГ &ÂC| ATG

H F- ■P F A 3 И E 11 3 E E A E

CAT CCC CCT TTC GCC AGC TGG CGT AAT AGC GAA GAG GC С CGC

В L E с II L P E A II T V U U

TGG CTG GAG TGC GAT CTT CCT GAG GC С GAT ACT GTC GTC GTC

T E II P T G С Y 3 L T F II U

ACG GAG AAT CCG ACG GGT TGT TAC ТС G CTC АСА TTT AAT GTT

V G Y G Q D 3 E ■L P 3 E F D

GTC GGT TAC GGC CAG GAC AGT CGT TTG CCG TCT GAA TTT GAC

M M E H 3 G I F E D U 3 L L

ATG TGG CGG ATG AGC GGC ATT TTC CGT GAC GTC TCG TTG CTG

Q M С G E L E D Y L E U T U

CAG ATG TGC GGC GAG TTG CGT GAC TAC СТА CGG GTA АСА GTT

E U T L E L И V E 11 P- К L M

CGC GTC АСА СТА CGT CTG AAC GTC GAA AAC CCG AAA CTG TGG

G- ■F E E U E I E 11 G L L L L

GGT TTC CGC GAG GTG CGG ATT GAA AAT GGT CTG CTG CTG CTG

Q D I L L H К U 11 И F II A U

CAG GAT АТС CTG CTG ATG AAG CAG AAC AAC TTT AAC GC С GTG

T H G H U P H И E L T D D P

ACC CAC GGC ATG GTG С CA ATG AAT CGT CTG ACC GAT GAT CCG

H E 3 G H G A И H D A L Y E

AAT GAA TCA GGC CAC GGC GCT AAT CAC GAC GCG CTG TAT CGC

Y A E U D E D U P F P A V P

TAC GCG CGC GTG GAT GAA GAC CAG CCC TTC CCG GCT GTG CCG

L G G F A К Y Cil Q A F E U Y

CTT GGC GGT TTC GCT AAA TAC TGG CAG GCG TTT CGT CAG TAT

G G D F G D T P 11 D ■ ■E Q F С

GGC GGT GAT TTT GGC GAT ACG CCG AAC GAT CGC CAG TTC TGT

-3 G U T I E 4 T 3 E Y L F E

TCC GGG CAA АС С АТС GAA GTG АС С AGC GAA TAC CTG TTC CGT

Q G К Q L I E L P E L P Q P

CAA GGT AAA CAG TTG ATT GAA CTG CCT GAA СТА CCG CAG CCG

Q Q И E L A E II L 3 U T L P'

CAG CAG TGG CGT CTG GCG GAA AAC CT С AGT GTG ACG CTC CCC

Q 3 G F L 3 Q M В I G D К К

CAG TCA GGC TTT CTT TCA CAG ATG TGG ATT GGC GAT AAA AAA

I) A И V E E И К A A G H Y Q

AAC GCC TGG GTC GAA CGC TGG AAG GC G GCG GGC CAT TAC CAG

К T L F I 3 E К T Y E I D G

AAA ACC TTA TTT АТС AGC CGG AAA АС С TAC CGG ATT GAT GGT

Q V A E E U Я Cil L ■ ■ G L G P Q

CAG GTA GCA GAG CGG GTA AAC TGG CT С GGA TTA GGG CCG CAA

3 E и G L E С G T E E L H Y

AGC GAA AAC GGT CTG CGC TGC GGG AC G CGC GAA TTG AAT TAT

L H A E E G T W L II I D G F

CTG CAC GCG GAA GAA GGC АСА TGG CTG AAT АТС GAC GGT TTC

T H

АСС AT G T D АСС GAT P 3 CCC TCA D E GAT GAA L 3 CTG AGC » К CAT AAA 3 L TCT TTA 3 A AGC GCC 1) G ААС GGC E С CGC TGT E ■ M CGC TGG M I TGG АТС К И AAA TGG P E CCC CGT H II AT G ААС

H 3

CAT AGC E 3

GAG AGC

■A A

GCC GCG

Q L

CAA CTG

A E

GCC GAA

3 G

AGT GGT

E H

GAA AAC

G P

GGC CCA Ildt I

H H

|цт Атд

GTG AtC CCC ATG T1Л' ICC TIA TGC TCT GAT GAG GAG GCC CTG CCT CTG

I T D 3 L A U U L U E E D И E II

ATT ACG GAT TCA CTG GCC GTC GTT TTA CAA CGT CGT GAC TGG GAA AAC

E P 3 4 4 L E 3 L II G E M E F A

CGC С CT TCC CAA CAG TTG С GC AGC CTG AAT GGC GAA TGG CGC TTT GCC

H В U M H G Y D A- ■P I Y T II и T

AAC TGG CAG ATG CAC GGT TAC GAT GCG CCC АТС TAC ACC AAC GTG ACC

3 В L Q E G Q T E I I F D G U II

AGC TGG СТА CAG GAA GGC CAG ACG CGA ATT ATT TTT GAT GGC GTT AAC

A F L E A G E H E L A и M U L E

GCA TTT TTA CGC GCC GGA GAA AAC CGC CTC GCG GTG ATG GTG CTG CGC

P T T Q I 3 D F H U A T E F 11 D

CCG ACT АСА CAA АТС AGC GAT TTC CAT GTT GCC ACT CGC TTT AAT GAT

M Q G E T (3 U A 3 G T A P F G G

TGG CAG GGT GAA ACG CAG GTC GCC AGC GGC ACC GCG CCT TTC GGC GGT

E I P 11 L Y E A U U E L H T A D

GAA АТС CCG AAT CTC TAT С GT GCG GTG GTT GAA CTG CAC ACC GCC GAC

К P L L I E G U 11 E H E H H P L

AAG CCG TTG CTG ATT С GA GGC GTT AAC CGT CAC GAG CAT CAT CCT CTG

3 H Y P H H P L M- Y T L С D E Y

TCG CAT TAT CCG AAC CAT CCG CTG TGG TAC ACG CTG TGC GAC CGC TAC

L P A H 3 E E и T E H U Q E D E

СТА CCG GCG ATG AGC GAA С GC GTA ACG CGA ATG GTG CAG CGC GAT CGT

К 3 U D P 3 E P U Q Y E G G G A

AAA TCT GTC GAT CCT TCC С GC CCG GTG CAG TAT GAA GGC GGC GGA GCC

3 I К К И L 3 L P G E T E' P L I

TCC АТС AAA AAA TGG CTT TCG СТА CCT GGA GAG ACG CGC CCG CTG АТС

L Q G G F V M D И U D Q 3 L I К

TTA CAG GGC GGC TTC GTC TGG GAC TGG GTG GAT CAG TCG CTG ATT AAA

G L U F A D E T P H P A L T E A

GGT CTG GTC TTT GCC GAC С GC ACG CCG CAT С CA GCG CTG ACG GAA GCA

D 11 E L L H В M U A L D G К P L

GAT AAC 1С0ГТТТ] CTG CAC TGG ATG GTG GCG CTG GAT GGT AAG CCG CTG

A G Q L M L T U' ■E U и Q P II A T

GCC GGG CAA CTC TGG CTC АСА GTA CGC GTA GTG CAA CCG AAC GCG ACC

3 H A I P II L T T 3 E H D F С I

TCC CAC GCC АТС CCG CAT CTG ACC ACC AGC GAA ATG GAT TTT TGC АТС

L T P L E D Q F T E A P L D II D

CTG ACG CCG CTG CGC GAT CAG TTC ACC CGT GCA CCG CTG GAT AAC GAC

A A L L Q С T A D T L A- D A U L

GCA GCG TTG TTG CAG TGC ACG GCA GAT АСА CTT GCT GAT GCG GTG CTG

Q H A I T V D U E U A 3 D T P H

CAA ATG GCG ATT ACC GTT GAT GTT GAA GTG GCG AGC GAT АСА CCG CAT

Y P D E L T A A С F D E M D L P

TAT CCC GAC CGC CTT ACT GCC GCC TGT TTT GAC CGC TGG GAT CTG С CA

H Q M E G D F Q F H I 3 E Y 3 и

CAC CAG TGG CGC GGC GAC TTC CAG TTC AAC АТС AGC CGC TAC AGT CAA

CGC TGT GAC CTG AAG GAG AAT CTG

P G CCT GGC M Г TGG TTT

Y P TAT CCC

3 A TCG GCG В 3 TGG AGT D F GAT TTC E I GAA ATT

G T GGC ACG H G CAT GGT

G L GGC CTG H H AAT CAC D T GAC АС С L С СTT TGC

Y D TAT GAT

К H AAA CAC

A 3

GCA AGC

А И

GCA TGG

E L

GAG CTG

I G

ATT GGC

I T

ATT ACG

P A

CCG GCG L 3

TTG TCA Q Q

CAG CAA

V

GTT P CCG I

ATT

Г TTT D GAC 3

AGC I

АТС L CTG Q CAG

Y TAT

P CCG

T ACG

E GAA

E GAA Q CAG

G GGT 3

TCA

G GGT

U G ТА

T АСС E С GG

D GAC L CTG

T

АС С A GCA

T ACG

H CAT G

GGC E С GC D GAT I

ATT U GTC

V GTG

3

AGT

A GCC

Y TAC

Я AAC Q CAG

E

GAA E GAA

I) AAT 3

AGT

A G CT I

ATT

H ATG

H ATG

1

CAA P

С CA TT

GTC L

CTG 3

AGT A

GCT E

GAG E

GAA H ATG U

GTG U

GTG T АС С

A

GCC G

GGC Q CAG

T?

GTG

A

GCC К AAG E

GAA H

CAC G

GGC Y TAT E

GAA

L

CTT E

GAA

m

AAT

И TGG

Y TAT

V

GTA

E

CGT A

GCA D

GAT D

GAT I

АТС

D

GAT H

CAC H AAC F

TTT

p

CCT G GGG

E

CGT A ■ GC G A

GC G L

CTG T АС С

T АС С

G I GGG ATT

G G D D GGT GGC GAC GAC

3- M 3 P 3 U 3 A TCC TGG AGC CCG TCA GTA TCG GCG

EcoEI E F l&A TTC|

Q L 3 CAG CTG AGC

И E L A A

AAT CGC CTT GCA GCA

А U P E 3

GC G GTG CCG GAA AGC

P P F T? P

CC G CCG TTT GTT CCC

С II G E В

TGC AAC GGG CGC TGG

L- ■E D Í D

CTG GAA GAT CAG GAT

L E A E U

CTG GAG GCT GAA GTT

G G Y A D

GGT GGT TAT GCC GAT

E A С D U

GAA GCC TGC GAT GTC

E Q T H U

GAG CAG ACG ATG GTG

E A II I E

GAA GCC AAT ATT GAA

I И 3 L G

АТС TGG TCG CTG GGG

I ■ ■ I С P H

ATT ATT TGC CCG ATG

A H G 11 3

GC G ATG GGT AAC AGT

P И 3 A Y

CC G TGG TCG GCT TAC

F Q F E L ■

TTC CAG TTC CGT TTA

L D 4 A P

CTG GAT GTC GCT С CA

H I 3 A В

CAC АТС AGC GCC TGG

И Q F 11 E

TGG CAA TTT AAC CGC

■T E I D P

АС С CGC ATT GAC CCT

И Q H Q- G

TGG CAG CAT CAG GGG

H С Q L A

AAC TGC CAG CTG GC G

P Y V F- P

CC G TAC GTC TTC CCG

3 H E H L

AGC CAT CGC CAT CTG

Y H Y î L

TAC CAT TAC CAG TTG

GTC TGG TGT CAA AAA TAAGCAGCC^ÇmjA

34

ЗНиСО ИЮЛЬ №7 (244)

Рис. 3. Результаты определения ß-галактозидазной активности в лизате биомассы E. coli TG1, несущей конструкцию pQL-Int, c использованием хромогенного субстрата X-gal. Обозначения лунок: T — суммарный грубый лизат биомассы, S — растворимая клеточная фракция, I — нерастворимая клеточная фракция, цифрами обозначены номера фракций, полученных в результате хроматографии

X-gal). Планшеты с реакционной смесью инкубировали при 37°С в течение 15 ч. Измерение оптической плотности проводили при 620 нм на спектрофотометре «Microplate Reader» Model 680, BioRad (рис. 3)

Очистку белка проводили методом гель-фильтрации в нативных условиях. Сконцентрированную до 5 мл сухим диализом против полиэтиленгликоля 6 000 и осветленную высокоскоростным центрифугированием растворимую клеточную фракцию наносили на хро-матографическую колонку с сорбентом для гель-фильтрации Sephacryl S-200 fine со скоростью 5 мл/мин, используя жидкостную хромато-графическую систему низкого давления «AKTA-Purifile» (GE Healthcare, США). Разделение проводили в буфере (Трис-HCl 10 мМ, pH = 8,6), содержащем 100 мМ NaCl, с целью удаления низкомолекулярных клеточных белков. Белок наносили в объеме 4 мл, элюировали в объёме 7 мл. ß-галактозидазную активность фракций измеряли, как описано выше (рис. 3).

Полученные результаты свидетельствуют о сохранении ферментативной активности белка PSI-LacZ в очищенных фракциях. Этот белок может служить в качестве высокочувствительного зонда для выявления очагов инфекции ханта-вирусов и для выявления очагов фотоповреждения в капиллярах сетчатки у экспериментальных животных.

Настоящая работа выполнена при финансовой поддержки Министерства образования и науки РФ в рамках Федеральной целевой программы (Государственный контракт № 14.516.11.0090 от 2013 г.).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Anzai K, Yoneya S, Gehlbach PL, Imai D, Wei LL, Mori K. Laser photocoagulation and, to a lesser extent, photodynamic therapy target and enhance adenovirus vector-mediated gene transfer in the rat retina //Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005. Vol.4. № 10. P. 3883—3891.

2. Gavrilovskayal.N., Shepley M., Shaw R., Ginsberg M.H., Mackow E.R. b3 integrins mediate the cellular entry of hantaviruses that cause respiratory failure //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Microbiology. 1998. Vol. 95. P. 7074—7079.

3. Matthys V.S., Gorbunova E.E., Gavrilovskaya I.N., Mac-kow E.R. Andes Virus Recognition of Human and Syrian Hamster b3-Integrins Is Determined by an L33P Substitution in the PSI Domain //J. Virol. 2010. Vol. 84. № 1. P. 352—60.

4. Raymond T.,Gorbunova E.,Gavrilovskaya I.N.,Mackow E.R.. Pathogenic hantaviruses bind plexin—semaphorin—integrin domains present at the apex of inactive, bent b3 integrin conformers. //PNAS. 2005. Vol. 102. № 4. P. 1163—1168.

Контактная информация:

Шевелев Алексей Борисович, тел.: 8 (495) 841-90-50, e-mail: shevel_a@hotmail.com

Contact information: Shevelev A

phone: 8 (495) 841-90-50, e-mail: shevel a@hotmail.com