Применение иттербиевых комплексов порфиринов в люминесцентной диагностике и тераностике новообразований Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»



МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ «ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ» 83

изохромосома 17 с потерей короткого плеча, где располо- действующее вещество. Также стоит отметить, что моди-жен ген ТР53. Наличие большого количества геномных фикация паклитаксела лигандом, содержащим 3 углевод-нарушений предполагает экспрессию широкого спектра ных остатка, значительно увеличивает его растворимость опухолевых антигенов. в воде, что является важной проблемой для препаратов Заключение. Для создания дендритноклеточной вак- таксанового ряда. цины может быть использован лизат клеточной линии Mel Заключение. В результате работы с хорошим выходом A052 в качестве источника опухолевых антигенов в тех слу- было получено несколько конъюгатов противоопухолево-чаях, когда опухолевый материал самого пациента недо- го препарата паклитаксела и эффективного лиганда ступен. ASGPR. Соединение-лидер продемонстрировало хорошую растворимость в воде и оптимальную цитотоксичность, А.Д. Чупров1, С.Ю. Маклакова1, В.В. Гото1, в связи с чем планируется дальнейшее изучение его биоло-И.В. Салтыкова1, Е.К. Белоглазкина1-2, Н.В. Зык1, гических свойств. А. Г. Мажуга1-2-3 Работа выполнена при поддержке РНФ синтез и биологические исследования (грант № 17-74-30012). противоопухолевых препаратов направленного действия на основе И.П. Шилов1. Ю.В. Алексеев2, А.М. Ковалева3. лиГАндов ASGPR К.С. Щамхалов1, В.Д. Румянцева1, М.И. Ковалев3, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия; Н.П. Ивановская1, А.В. Иванов4 2ниту «мисис», Москва, Россия; применение иттербиевых комплексов 3РХТУ им. Д. И. Менделеева, Москва, Россия ПорФиринов в лЮминЕСЦЕнТной введение. На поверхности клеток гепатоцеллюлярной диАГноСТикЕ и ТЕрАноСТикЕ карциномы в большом количестве представлен асиалогли- новообразований копротеиновый рецептор (ASGPR). Селективное связы- Фрязинский филиал ФГБУНИРЭ РАН, Фрязино, Москов-вание с остатками галактозы и N-ацетилгалактозамина, ская область, Россия; а также способность переносить через мембрану высоко- 2ФГБУГНЦЛМФМБА России, Москва, Россия; молекулярные соединения делают ASGPR удобной мише- 3ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава нью для направленного транспорта терапевтических аген- России (Сеченовский Университет), Москва, Россия; тов. На сегодняшний день известен ряд подобных систем 4ФГБУ«НМИЦонкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава на основе наночастиц, в то время как ковалентные конъю- России, Москва, Россия гаты лекарств и лигандов ASGPR изучены мало. введение. Иттербиевые комплексы порфиринов Цель исследования. Синтез и биологическое тестиро- (ИКП) перспективны для ранней люминесцентной диаг-вание конъюгатов лигандов ASGPR с противоопухолевым ностики (ЛД) новообразований в спектральном диапазоне препаратом паклитакселом. 700—1000 нм. Помимо этого, недавно было показано, материалы и методы. Полученные вещества исследо- что разработанные ИКП с успехом могут быть использовали с помощью спектроскопии ЯМР 'H и 13С, масс-спек- ваны для целого ряда процессов тераностики рака. трометрии высокого разрешения, ВЭЖХ-МС. В работе Цель исследования. Разработка и апробация методов использовали клеточные линии HepG2 (клетки гепатоцел- ближней ИК (БИК) — люминесцентной диагностики (ЛД) люлярной карциномы человека). и тераностики различных новообразований на базе исполь- результаты. Ранее в нашей лаборатории был получен зования различных ИКП. лиганд ASPGR разветвленного строения, содержащий материалы и методы. При создании основ метода 3 углеводных остатка. Аффинность исследуемого соедине- БИК-ЛД использовался разработанный нами иттербиевый ния оказалась на несколько порядков выше, чем аффин- комплекс 2,4-диметоксигематопорфирина IX (ИКДГ). Ис-ность нативного лиганда N-ацетилгалактозамина (кон- следования люминесцентного диагностического контраст-станты диссоциации комплексов рецептор—лиганд равны ного индекса (ЛДКИ) патология/норма осуществлялись 2.16 и 691.9^103 нМ соответственно). На его основе был в Первом МГМУ им. И.М. Сеченова у пациентов с различ-синтезирован ряд конъюгатов с известным противоопухо- ными заболеваниями. При разработке новых методов те-левым препаратом — паклитакселом. Для конъюгатов было раностики рака применялся как ИКДГ, так и иттербиевый произведено измерение цитотоксичности на клеточной комплекс диметилового эфира протопорфирина IX линии HepG2 с использованием стандартного MTS-теста. (ИКДМЭПП). Для одного из конъюгатов наблюдали эффект, сравнимый результаты. Было установлено, что разработанные с исходным препаратом. С помощью иммунофлуоресцент- ИКП для БИК-ЛД обладают повышенной тропностью ной микроскопии провели морфологические исследования к патологически измененным тканям, а измеренный ядра и цитоскелета клеток. После обработки клеток пакли- ЛДКИ патология/норма составил 2,5—15,0 в зависимости такселом наблюдались характеристические изменения: от типа патологического процесса и, соответственно, кон-нарушения процесса митоза, большое количество ненор- центрации ИКДГ. Для целей создания нового способа те-мальных ядер и т. д. Подобные морфологические измене- раностики нами была проведена попытка синтеза наноча-ния наблюдали и в случае инкубирования клеток с конъю- стиц, содержащих ядро оксидов железа и полимерную гатом. В совокупности это говорит о способности оболочку типа Лексан, включающую ИКДМЭПП. При конъюгата проникать в целевые клетки и высвобождать этом предполагается, что наночастицы оксидов железа

Спецвыпуск / том 17 / 2018 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

84 МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ «ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ»

в дальнейшем будут ответственны за проведение процеду- для 9 проб с различным содержанием аранозы в пределах ры локальной ферромагнитной гипертермии (ЛФМГ). аналитической области методики. Обработка эксперимен-Заключение. Разработаны метод БИК-ЛД новообразо- тальных данных показала, что результаты количественно-ваний кожи и слизистых оболочек на основе использова- го определения аранозы в ЛФ хорошо описываются линей-ния ИКДГ, а также новый метод тераностики новообразо- ной зависимостью по уравнению y = 1,3357х + 0,0195, ваний на основе наноразмерных ИКП: БИК-ЛД а коэффициент корреляции r = 0,9980 и отвечает условию в сочетании с ЛФМГ. |r| > 0,99. Для оценки правильности методики проведены определения в модельных смесях, соответствующих 80, 100 З.С. Шпрах, Е.В. Игнатьева, И.В. Ярцева и 120 % содержания аранозы. Точность методики оцени-вАлидАЦия методики количественного вали по результатам анализов 7 образцов в 2 сериях, отли-оПрЕдЕлЕния аранозы в лекарственной чающихся временем выпуска и серией субстанции, из ко-ФормЕ торой была наработана ЛФ аранозы. Относительная ФГБУ«НМИЦонкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава погрешность определения в 2 сериях составила 0,66 России, Москва, Россия и 0,86 %. Численное значение коэффициента нормиро-введение. Араноза — отечественный противоопухоле- ванных отклонений (коэффициента Стьюдента), рассчи-вый препарат, созданный в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. танное по результатам анализа, составило 1,97 и 1,31 со-Н.Н. Блохина» Минздрава России и применяемый в кли- ответственно, что ниже табличного значения (2,45; 95 %; нической практике для лечения злокачественной меланомы f = 6). Для оценки воспроизводимости проанализировано как в монотерапии, так и в комбинации с другими проти- по 6 образцов одной серии 2 сотрудниками в разные дни. воопухолевыми препаратами. Количественное определение Относительная ошибка среднего результата для 2 исследо-активного вещества — один из важных показателей стан- вателей составила 0,79 и 0,80 %, а численное значение ко-дартности лекарственного препарата (ЛП), служащий эффициента Стьюдента, рассчитанное по результатам для оценки качества готового ЛП и его стабильности как анализа, также меньше табличного значения. в процессе производства, так и при обращении на фарма- Заключение. Показано, что полученные результаты яв-цевтическом рынке. ляются правильными, предложенная методика количест-Цель исследования. Валидация методики количествен- венного определения не отягощена систематическими ного определения аранозы в ЛП. ошибками и обладает достаточной точностью. материалы и методы. Образцы лекарственной формы (ЛФ) аранозы; УФ-спектроскопия, методы статистической М.А. Щедрина1, Н.Д. Олтаржевская2, М.А. Коровина2, обработки результатов. И.В. Решетов1, И.В. Гусев2 результаты. Количественное определение аранозы возможности БиоПолимЕрнЫХ проводили спектрофотометрически, измеряя оптическую композиций нА оСновЕ ПолиСАХАридов плотность водных растворов в наиболее интенсивном мак- для стимуляции регулируемой Атипичной симуме поглощения Xmax 240 ± 2 нм относительно раствора рЕПАрАТивной рЕГЕнЕрАЦии мяГкиХ ТкАнЕй смеси вспомогательных веществ. Для снижения система- ФГАОУВО «Первый МГМУим. И.М. Сеченова» Минздрава тических и случайных ошибок в методику анализа ввели России (Сеченовский Университет), Москва, Россия; способ расчета по стандартному образцу. В качестве рас- 2ООО «Колетекс», Москва, Россия твора стандартного образца использовали раствор субстан- введение. Современные медико-психологические ции аранозы и вспомогательных веществ в воде, а в каче- и социально-экономические аспекты качества жизни стве раствора сравнения — раствор вспомогательных пациента, в том числе онкологического профиля, опре-веществ в воде в соответствующих концентрациях. Вали- деляют необходимость в создании биотехнологии управ-дацию методики количественного определения аранозы ляемого атравматичного восстановления целостности в препарате «Араноза, лиофилизат для приготовления поврежденных мягких тканей, минимизирующей риск раствора для инъекций, 0,5 г» проводили в соответствии развития осложнений. с требованиями ГФ XIII на образцах препарата и модель- Цель исследования. Создание биополимерной ком-ных смесях, полученных в лабораторных условиях. Ис- позиции на основе полисахаридов, способной к разме-следовали следующие валидационные характеристики: щению в дефектах мягких тканей различной конфигура-специфичность, линейность, правильность, прецизион- ции и объема, образовавшихся в том числе после ность (сходимость и внутрилабораторная прецизионность). онкологических операций, с последующей биодеграда-Было показано, что присутствие в лиофилизате аранозы цией и высвобождением в заранее определенные сроки вспомогательных веществ не влияет на положение макси- импрегнированных в ее матрицу препаратов, активизи-мумов поглощения в электронных спектрах поглощения. рующих процессы регенерации с последующим аутоген-Небольшое собственное поглощение раствора вспомога- ным восполнением дефекта. тельных веществ (около 0,06 единиц оптической плотно- материалы и методы. Выбор основы биополимерной сти) компенсируется использованием этого раствора в ка- композиции был сделан исходя из требуемых оптимальных честве раствора сравнения, то есть разработанная биоинженерных свойств веществ, способствующих восста-методика специфична в отношении аранозы. Линейность новлению поврежденных тканей. В связи с этим к рассмо-методики проверяли экспериментально, измерением ана- трению была принята гидрогелевая форма биополисахари-литического сигнала (значение оптической плотности) дов. После проведения биологических испытаний

Спецвыпуск / том 17 / 2018 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ «ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ» 85

основными полимерами для создания биополимерной композиции были выбраны альгинат натрия и смесь аль-гинат натрия/гиалуронат натрия в соотношении 70/30. Дополнительно в качестве антимикробного агента в полимерную матрицу были введены частицы наносеребра, полученные микробиологическим способом. Далее было проведено экспериментальное изучение регенераторных возможностей разработанных полимерных матриц различного состава.

результаты. На основании анализа результатов па-тологогистологического исследования мягких тканей однотипно сформированных обширных дефектов, независимо от длительности течения раневого процесса, при применении биополимерных композиций, разработанных на основе альгината натрия (альгинат, альгинат с серебром, смесь альгината и натриевой соли гиалуроновой кислоты) были получены морфологические признаки стимулированной репаративной регенерации в области дефекта мягких тканей. При сравнении выраженности стимулирующего действия биополимерных композиций на регенеративные процессы в мягких тканях преимущество наблюдалось при объемном замещении приобретенного дефекта альгината натрия с модифицированным серебром. Далее в порядке убывания — альгинатом, альгинатом в сочетании с солью гиалуроновой кислоты. Отсутствие морфологических признаков наличия рассматриваемых биополимеров в тканях к 14-м суткам после помещения в зону мягкотканного дефекта подтвердило целесообразность и эффективность применения гидрогелевой структурной формы и способность использованных биополисахаридов к биодеградации, обеспечивая полную безопасность данного материала. Было установлено, что при хронизации раневого процесса активизация регенераторных возможностей мягких тканей в зоне мягкотканного дефекта замедлена. Применение биополимерной композиции с инкорпорированными ионами серебра, обладающими антибактериальной активностью, снижает уровень инфицирования раны и синергично активизирует репаративный процесс.

Заключение. Структурные биополисахариды обладают свойствами, принципиально отличающими их от других классов биополимеров: высокая биосовместимость с тканями, управляемая биодеградация и биорезорбция, структурная комбинаторность, управляемая функциональная композиционная синергия. Сочетая эти характеристики возможно создание управляемых многокомпонентных биокомпозиций, создающих в ране условия, активизирующие процессы регенерации, с последующим неинвазивным объемным восполнением дефекта развившейся аутотка-нью, таким образом, избегая развития иммунологического отторжения.

Работа выполнена в рамках гранта РФФИ № 15-29-04847.

А.И. Щербаков1, А.С. Гриневич1, Е.Н. Кособокова1, М.В. Пинюгина1, Е.В. Шешукова2, В.С. Косоруков1

сравнение антигенных Эпитопов HER2 моноклональных антител трастузумаба и фитотрастузумаба

1ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва, Россия;

2НИИФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия

введение. Моноклональные антитела в случае взаимодействия с большими молекулами класса белков связываются не со всей молекулой, а с отдельным ее участками, имеющими размер от нескольких до десятков аминокислот. Рецептор HER2 является важной мишенью противоопухолевой терапии при лечении рака молочной железы (РМЖ). Положение эпитопа на поверхности молекулы HER2, с которым связывается моноклонально антитело, может значительно влиять на его биологический эффект. В настоящее время в клинической практике применяют препарат на основе анти-НЕЯ2 моноклональных антител — трастузумаб. В случае трастузумаба эпитопом является участок ГУ субдомена внеклеточного домена HER2. Использование трастузумаба снижает риск развития отдаленных метастазов и увеличивает выживаемость пациентов. Трастузумаб производится в культуре животных клеток и стоит достаточно дорого. Альтернативой может быть получение рекомбинантных терапевтических антител в растениях методом транзиторной экспрессии.

Цель исследования — сравнение специфического связывания с антигеном HER2 и с ГУ субдоменом рецептора HER2 рекомбинантных антител, полученных классическим способом в культуре клеток и полученных в растительной биомассе.

Материалы и методы. Фитоантитела получали в листовой пластине Nicotiana benthamiana методом транзиторной экспрессии. Для внедрения вирусных векторов в клетки листьев Nicotiana benthamiana применяли метод агроинфек-ции. Инфицирование осуществляли культурами клеток штамма A. tumefaciens GV-3101, которые были предварительно трансформированы конструкциями VTM-PT-HC и PVX-PT-LC. Эти конструкции обеспечивали экспрессию тяжелых и легких цепей рекомбинантного анти-НЕК2-ан-титела в клетках листа растения. Собранные листья гомогенизировали и подвергали экстракции. Экстракт фильтровали и очищали хроматографическими методами. Контроль и оценка уровня экспрессии анти-НЕК2-фито-антител осуществлялся с помощью метода электрофореза в ПААГ и ИФА. При исследовании связывания с рецептором полученных анти-НЕК2-фитоантител использовали метод проточной цитометрии. Работу проводили с HER2-положительными клетками РМЖ SK-BR-3. Специфичность связывания тестировали с помощью кроличьих антител против антител человека, конъюгированных с пероксидазой хрена. Для анализа связывания полученных анти-HER2-фитоантител с ГУ субдоменом внеклеточного домена рецептора HER2 была применена методика анализа конкурентного связывания с антигеном HER2 на поверхности клеток между анти-HER2-фитоантителами и трастузумабом. Эксперимент осуществляли методом

Спецвыпуск / том 17 / 2018

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ