CC BY
22
Материалы X съезда ВНПОЭМП, Москва, 12-13 апреля 2012 г.
Инфекция и иммунитет
gondii; E1, E2, core вируса краснухи; pp 28, pp 38, pp 52, pp 65, pp 150, protein mosaic цитомегаловируса; VP1 и VP2 парвовируса B19; gD1, gG1 вируса герпеса
1 типа; gD2, gG2 вируса герпеса 2 типа; p18 (capside), p54 (ENA), EBNA вируса Эпштейна—Барр.
Использование конъюгата, состоящего из смеси антител к IgG человека и антител к IgM человека, модифицированных флуорофорами Су5 и Cy3 соответственно, и учет результатов с помощью многоканального флуоресцентного сканера позволяют проводить дифференциальное выявление антител классов G и M. Таким образом, предложенный иммуночип позволяет заменить постановку комплексного анализа с применением 14 тест-систем подобного назначения в формате ИФА. Общее время инкубаций с исследуемыми образцами и конъюгатом не превышает 1 час, для проведения анализа требуется не более 10 мкл сыворотки/плазмы крови.
Нами сформирована коллекция сывороток крови пациентов, содержащих и не содержащих антитела классов G и M, к возбудителям TORCH-инфекций на основании данных ИФА, полученных от врачей клинической практики Центра молекулярной диагностики. Продемонстрированы высокие показатели чувствительности и специфичности иммуночипа.
ОПЫТ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ НОВЫХ ВАРИАНТОВ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ В ДЕТЕКЦИИ CHLAMYDIA TRACHOMATIS
А.В. Чемерис1, Д.А. Чемерис1, В.В. Федотова2, А.Р. Мавзютов2
1Институт биохимии и генетики УНЦ РАН;
2 ГБОУ ВПО БГМУМинздравсоцразвития России, г. Уфа
С Chlamydia trachomatis связывают инфекционные процессы, при которых поражается преимущественно цилиндрический эпителий слизистых урогенитального тракта, носоглотки и конъюнктивы глаз. Вне зависимости от локализации течение заболевания отличается тяжестью ввиду облигат-ного внутриклеточного паразитизма возбудителя, длительностью течения и выраженностью осложнений, для предотвращения которых необходимо своевременное назначение достаточно специфических антибактериальных препаратов. Указанное предопределяет срочность и точность лабораторной диагностики.
Наиболее специфичным и чувствительным методом, широко применяемым для диагностики всех вариантов хламидиоза в настоящее время, является ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации. Однако этот метод имеет ряд известных недостатков, что послужило мотивацией для наших исследований.
В частности для видовой мультиплексной детекции и идентификации всех вариантов C. trachomatis нами впервые были подобраны и применены универсальные праймеры комплементарные фрагменту гена 16S рРНК, отличающиеся возможностью их «отжига» встык. Это позволило без снижения чувствительности и специфичности метода существенно сократить продолжительность каждого цикла амплификации ввиду образования целевого ампликона вследствие полимеризации ДНК и формирования очень короткого участка новой ее цепи. Размер амплифицируемого фрагмента гена 16S рРНК для C. trachomatis составил 45 пар нуклеоти-дов. В дальнейшем представленная система была ис-
пытана на 60 положительных контрольных образцах (соскобы из уретры у мужчин и цервикального канала у женщин), подтвержденных стандартной ПЦР. В 100% случаев были получены положительные результаты при существенном сокращении продолжительности исследования. Таким образом, создана основа для разработки и внедрения нового лабораторного метода.
Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 гг., в рамках реализации мероприятия № 1.2.1. ГК № П385 от 30.07.2009.
СПОСОБНОСТЬ АНТАГОНИСТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ШТАММОВ ЛАКТОБАЦИЛЛ ФОРМИРОВАТЬ БИОПЛЕНКИ
Ю.В. Червинец, В.М. Червинец, А.М. Самоукина, Е.С. Михайлова, Е.А. Беляева
ГБОУ ВПО Тверская ГМА Минздравсоцразвития России
Актуальность. Биопленки — сообщество микроорганизмов, прикрепленных к поверхности определенного биотопа (O'Toole G, 2000). Известно, что микроорганизмы претерпевают огромные изменения во время их перехода от планктонных организмов (свободно плавающих) в клеточные, как часть единого комплекса. Эти изменения отражены в новых фенотипических характеристиках, образованных биопленками бактерий, и возникают в ответ на различные экологические сигналы. На сегодняшний день исследования показывают, что переход от планктонного роста в биопленки является строго регулируемым процессом. Сформированная биопленка как новая система служит для изучения микробного развития.
Цель: определить способность антагонистически активных штаммов лактобацилл разных биотопов желудочно-кишечного тракта формировать биопленки.
Материал и методы. Материалом для исследования служило 20 антагонистически активных штаммов лактобацилл, выделенных из полости рта, желудка и кишечника 300 здоровых людей разных возрастных групп (мужчин — 140, женщин — 160). Тестирование лактобацилл на способность формировать биопленки проводили в стерильных пластиковых чашках Петри (диаметром 90 мм) со стеклышками по методике, описанной Романовой Ю.М., 2006.
Результаты. При тестировании лактобацилл на способность образовывать биопленки выявлено, что лактобациллы располагаются тесно прилегающими друг к другу скоплениями на дне чашек Петри и покровных стеклах. Определение оптической плотности (ОП) клеток лактобацилл показало, что ОП лактобацилл, выделенных из полости рта, образовавших биопленку на чашке, была на порядок выше (от 0,037 до 0,225), чем на стекле (от 0 до 0,076). У всех лактобацилл, выделенных из желудка, выявлена биопленка, ОП которой на чашке колебалась от 0,124 до 0,191, а на стекле — от 0,033 до 0,063. Лактобациллы, выделенные из кишечника, формировали биопленку на чашке Петри, ОП клеток колебалась от 0,144 до 0,449. Только у 3 штаммов лакто-бацилл кишечника выявлена биопленка на стекле, оптическая плотность: от 0,018 до 0,056.
Выводы. У всех антагонистически активных штаммов лактобацилл выявлена способность формировать биопленку. Оптические плотности лак-тобацилл, выделенных из различных биотопов,
2012, Т. 2, № 1-2
Современное лабораторное обеспечение.
формирующих биопленку на чашке, значительно превышают ОП лактобацилл на стекле. Колебания оптической плотности лактобацилл на чашке составляют от 0,037 до 0,449, на стекле — от 0 до 0,076.
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛИОФИЛИЗАЦИИ КОЛЛЕКЦИОННЫХ ШТАММОВ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ
H.С. Червякова, Т.В. Валова, А.В. Осин
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», г. Саратов
Одной из задач коллекционных центров является совершенствование методов консервации культур микроорганизмов с сохранением их первоначальных свойств. К одному из таких методов относится лиофилизация, технология применения которой устарела, и требует внедрения новых аппаратных комплексов, способных упростить и автоматизировать данный процесс.
В качестве объекта исследования выбрано восемь тест-штаммов видов: Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Shigella flexneri, S. sonnei, Escherichia coli. Определена оптимальная программа сублимации на камерной сушке Martin Christ Epsilon 2—6D, при использовании которой полный цикл высушивания препарата осуществляется за 7 часов в полностью автоматическом режиме. Проведено изучение выживаемости лиофилизированных культур и оценка времени их хранения. Установлено, что во всех случаях значительная часть клеток микроорганизмов сохраняется живыми. Показатель выживаемости клеток составил от 75 до 50%, что соответствует средним значениям, характерным для каждого из использованных видов бактерий, при их лиофи-лизации. Для определения возможных сроков хранения полученных препаратов микроорганизмов при температуре 4°C использовали ускоренный тест прогнозирования выживаемости лиофилизирован-ных культур. Показано, что выживаемость сублимированных клеток резко падает с увеличением температуры их хранения. Обработка экспериментальных данных позволила определить динамику выживаемости высушенных клеток от времени хранения при разных температурах. Полученные сведения были однотипны, что свидетельствует о наличии единой закономерности, которой подчиняется отмирание клеток лиофилизированных штаммов. Данные о падении жизнеспособности высушенных бактерий при повышенных температурах позволили оценить время 50% снижения количества жизнеспособных бактерий в высушенных образцах (t50). Установлено, что t50 для изучаемых штаммов шигелл составляет
I,5 года, кишечной палочки — 2,2 года, E. fecalis — 3,4 года, а золотистого стафилококка — 9,5 лет.
Таким образом, нами разработан методический подходлиофилизацииколлекционныхтест-штаммов патогенных бактерий III-IV группы патогенности с помощью камерной сушки Martin Christ Epsilon
2—6D. Определены высокая жизнеспособность клеток в полученных лиофилизированных препаратах ПБА и прогнозируемый срок хранения — не менее
3-х лет в зависимости от видовой принадлежности. Все вышеизложенное указывает на высокую эффективность предлагаемого подхода к совершенствованию лиофилизации коллекционных штаммов патогенных бактерий и на перспективность его внедрения в работу коллекционных центров.
К ВОПРОСУ О ЗНАЧЕНИИ МОНИТОРИНГА ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ В ДЕТСКИХ ИНФЕКЦИОННЫХ СТАЦИОНАРАХ
Л.В. Черкасова, Г.А. Петрушанская, А.Н. Карташева, Р.А. Бурханов
Филиал ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве» в САО города Москвы, Москва
Значение мониторинга цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) определяется широким распространением и тяжестью клинической картины этого инфекционного заболевания. У детей, особенно в раннем возрасте, ЦМВИ может протекать с полиорганным поражением и сопровождаться симптомами пневмонии, гепатита, менингита, что затрудняет постановку диагноза и оказание своевременной этиотропной терапии. Кроме того ЦМВИ осложняет течение основного заболевания. Все это обуславливает целесообразность мониторинга ЦМВИ при пребывании пациента в стационаре. Чаще всего это сводится к определению антител в иммуноферментном анализе (ИФА). Вместе с тем, информацию о наличии или отсутствии антител необходимо дополнить индикацией самого вируса, а по возможности и показателями уровня его репликации в организме. Нами с помощью наборов производства фирмы «ИзоГен» исследовались мазки из зева на предмет обнаружения ДНК цито-мегаловируса у 47 детей (от 1,5 до 5лет) с диагнозом бронхпневмония в отделении раннего возраста детской инфекционной больницы САО г.Москвы. У 16 пациентов (34%)обнаружена ДНК цитомегаловиру-са при поступлении в стационар и у 13 из них после проведения курса лечения, что свидетельствует о стойкой циркуляции вируса. Известно, что ци-томегаловирус способен реплицироваться в клетках эпителия слюнных желез. Это обстоятельство обуславливает наибольшую частоту обнаружения цитомегаловируса в слюне по сравнению с другими биологическими пробами.
Нам представляется, что забор мазков из зева и слизистой полости рта, являясь неинвазивной процедурой, способствует более широкому применению молекулярно-генетических исследований для оценки персистенции цитомегаловируса в организме таких пациентов.
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИСЕПТИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ МИКРОБИОТЫ ЗУБНОЙ БЛЯШКИ У ДЕТЕЙ С ЗУБОЧЕЛЮСТНЫМИ АНОМАЛИЯМИ
В.А. Чесноков1, М.Г. Чеснокова1, В.Г. Сунцов1, А.Ю. Миронов2
1ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России», г. Омск; 2ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Росздрава, Москва
В эксперименте проводили оценку действия антисептиков (мирамистина 0,01%, хлоргексидина 0,05%, хлоргексидина 0,1%) по отношению к тестируемым микроорганизмам, выделенным от детей находившихся на ортодонтическом лечении. Изучено 48 культур грибов рода Candida, идентифицированных до вида C. albicans, а также 63 культуры сопутствующих бактериальных ассоциантов. Определение чувствительности бактерий к антисептикам осущест-
