CC BY
33
УДК 661
Юдина А.Н. Красноштанова А.А.
СПОСОБ СЕЛЕКТИВНОГО ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ (IgY) ИЗ ЖЕЛТКА ЯИЦ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПТИЦЫ
Юдина Алеся Николаевна, студентка 4 курса факультета биотехнологии и промышленной экологии; Красноштанова Алла Альбертовна, доктор химических наук, доцент, профессор кафедры биотехнологии, e-mail: aak28@yandex.ru;
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20
Предложен способ выделения иммуноглобулинов IgY из яиц сельскохозяйственной птицы, основанный на технологии замораживания и самопроизвольного оттаивания. Электрофоретически проверена чистота иммуноглобулиновой фракции. Доказано присутствие легкой цепи IgY в полученном растворе. Ключевые слова: IgY, желточные антитела, метод очистки IgY, электрофорез в ПААГ, гель-хроматография
METHOD OF SELECTIVE ISOLATION AND PURIFICATION OF ANTIBODIES FROM POULTRY YOLK (IgY)
Yudina A.N., Krasnoshtanova A.A.
D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia
It was proposed the method of isolation of antibodies from poultry yolk (IgY) based on spontaneous freezing- thawing procedure. The purity of the immunoglobulin fraction was verified using polyacrylamide gel electrophoresis. The presence of a light chain in the IgY solution was proved to be a low-molecular compound.
Keywords: IgY, yolk antibodies, purification protocol, polyacrylamide gel electrophoresis, gel-chromatography
Введение
1§У в настоящее время рассматривают в качестве перспективной замены иммуноглобулинам млекопитающих (^С). Наибольший интерес представляет вариация их структурных особенностей, определяющих характерные иммунохимические свойства. Благодаря отсутствию шарнирной области, присущей 1§0, куриные антитела менее подвержены протеолитической деградации и фрагментации за счет присутствия на ее месте зоны ограниченной гибкости на основе пролиновых и глициновых аминокислотных остатков [1]. Более того 1§У не взаимодействуют с Бс-рецептором, ответственным за осуществление многочисленных эффекторных функций; не способны активировать каскады комплемента человека; не обладают перекрестной реактивностью и не связываются с ревматидным фактором (И£-фактором) [2]. В составе молекулы 1§У
имеются 2 легкие (Ь) и 2 тяжелые (Н) цепи, формирующие за счет переплетения дисульфидных связей мономерное звено (Н2Ь2). Их молекулярные массы равны 26 кДа и 71 кДа соответственно. Известно, что вариабельную часть Н-цепи кодирует область молекулы ДНК, имеющей следующие генные сегменты: вариабельный (V), соединительный (I) и сегмент разнообразия (Б), перестройка которых не способна внести вклад в развитие иммуногенетического разнообразия 1§У, что характерно для явления гиперконверсии генов.
Очищенные желточные антитела (1§У) способны сохранять свою активность в течение полугода при комнатной температуре. Кроме того, аффинно-очищенный и биотинилированный IgY сохраняет высокую активность после пяти лет хранения при 4 °С [1].
Именно поэтому разработанные ранее методы по выделению 1§У являются перспективными для внедрения их в технологии по разработке медицинских препаратов, пищевых добавок, входящих в состав функционального питания, а также создания современных тест-систем для ранней диагностики и профилактики многих заболеваний, что позволит сократить применение неинвазивных методов терапии над животными для получения антител млекопитающих (1§0) [3-4]. Для создания качественных медикаментов
вышеописанного типа необходимо провести очистку высокой степени, гарантирующей точный состав иммуноглобулиновой фракции. Таким образом, целью данной работы явилась разработка способа селективного выделения и очистки 1§У из желтка куриного яйца.
Материалы и методы
В качестве объекта исследования в работе был использован желток яйца
сельскохозяйственной птицы производства птицефабрики ОАО «Снежка» с влажностью -74%, содержанием жира в желтке -3 2, 6г/ 100г,
сырого протеина в белке - 10,6%, в желтке - 16,6%, фосфолипидов в желтке - 29,6%.
Содержание белка в растворах определяли - биуретовым методом; молекулярную массу цепей, входящих в состав IgY - методом денатурирующего электрофореза в ПААГ и методом гель-хроматографии. В качестве носителя использовали сефадекс марки G-50.
Ультрафильтрацию белковых растворов проводили на плоских мембранах УАМ-10. В концентрате определяли содержание влаги [4].
Экспериментальная часть
Согласно ранее опробованной методике по выделению IgY и подобранным условиям очистки от низкомолекулярных примесей, был получен раствор белка в результате разведения суспензии яичного желтка в 6 раз в предварительно подкисленной до pH 5,0 с помощью 0,2 н HCl воде и добавлении преципитирующего агента - хлорида натрия в концентрации 10% от массы раствора. Полученную суспензию заморозили при температуре -200С и декантировали от липидных компонентов фильтрованием во время самопроизвольного оттаивания. Образовавшаяся водорастворимая фракция затем была сконцентрирована на мембране УАМ-10 до содержания основного вещества не менее 95% в расчете на сухой вес. Удалось получить раствор белка с концентрацией 12,18 г/л [4]. Далее был проведен анализ на определение молекулярного веса H- и L-цепей IgY, поскольку электрофорез проводился в денатурирующих условиях. Для точной идентификации присутствия легкой цепи в полученной иммуноглобулиновой фракции, проводились повторное выделение и очистка суспензии. По завершении концентрирования раствора, полученную фракцию исследовали посредством гель-хроматографии.
Для определения фракционного состава белков в концентрате и оценки степени чистоты иммуноглобулина было решено провести электрофорез в полиакриламидном геле в
денатурирующих условиях. Электрофореграмма приведена на рис. 1.
Рис.1 - Электрофореграмма ^У
По данным электрофореза видно, что две полосы, соответствуют молекулярным массам легкой (28 кДа) и тяжелой (63 кДа) цепям иммуноглобулина класса У. На геле присутствуют несколько нижних полос - примесных белков, соответствующих приблизительно 15 кДа. Также было обнаружено наличие значительной доли других белков в диапазоне молекулярной массы 1-100 кДа, что говорит о недостаточно высокой степени чистоты полученной иммуноглобулиновой фракции.
Во избежание присутствия примесных компонентов, было решено провести повторную процедуру выделения 1§У, описанную раннее. Было установлено, что содержание белка в супернатанте после проведения преципитации составило 3,6 г/л. Далее было проведено концентрирование на мембране УАМ-10 с последующей отмывкой от соли и примесных низкомолекулярных веществ с помощью ультрафильтрации. Результаты
представлены в табл. 1.
Для подтверждения присутствия только Ь-цепи 1§У в иммуноглобулиновой фракции в качестве НМС явилось целесообразным провести гель-хроматографию на сефадексе марки в-50. Результат распределения белка по фракциям представлен на рис.2.
Кратность диафильтрации Интегральная селективность ф, % СВ диафильтрата, % Содержание белка в концентрате, г/л
1 88,6 6,9 6,5
2 99,5 3,2 12,7
Таблица 1 - Физико-химические показатели диафильтрата и концентрата
Рис.2 - Гель-хроматограмма для легкой (L) цепи IgY
Из приведенной хроматограммы следует, что легкая цепь иммуноглобулина присутствует в растворе иммуноглобулина. Согласно построенному калибровочному графику ее молекулярная масса составляет приблизительно 26 кДА что соответствует ранее изученным литературным данным [6].
Выводы
1. Электрофоретически проверена чистота иммуноглобулиновой фракции яичного желтка. Установлено, что данная фракция содержит значительное количество примесей низкомолекулярных белковых веществ и минеральных солей.
2. Подобраны условия очистки иммуноглобулина Y от низкомолекулярных примесей методом диафильтрации: мембрана УАМ-10, кратность диафильтрации - 2. Установлено, что содержание белка в препарате после диафильтрации составило 98% от сухого вещества.
3. Методом гель-хроматографии доказано присутствие легкой цепи IgY в низкомолекулярной фракции и отсутствие белковых соединений с меньшей молекулярной массой, что доказывает
эффективность выбранного метода очистки
диафильтр ацией.
Список литературы
1. E.P.V. Pereira, M.F. van Tilburg, E.O.P.T. Florean, M.I.F. Guedes / Egg yolk antibodies (IgY) and their applications in human and veterinaryhealth: A review. International Immunopharmacology 79(2019) 293-303
2. Warr, G.W., Magor, K.E. and Higgins, D.A. (1995). IgY: clues to the origins of modern antibodies. Immunol. Today 16, 392-398.
3. Юдина А.Н., Красноштанова А.А. Выбор оптимальной схемы выделения иммуноглобулинов из желтка яиц сельскохозяйственной птицы. «Биохимическая физика», Москва, 2019, с. 247-250.
4. Юдина А.Н. Красноштанова А.А. Способы выделения иммуноглобулинов из желтка яиц сельскохозяйственной птицы. сб. «Успехи в химии и химической технологии», РХТУ им. Д. И. Менделеева Москва, 2019, том 33, с. 49-50.
5. Кусакина М.Г., Суворов В.И., Чудинова Л.А. Большой практикум «Биохимия». Лабораторные работы: учеб. Пособие - Перм. гос. нац. исслед. ун-т.-Пермь, 2012, с. 5-11.
6. Wei Nie, Chao Zhao, Xiaoxiao Guo, Liwei Sun, Tingyu Meng, Yushen Liu, Xiuling Song, Kun Xu, Juan Wang, Juan Li, "Preparation and identification of chicken egg yolk immunoglobulins against human enterovirus 71 for diagnosis of hand-foot-and-mouth disease", Analytical Biochemistry, 573 (2019) 44-50.
