CC BY
108
УДК 615.074
Юдина А.Н. Красноштанова А.А.
СПОСОБЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ИЗ ЖЕЛТКА ЯИЦ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПТИЦЫ
Юдина Алеся Николаевна, студентка 3 курса факультета биотехнологии и промышленной экологии; Красноштанова Алла Альбертовна, доктор химических, доцент, профессор кафедры биотехнологии, e-mail: aak28@vandex.ru ;
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20
Установлено оптимальное соотношение желтка и воды, обеспечивающее максимальное содержание белка в суспензии. Подобран наиболее эффективный метод выделения иммуноглобулинов из желтка. Ключевые слова: IgY, желточные антитела.
METHODS OF EXTRACTION OF ANTIBODIES FROM POULTRY YOLK
Yudina A.N., Krasnoshtanova A. A.
D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia
It was adopted the optimal ratio of yolk and water providing the maximum protein content in the suspension. The most effective method of extraction of antibodies from the yolk was determined. Keywords: IgY, yolk antibodies.
Введение
В связи с развитием пассивной иммунизации в последнее время все большую тенденцию набирает внедрение птичьих желточных антител в диагностике и профилактике против болезнетворных микроорганизмов, особенно, при лечении кишечных заболеваний. [1] Это в первую очередь связано с нарастающей устойчивостью микроорганизмов к антибиотикам.
Яичный желток является богатым источником иммуноглобулинов, общее содержание которых превышает 100 мг на одно куриное яйцо. [2] Большинство иммуноглобулинов желтка относится к классу 1§У; другие классы, такие как 1§Л и 1§М, также присутствуют в составе желтка, но в меньших количествах.
IgY птиц состоит из пяти доменов и не обладает генетически кодируемым шарниром. Вместо него имеются зоны «включения» с ограниченной пластичностью в доменных интерфейсах, что может быть полезно для некоторых важных биохимических свойств. Например, неспособность преципитировать антигены в физиологических растворах солей, что наблюдается у кур и уток. [3]
Для выделения 1§У необходимо провести специфическую обработку, гарантирующую изоляцию иммуноглобулинов от липидной части желтка. Это достигается путем двухстадийной очистки: в первой -производится отделение водорастворимой фракции, содержащей 1§У, от липидов и липопротеидов при рН 4-5, а во второй - выделение 1§У из водорастворимой протеиновой фракции, используя дополнительные реагенты. [4]. Липиды также могут быть удалены из белковой фракции центрифугированием, фильтрацией, преципитацией (например, декстраном, хлоридом кальция, органическими растворителями) или путем замораживания-оттаивания разбавленного желтка. Поскольку желток яйца содержит и другие ценные белки, а его липиды также самостоятельное практическое значение, то представляется целесообразным подобрать режимы выделения
иммуноглобулинов из яичного желтка при их комплексной переработке. Таким образом, целью данной работы является выделение иммуноглобулинов из желтка куриного яйца.
Материалы и методы
В качестве объекта исследования в работе был использован желток яйца сельскохозяйственной птицы производства птицефабрики ОАО «Снежка» с влажностью - 74%, содержанием жира в желтке -32,6г/100г, сырого протеина в белке - 10,6%, в желтке -16,6%, фосфолипидов в желтке - 29,6%. Желток предварительно обезжирили, смешав с этиловым спиртом в заданном соотношении. После чего наблюдалось осаждение в течение 30 мин. Осадок отделили центрифугированием и высушили при комнатной температуре. Содержание сырого протеина определяли микрометодом Къельдаля, белка в растворах - колориметрическим методом Лоури [5].
Экспериментальная часть
Согласно литературным данным вне зависимости от последующих стадий выделения
иммуноглобулинов, на первом этапе проводят суспендирование желтка в воде. Поэтому первоначально необходимо было выбрать наиболее оптимальный гидромодуль желток:вода,
обеспечивающий максимальную концентрацию белка в получаемом супернатанте. Для этого 1г высушенной обезжиренной этанолом желточной массы суспендировали в 5 мл, 10мл, 25мл и 50мл подкисленной дистиллированной воды (pH 5,0, устанавливали 0.2н HCl). После чего пробы выдержали при температуре -200С в течение 18 часов. Далее их подвергли медленному оттаиванию при комнатной температуре. Затем произвели фильтрование через бумажный фильтр. Концентрацию белка в супернатанте определяли методом Лоури. Полученные результаты приведены в табл. 1.
Из полученных данных следует, что наилучшие желток:вода равно 1:10, поэтому его использовали при проведении дальнейших исследований.
Табл.1 Определение оптимального гидромодуля желток: водадист._
№ Соотношение Концентрация белка в
желток: вода, г: мл супернатанте, г/л
1 1 : 50 0,76
2 1: 25 0,81
3 1:10 2,57
4 1:5 Не произошло разделения суспензии
Для выделения белка из супернатанта добавили твердый хлорид натрия до достижения 18,0%-ной концентрации и подкислили полученный раствор до pH 4,0 с помощью 0,2н раствора HCl. Для индуцирования преципитации IgY оставили приготовленный раствор на 18 часов при температуре -200С, после чего осадок отделили центрифугированием при 10000 об/мин, температуре 40C в течение 30 мин. Полученный осадок определили на содержание белкового азота с помощью метода Къельдаля, а концентрацию супернатанта - с помощью метода Лоури. Было установлено, что содержание сырого протеина в осадке составило 54,25%, а остаточное содержание белка в надосадке -1,0 г/л.
На основании полученных результатов был сделан вывод о чистоте полученного белка, а также о неполном осаждении протеина из раствора. В составе осадка присутствуют примесные липидные компоненты, поэтому в последующих этапах работы целесообразно проводить дополнительную очистку белковой фракции.
Поскольку степень осаждения белка оказалось невысокой было опробовано его предварительное концентрирование на мембране УАМ-10. Было установлено, что селективность по белку не превышает 50%, т.е. белок в получаемом супернатанте частично разрушен.
Для того чтобы минимизировать деструкцию иммуноглобулинов для очистки от липидов была апробирована согласно литературным смесь 0,2%-ного раствора хлорида кальция и 10% раствора декстрана. Для этого к полученному в результате суспендирования в воде обезжиренного желтка супернатанту добавили вышеуказанные реагенты в объемном соотношении 50:1. После чего оставили при температуре 40С на 18 часов. Полученный помутневший раствор центрифугировали в течение 10 мин с скоростью 10 000 об/мин. В последующих этапах работы использовался осадок. К полученному осадку добавили раствор сульфата аммония (38 г на 100 мл дистиллированной воды - 50% насыщения) и тщательно перемешали и выдержали на холоду 17-18 часов. Осадок отделили центрифугированием при 4500 об/мин., температуре 100C в течение 30мин. Для удаления избытка сульфата аммония осадок пятикратно промыли
дистиллированной водой. Промывные воды отделяли центрифугированием при температуре 100С, 4500 об/мин в течение 15 мин. В надосадочной жидкости качественно по наличию помутнения оценивали наличие сульфата с помощью 20% раствора хлорида бария. После 5-ой промывки надосадок после добавления хлорида бария не помутнел, поэтому данную кратность промывки можно считать достаточной. Промытый осадок высушили на воздухе и
проверили на содержание сырого протеина с помощью метода Къельдаля. Содержание сырого протеина составило 48,65%. Как видно из полученных данных, в осадке присутствует неочищенный белок.
Было сделано предположение, что обезжиривание желтка проводилось в жестких условиях, приводящих к деструкции иммуноглобулинов. Поэтому на следующем этапе работы был взят нативный желток, разведенный в 10 раз в дистиллированной воде, который для лучшей гомогенизации смеси перемешали на магнитной мешалке и затем выдержали при температуре 40C в течение 2 часов для эффективного разделения фракций. Далее в экспериментальной части мы использовали супернатант, полученный после декантирования. В полученный супернатант добавили 1,0 мл 1М раствора кальция хлорида (CaCl2) и 0,2 мл 10% раствора декстрана и выдержали в течение 36 часов при температуре 40С. Выпавший осадок липидов отделили центрифугированием в течение 10 мин при 10000 об/мин., к супернатанту добавили раствор сульфата аммония (38 г на 100 мл дистиллированной воды - 50% насыщения), выдержали 20 часов при температуре 40C, осадок белка отделили центрифугированием со скоростью 4500 об/мин в течение 30 мин. Проводили удаление избытка солей сульфата аммония тем же способом, что описан в предыдущей методике. Затем осадок исследовали на содержание сырого протеина, применяя метод Къельдаля. Было определено, что содержание сырого протеина составляет 37,82%. Из полученных данных следует, что нативный желток содержит большее количество липидов, чем обезжиренный. Необходим поиск более эффективного способа удаления липидной составляющей желтка, что является следующим этапом нашей работы. Выводы
1. Подобран оптимальный гидромодуль желток:вода для достижения высокой концентрации белка. Его соотношение 1:10.
2. Установлено, что максимальное содержание сырого протеина получается из предварительно обезжиренной этанолом желточной массы. Его значение составляет 48,65-54,25%.
Список литературы
1. Mine Y., Kovacs-Nolan J. // J. Med. Food. - 2002. -Vol.5, N3. - P.159-169.
2. Каплин В.С.-, Каплина О.Н. IgY -технологии. Желточные антитела птиц - Биотехнология, 2017, T. 33, № 2, С. 29-40
3. Warr, G.W., Magor, K.E. and Higgins, D.A. (1995). IgY: clues to the origins of modern antibodies.Immunol. Today 16, 392-398.
4. Petr Hodek, Pavel Trefil, Jiri Simunek, Jiri Hudecek Marie Stiborova Optimized Protocol of Chicken Antibody (IgY) Purification Providing Electrophoretically Homogenous PreparationsInt. J. Electrochem. Sci., 8 (2013) 113 - 124.
5. Кусакина М.Г., Суворов В.И., Чудинова Л.А. Большой практикум «Биохимия». Лабораторные работы: учеб. Пособие - Перм. гос. нац. исслед. ун-т.-Пермь, 2012, с. 5-11
6. Фримель Г./Г. Фримель. -М.:Медицина, 1987 -472 с.
