CC BY
162
дискуссии ид
Использование желточных антител птиц в иммунотерапии
Каплин В.С., Каплина О.Н.
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Российская Федерация
Kaplin V.S., Kaplina O.N.
State Research Center of Virology and Biotechnology Vector, Russian Federation
Use of yolk birds antibodies in immunotherapy
Резюме. В последние годы использование птичьих желточных антител в терапии и диагностике стало заметно увеличиваться. Это связано с теми преимуществами, которые демонстрируют птичьи антитела в сравнении с антителами млекопитающих. Данный обзор посвящен описанию результатов экспериментальных и клинических испытаний препаратов, полученных на основе птичьих желточных антител, а также их использованию в ветеринарии.
Ключевые слова: IgY-антитела, IgY-технологии, желточные антитела, пассивная иммунизация.
Медицинские новости. — 2017. — №3. — С. 32—37. Summary. In recent years, the use of avian yolk antibodies in therapy and diagnosis was significantly increased. This is due to the advantages that avian antibodies exhibit compared wtth mammalian antibodies. This review is dedicated to the description of the results of pre-clinical and clinical trials of drugs derived from avian yolk antibodies, as well as their use in veterinary medicine. Keywords: IgY-antibodies, IgY-technology, yolk antibodies, passive immunization. Meditsinskie novosti. - 2017. - N3. - P. 32-37.
Рождение инфекционной иммунологии связывают с именем выдающегося французского ученого Л. Пастера. Он впервые разработал принципы создания вакцинных препаратов. Но Л. Пастер не изучал факторы, включенные в процесс защиты животных от инфекций. Первыми, кто пролил свет на один из механизмов невосприимчивости к инфекции, были Э. Беринг и С. Китазато. Они установили, что фактор защиты находится в сыворотке крови [6]. Это дало начало новому на тот момент направлению в терапии - сывороточная терапия, или пассивная иммунизация. Специфические антитела животных использовались для профилактики и лечения многих инфекционных заболеваний. Хотя их применение при лечении бактериальных инфекций с середины ХХ века было в значительной степени вытеснено антибиотиками, антитела остаются важным компонентом лечения дифтерии, столбняка, ботулизма и укусов ядовитых животных [2]. Ф. Клемперер в 1893 году взял на вооружение идею Э. Беринга и иммунизировал кур столбнячным токсином [19]. Через месяц он проверил содержимое яиц иммунизированных кур на наличие антитоксина. Выяснилось, что только в желтке обнаруживается антитоксин - специфические антитела, которые защитили подопытных мышей от летального исхода. Тем не менее долгое время открытие Ф. Клемперера оставалось мало известным. Но когда благополучие лабораторных животных стала серьезной этической проблемой для научного сообщества, работа Ф. Клемперера о неинвазивном
извлечении желточных антител приобрела значимость и признание [31]. Детальное изучение птичьих антител открыло новые возможности их использования.
Что такое ^
Наиболее изученным классом иммуноглобулинов у млекопитающих является иммуноглобулин класса G - Его молекулярная структура и функции хорошо изучены. В середине ХХ века птичьи иммуноглобулины обозначались также - Но в настоящее время известно, что птичьи иммуноглобулины отличаются от ^ мле-
копитающих по структуре и функциям. Поэтому было принято решение называть их IgY от слова «yolk» - желток. Сывороточные иммуноглобулины птиц полностью идентичны желточным. Концентрация IgY в желтке сравнима с концентрацией IgY в сыворотке и составляет 6-13 мг/мл. Большое количество IgY которое можно получить неинвазивным способом, делает кур идеальным поставщиком специфических антител. Из-за значительной филогенетической дистанции, отделяющей птиц от млекопитающих, иммунологические свойства IgY сильно отличаются от IgG. Так, IgY не взаимодействуют с компонентами комплемента млекопитающих, ревматоидным фактором млекопитающих, Fc-рецепторами млекопитающих, следовательно, IgY-антитела не взаимодействуют с эффекторами иммунной
системы млекопитающих и не вызывают системных осложнений при лечении [36]. Благодаря высокой иммунореактив-ности птиц по отношению к чужеродным белкам инфекционного происхождения (бактериальным, вирусным, паразитарным), а также к растительным токсинам и искусственным, генно-инженерным антигенам, аффинность ^-антитела выше аффинности антител млекопитающих [37]. Возможность получения большого количества дешевых куриных антител дало новый импульс в развитии пассивной
иммунизации, особенно при лечении и профилактике кишечных заболеваний [24]. Это тем более важно сейчас, когда устойчивость микроорганизмов к антибиотикам постоянно повышается.
Особенностью IgY является устойчивость к трипсину и химотрипсину. В экспериментах in vitro было показано, что после 8 часов переваривания протеазами около 40% молекул IgY не потеряли функциональную активность. IgY подвержен деградации пепсином в кислой среде, но добавление протекторов (молоко и яичный белок) помогает защитить IgY от кислотной деградации. Антитела могут быть введены перорально в различных формах, включая яичный порошок, полученный в распылительной сушилке, водорастворимая фракция желтков или очищенные IgY Активность IgY-антител снижается
Большое количество ^ которое можно получить неинвазивным способом, делает кур идеальным поставщиком специфических антител
незначительно (менее 1%) даже в распылительной сушилке с соответствующими протекторами [7, 15, 35].
Преимущества IgY по сравнению с IgG
Использование IgY для пассивной иммунизации имеет отличительные преимущества по сравнению с IgG млекопитающих:
- возможность получения большого количества антител. От одной курицы за месяц можно получить в 15-17 раз больше иммуноглобулинов, чем от одного кролика [34];
- IgY-антитела обладают в 5 раз большим сродством к конкретному антигену и реагируют быстрее, чем IgG млекопитающих [36];
- выделение IgY происходит через бескровный физиологический процесс (кладка яиц), тогда как для извлечения IgG необходимо кровопускание, а животное испытывает боль [31];
- IgY не взаимодействуют ни с компонентами комплемента, ни с ревматоидным фактором, ни с Fc-рецепторами клеток млекопитающих [34].
Кроме того, расходы на содержание птиц значительно ниже, чем расходы на содержание крупных млекопитающих (лошадей, ослов, мулов, коров), часто используемых для пассивной иммунизации [1, 2]. Несистемное (местное) введение антител, специфичных для возбудителей, является привлекательным подходом для установления защитного иммунитета, особенно в отношении желудочно-кишечного тракта. Яйца являются нормальным компонентом питания, нет практически никакого риска от перорального применения IgY [26]. Использование IgY для пассивной иммунизации в кишечнике может быть определяющим фактором профилактики некоторых кишечных заболеваний, вызванных Salmonella, E. coli или ротавирусами. Эти антитела обеспечивают почти мгновенную защиту после перорального приема, тогда как активная иммунизация или вакцинация полагается на иммунную систему хозяина, чтобы генерировать иммунный ответ, который, как правило, развивается через несколько дней или недель. Пероральное введение IgY-антител предоставляет антимикробный зонтик, подавляя пролиферацию патогенов и предотвращая повреждения слизистой оболочки, при этом птичьи иммуноглобулины не являются источником воспалительных реакций в желудочно-кишечном тракте [36]. Агглютинирующие или токсин-нейтрализующие эффекты IgY делают микроорганизмы неспособными к колонизации поверхности слизистой оболочки или выполнению токсигенных
или других функций, необходимых для проявления их вирулентности [24].
Пионерские работы, проведенные в Японии, наряду с независимыми исследованиями в Европе и США, посвященные эффективности пероральных 1дХ говорят о хорошем защитном эффекте птичьих
антител как для лечения, так и для профилактики инфекционных заболеваний [36].
Оценка эффективности IgY-антител в экспериментальных исследованиях
В научной литературе появляется все больше публикаций об использовании куриных, перепелиных, утиных и страусиных IgY-антител в диагностике, медицине и ветеринарии как in vitro, так и in vivo. Так, H.H. Sunwoo и J.S. Sim [40] сообщили об использовании IgY-антител против пищевых белков клейковины, которые играют важную роль в аутоиммунных расстройствах при целиакии, заболевании тонкого кишечника, от которого страдает 1 % населения земного шара. Эксперименты на мышах показали, что специфические IgY-антитела способны необратимо связывать глиадин (белок клейковины) в желудочно-кишечном тракте подопытных животных. Следовательно, использование желточных антител может быть полезным при кишечных расстройствах, вызванных непереносимостью пациентов к белкам клейковины злаковых.
Вирусы гриппа остаются серьезной угрозой для глобального здравоохранения в связи с их способностью к изменениям генома путем антигенного дрейфа и антигенного сдвига. Именно поэтому существует постоянная необходимость создания новых вакцин против гриппа. Но вакцины имеют ряд ограничений и не могут использоваться тотально. При перораль-ной пассивной иммунизации IgY-антитела не попадают в кровяное русло и, следовательно, не могут вызывать системных осложнений [25]. M.G. Wallach и соавт. проводили иммунизацию кур против трех эпитопов вируса гриппа (H1N1, H3N2 и H5N1) и по отдельности. Яйца собирали в течение 2 месяцев после двух прививок. Антитела подавляли гемагглютинацию и нейтрализовали вирус. Антитела к вирусу H5N1, когда их вводили интраназально за 1 час до инфекции, защищали 100% мышей от смертельного исхода. Особый интерес был вызван перекрестной реакцией. IgY-антитела, наработанные к вирусу H5N1, защищали мышей от экспериментального заражения вирусом H1N1. Обнаруженные в яйцах антитела,
по мнению авторов, могут стать эффективной и безопасной альтернативой предупреждения распространения вспышек гриппа [41]. Имеются данные об успешной иммунизации страусов вирусом птичьего гриппа Н5М. В результате этой иммунизации было получено огромное количество специфических
антител (около 200 грамм от одной самки в год), которые предотвратили гибель куриных эмбрионов после вирусного заражения. Положительные результаты были получены в реакции вирус нейтрализации [4]. Таким образом, эксперименты на животных говорят о возможности использования птичьих антител для пероральной или назальной пассивной иммунизации человека.
Хотя СПИД был официально признан вирусным заболеванием в 1981 году, до сих пор не удается разработать эффективную вакцину против этой болезни. Поэтому параллельно с разработками вакцин велись исследования по лечению больных ВИЧ. Иммунотерапии с использованием моноклональных антител первого поколения оказалась неэффективны. Но недавно был разработан метод получения высоконейтрализующих гуманизированных мышиных моноклональных антител. Клинические испытания антител 3BNC117 проводились на 29 добровольцах. У пациентов снизилась вирусная нагрузка от 0,8 до 2,5 lg (или от 7 до 320 раз) и значительно снизилась виремия. По мнению авторов, чтобы придать новому методу эффективность, необходимо как минимум создать второе антитело и применять его в сочетании с первым. Для лечения уже заразившихся пациентов такие антитела могли бы дополнить поддерживающую терапию [9]. Сомнения у врачей вызывает высокая стоимость антител. Каждый курс лечения обойдется пациенту в несколько тысяч долларов, в то время как стоимость одной терапевтической дозы куриных IgY составляет $ 0,025 [36].
Тем не менее пассивная иммунизация желточными антителами может снизить вирусную нагрузку больных и повысить качество их жизни. A.A. Justiz Vaillant соавт. иммунизировали кур фрагментами gp120 и gp41 ВИЧ. Анализ образования антител проводился с помощью ELISA. В желтках иммунизированных кур были найдены специфические антитела, реагирующие с gp120 и gp41 белками ВИЧ. Было показано, что эти IgY-антитела потенциально могут быть использованы в качестве терапев-
Эксперименты на животных говорят о возможности использования птичьих антител для пероральной или назальной пассивной иммунизации человека
тических агентов при лечении больных ВИЧ [18]. Лечебный эффект желточных антител был показан в другом эксперименте, проводимом на кошках. После иммунизации кур ВИЧ-gp^O пептидом, конъюгированным с гемоцианином, проводили иммунизации на 0-й, 15-й, 60-й и 90-й день. Через две недели после последней иммунизации собирали иммунные яйца. Каждая кошка получала по 2 яйца, разбавленных молоком в 5 раз, каждую неделю в течение 10 недель. Наиболее важным выводом является то, что в сыворотке кошек появились анти-идиотипические к ВИЧ антитела. Авторы утверждают, что пероральные вакцины в целом имеют способность индуцировать иммунитет, который включает сильные гуморальные и клеточные реакции. Поэтому пероральные вакцины могут быть лучшими кандидатами на ВИЧ терапевтические вакцины. Результаты этого исследования свидетельствуют о том, что яйца от иммунизированных кур (IgY-антитела) при длительном употреблении снижают вирусную нагрузку [17].
Было подсчитано, что 1,7 млн человек ежегодно подвергаются укусам ядовитых змей, скорпионов, медуз или пауков. В результате чего фиксируется 40 000-50 000 случаев со смертельным исходом. Как противоядие используются лошадиные антисыворотки против токсинов. Производство рентабельного IgG в чистом виде является сложной задачей. Эксперименты на животных показали, что куриные IgY-антитела лучше лошадиных IgG и по стоимости, и по эффективности. Желточные поликлональные IgY-антитела обладают в 5 раз большим сродством к конкретному антигену и реагируют быстрее [36]. Стабильность их выше, чем поликлональных IgG млекопитающих. IgY не связываются с человеческим комплементом, ревматоидным фактором, Fc-рецепторами иммуно-компетентных клеток и, следовательно, не
вызывают сывороточную болезнь, что очень важно при внутримышечном и внутривенном введении антител [35]. Эксперименты, проведенные на кроликах, показали эффективность защиты животных от введения яда гадюки [20]. В некоторых южных странах скорпионы представляют опасность для местного населения. Единственным способом снятия интоксикации, вызванной укусом скорпиона, является иммунотерапия с использованием лошадиных антител. Эксперименты П уНго показали эффективность
использования куриных желточных антител для инактивации токсина скорпиона [5].
Болезнь Крона и язвенный колит являются хроническими воспалительными заболеваниями кишечника, рост которых в настоящее время волнует медицинскую общественность. Стандартный медицинский подход при лечении этих болезней включает противовоспалительные препараты, иммунодепрессанты и антибиотики. Иммунотерапия с использованием моноклональных мышиных антител, направленных против фактора некроза опухоли (ФНО), была одобрена для проведения противовоспалительной терапии. Но эта терапия дорогостоящая, и были зарегистрированы неблагоприятные побочные эффекты у пациентов, получавших системную анти-ФНО терапию. K.L. Worledge и соавт. [43] сообщили, что анти-ФНО антитела, полученные от кур, были способны эффективно лечить острую и хроническую фазу колита у крыс. Эти данные указывают на возможность использования анти-ФНО IgY-антител для лечения воспалительного заболевания кишечника у человека в будущем.
Предварительное исследование по лечению кариеса проводилось на крысах. Опытные животные получали специфические антитела против Streptococcus mutans либо в виде раствора, либо в виде лиофилизированного порошка. Контрольные группы получали воду или порошок IgY от неиммунизированных кур. Всем животным давали добавки, вызывающие кариес. Оценка поражения зубов подсчи-тывалась в баллах по методике P.H. Keyes. В результате в группах, получавших специфические IgY в виде порошка и полоскания, средний балл кариеса снизился по сравнению с таковым в контрольных группах [13].
Угри (акне) являются распространенным кожным заболеванием. Статистика
показывает, что 85% всех людей в возрасте от 12 до 25 лет имеют разные степени угревой сыпи. Основным возбудителем акне является Propionibacterium acnes. Для терапии угревой сыпи куры-несушки были привиты P. acnes с последующей ревакцинацией. Антитела очищали методом осаждения по-лиэтиленгликолем и сульфатом аммония. Иммуноферментный анализ показал высокий титр 1:10 000 антител. Было обнаружено, что анти-акне IgY имеют сильную специфическую активность и их можно использовать
в качестве профилактического средства для лечения угрей [13].
Кандидоз. Candida albicans является оппортунистическим грибковым патогеном, который вызывает оральные и вагинальные инфекции слизистой оболочки, а также системные заболевания. Способность C. albicans удерживаться на слизистых оболочках коррелирует с его патогенностью. Исследовалась способность IgY-антител предотвращать адгезию клеток C. albicans слизистой оболочки. Куриные антитела значительно сократили связывание C. albicans с поверхностью. Данные показывают, что анти-C. albicans IgY перекрестно реагируют с различными серотипами Candida и могут иметь защитный эффект против кандидоза полости рта и уменьшать распространение инфекции. Таким образом, анти-C. albicans IgY могут рассматриваться в качестве профилактической иммунотерапии или, возможно, дополнительной противогрибковой терапии в ограниченных условиях [14].
После прекращения глобальной иммунизации населения вакциной против оспы угроза зоонозных инфекций вирусом увеличилась. По этой причине разработка новых вакцин продолжается. Была сделана попытка проверить возможность применения пассивной иммунизации в отношении оспы. Иммунизация кур проводилась шестикратно ортопокс вирусом (осповакциной). Иммунотерапевтическая эффективность желточных IgY-антител проверялась на мышиной модели. Результаты этого исследования продемонстрировали возможность применения пассивной иммунизации в профилактике оспы [22]. В другом эксперименте кур иммунизировали осповакциной дважды. Титр антител определялся методом им-муно-ферментного анализа (ИФА) и в реакции вируснейтрализации. После второй иммунизации титр желточных антител по результатам ИФА достигал более 1/10 000, а титр вируснейтрализации -1/25. Таким образом, было показано, что желточные антитела могут нейтрализовать вирус осповакцины. Необходимы дальнейшие исследования на лабораторных животных [3].
Токсин рицин и ботулинический ней-ротоксин могут быть использованы в качестве биологического оружия. В эксперименте проверялась возможность получения большого количества нейтрализующих желточных антител. Кур иммунизировали токсинами. Кладка яиц продолжалась 2 года, число яиц от каждой курицы было 600 штук, а количество иммуноглобулинов - от 20 до 40 г. Терапевтическая доза IgY как показали
Анти- С. albicans IgY могут рассматриваться в качестве профилактической иммунотерапии или, возможно, дополнительной противогрибковой терапии в ограниченных условиях
исследования, в среднем составляет 25 мг IgY Следовательно, от одной курицы за два года можно получить 800-1600 доз антител. IgY-антитела показали нейтрализующий эффект, когда использовались для блокировки функциональной активности токсинов как в пробирке, так и в экспериментах на животных [27].
Куриные желточные антитела против холерного вибриона показали высокий титр в ELISA и в реакции агглютинации. Таким образом, анти-холерные IgY-антитела могут быть использованы в качестве профилактического средства против холерной инфекции [23]. Эти результаты говорят о том, что желточные антитела могут быть использованы при разработке мер борьбы с последствиями биотеррористических атак, возможность которых в настоящее время увеличивается.
Оценка эффективности IgY-антител в испытаниях на добровольцах
Helicobacter pylori - спиральный грам-отрицательный микроаэрофильный патоген, обычный обитатель желудка и слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки. Микроорганизм считается одним из наиболее распространенных патогенов в человеческой популяции. По некоторым данным, он заражает более 50% населения во всем мире и признается этиологическим агентом гастрита, язвенной болезни, а также связан с развитием аденокарци-номы желудка и лимфомы. Искоренение хеликобактерной инфекции неизменно терпит неудачу, когда с помощью антибиотиков пытаются излечить пациентов. Поэтому необходимы альтернативные методы лечения, основанные на контролируемом снижении активности H. pylori.
Использование пробиотиков для подавления H. pylori в организме человека изучалось несколькими исследователями. Отмечались лишь несущественные тенденции к подавлению H. pylori питьевым йогуртом, содержащем молочнокислые бактерии в желудке человека [10, 32]. Только когда лечебные йогурты были обогащены добавками, представляющими собой специфические к H. pylori куриные желточные антитела, был продемонстрирован терапевтический эффект подавления инфекции. Причем очень важным моментом в получении куриных антител является выбор антигена. Особенностью данного микроорганизма является возможность ускользания от воздействия кислотного содержимого желудка. Для колонизации слизистой оболочки H. pylori обильно производит уреазу - фермент, переводящий мочевину, которая находится в желудочном соке или попадает диффузно через эпителий, в аммиак, нейтрализующий
микросреду в слизистой оболочке желудка. Именно использование IgY-антител против уреазы дает значительно лучшие результаты при подавлении бактериальной инфекции. Было показано, что IgY-анти-уреазные антитела имели высокую специфичность и значительную эффективность против H. pylori из-за их способности ингибировать активность бактерии. Захват бактерий,
ассоциированных с уреазой в желудочном слое слизистой оболочки, приводит к агглютинации и агрегации бактерий, которые формируют иммунный осадок, покидающий желудок, а затем и кишечник [10, 16].
В Японии был разработан функциональный продукт - питьевой йогурт с антителами против H. pylori. IgY-антитела после пастеризации были добавлены к охлажденному до 4°С йогурту и хранились до 3 недель без потери активности. Состав йогурта был рассчитан таким образом, чтобы на один прием приходилось 2 г желтков иммунизированных кур, или 20 мг IgY Для оценки наличия H. pylori в желудке был использован изотопный метод определения 13С в выдыхаемом воздухе. В эксперименте участвовали 174 добровольца. Каждый доброволец потреблял 1 чашку йогурта дважды в день в течение 12 недель. Дыхательные тесты проводились на 4-й, 8-й и 12-й неделе. Результаты тестов показали значительные изменения, начиная с 8-й недели. Уровень СО2 снизился на 55,1% на 8-й неделе и на 57,2% - на 12-й [44]. Хотя полная ликвидация патогенного заселения в желудке, по-видимому, не возможна, снижение бактериальной нагрузки привело к улучшению качества жизни инфицированных пациентов. Эта терапия может служить в качестве дополнения к стандартному лечению.
Другие клинические исследования с использованием куриных антител против уреазы H. pylori, проведенные на Тайване [11] и в Корее [16], показали аналогичные результаты.
Эти три независимые работы являются доказательством эффективности йогуртов со специфическими куриными антителами, снижающими количество хеликобактерной инфекции в организме человека. Прием внутрь этих продуктов хорошо переносился и не вызывал никаких побочных эффектов или осложнений.
Муковисцидоз
Одним из самых успешных клинических применений IgY было подавле-
ние инфекции синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa), колонизирующей дыхательные пути пациентов с му-ковисцидозом (кистозным фиброзом). Это наследственное заболевание с клиническими проявлениями в основном в дыхательных путях и желудочно-кишечном тракте. У многих больных течение патологического процесса в легких
осложняется наслоением бактериальной инфекции, часто синегнойной палочки. Хронические инфекции, вызванные этой бактерией, могут привести к дыхательной недостаточности и преждевременной смерти. Лечение инфекций антибиотиками увеличило среднюю продолжительность жизни пациентов с муковисцидозом до 40 лет, но при этом могут возникнуть побочные эффекты, такие как кишечные проблемы и аллергия. Использование перорального введения IgY-антител против синегнойной палочки защищает полости рта, горла и нижних дыхательных путей от инфекции. Причем куриные антитела были наработаны на жгутики патогена [25]. В группе пациентов из Швеции была применена методика пассивной иммунизации с использованием полоскания рта специфическими антителами. В группе лиц, получавших IgY в течение 12 лет, удалось снизить прием антибиотиков и было выявлено только 2 положительные культуры в мокроте больных, в то время как в контрольной группе - 13 положительных культур в мокроте, при этом 24% пациентов в контрольной группе стали «хрониками» по синегнойной инфекции. Этот самый длительный эксперимент по приему IgY показывает безвредность и эффективность данной терапии [26].
Изучение IgY-антител, специфичных к P. aeruginosa в слюне, показало, что они сохраняются до 8 часов, а у некоторых пациентов до 24 часов. Наличие антител было измерено с помощью ИФА. Активные антитела в полости рта защищают пациентов от инфекции [8].
Кариес
Для выявления защитного эффекта детской зубной пасты, содержащей в своем составе куриные IgY-антитела против Streptococcus mutans, проводилось двойное слепое исследование на 260 детях от 3 до 4 лет. После 3-месячного периода адаптации добровольцы были распределены случайным образом на две группы - тестовую
Одним из самых успешных клинических применений IgY было подавление инфекции синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa), колонизирующей дыхательные пути пациентов с муковисцидозом (кистозным фиброзом)
и контрольную. Через 6, 12 и 18 месяцев измерялись специфические индексы, характеризующие распространенность и степень тяжести кариеса. В начале исследований (до 6 месяцев) оба индекса не дали существенных изменений. Но после 12 и l8 месяцев изменения были существенными. Применение антикариесной зубной пасты снижает оба индекса, что свидетельствовало об эффективной защите молочных зубов у детей от кариеса [42]. В настоящее время несколько китайских компаний выпускают зубные детские пасты, содержащие IgY-антитела против S. mutons.
Периодонтит
Porphyromonas gingivalis - микроорганизм, вызывающий периодонтит и паро-донтит. Активная иммунизация позволяет уничтожить чужеродные антигены путем выработки специфических собственных антител. Тем не менее системный анализ доклинических исследований показал, что из-за недостаточности количества и качества исследований на животных нет убедительных доказательств каких-либо полезных эффектов активной иммунизации против пародонта патогенами [12]. Защитный иммунитет может быть получен с помощью пассивной иммунизации, которая достигается путем передачи специфических антител против антигенов-мишеней. Местное применение специфических антител к области десны - наиболее подходящий и простой метод лечения.
В клиническом исследовании с использованием желточных антител против P. gingivalis были взяты пять пациентов с хроническим периодонтитом, который имели высокие уровни в их поддесневом кармане. Для лечения мазь вводили непосредственно в десневой карман. Перед введением IgY-антител проводили очистку от налета на всех поверхностях зубов испытуемых. Уровень бактерий на поверхности зубов и в карманах измеряли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Удаление налета и очистка зубов в сочетании с использованием IgY-антител уменьшили глубину зондирования, кровотечение при зондировании и уровни P. gingivalis по всей полости рта [45].
Другое двойное слепое исследование проводили на 42 больных периодонтитом после масштабирования и корневого глиссирования вместе с пероральным введением IgY-антител в виде таблеток. Количество клеток P. gingivalis измеряли с помощью ПЦР. Значительное уменьшение глубины зондирования отмечается в экспериментальной группе через 12 недель после терапии. Параллельно с клиническими изменениями количество
клеток P. gingivalis в поддесневой бляшке из самого глубокого кармана было значительно сокращено путем введения IgY-антител. Эти результаты показывают, что ежедневное введение специфических антител в сочетании с масштабированием и корневым глиссированием у пациентов с пародонтитом дает значительное улучшение клинических и микробиологических результатов по сравнению с плацебо [38]. Таким образом, пассивная иммунизация с помощью IgY-антител может быть эффективным методом при лечения пародонтита.
Компания Ironwood Clay Company Inc. провела два независимых исследования эффективности применения IgY-антител против P. acnes при лечении угревой сыпи. Первое клиническое испытание проводили в Китае в отделе дерматологии больницы в Шанхае. IgY крем и IgY маска из глины были эффективны при лечении акне в 93,3% из 150 добровольцев в течение 3-недельного эксперимента. Второе клиническое исследование проводили в Департаменте дерматологии медицинского колледжа университета в Сеуле (Корея). Результаты показывают, что субъективно отмечено улучшение эффекта на 65% и объективное улучшение на 30,2% при длительности эксперимента 14 дней у 20 пациентов с вульгарными угрями. Таким образом, клинические испытания подтверждают эффективность применения специфических IgY-антител при лечении кожных расстройств, вызванных P. acnes.
Ротавирусная диарея
Известно, что молозиво, полученное от гипериммунизированных ротавирусом коров, содержит антитела, эффективные при лечении ротавирусной диареи. Антитела, полученные из яиц иммунизированных кур, могут быть дешевой и более практичной альтернативой иммунного молозива, тем более секреция молозива длится не более 5 суток.
В рандомизированном двойном слепом исследовании 79 детям с установленной ротавирусной диареей назначали либо 10 г гипериммунного яичного желтка ежедневно в четырех равных дозах в течение 4 дней (опытная группа), либо аналогичный препарат, полученный из непривитых кур (группа плацебо). Ежедневно наблюдали частоту стула, количество и наличие ротавируса в кале в течение 4 дней. В опытной группе, получавшей IgY было отмечено значительное снижение объемов стула 87±59 против 120±75 в группе плацебо и значительное снижение потребления воды (в мл на килограмм веса в день) в опытной группе по сравнению с плацебо - 84±46
против 122±72. Эти результаты показывают положительную роль IgY при лечении рота-вирусной диареи у детей, но необходимы дальнейшие исследования для установления оптимальной нейтрализующей дозы для повышения эффективности иммуноглобулина IgY полученного от иммунизированных кур [33].
В исследованиях, проведенных в Мьянме (бывшая Бирма), среди госпитализированных пациентов была показана эффективность применения IgY-антител. Продолжительность ротавирусной инфекции сократилась, как минимум, до двух дней, причем существенно снизилась частота и продолжительность выделения вируса [28].
Очевидно, что немногие коммерческие вакцины соответствуют серотипу ротавируса некоторых эндемичных районов. Поэтому коммерческая ротавирусная вакцина из США защищала только 50% вакцинированных детей в некоторых азиатских странах (Бангладеш, Вьетнам). Стоит отметить, что IgY-препарат, используемый при изучении в Мьянме в 2011 году, был подготовлен с помощью специально подобранных, отсортированных серотипов и показал высокую реактивность против всех основных серотипов младенческой ротавирусной инфекции во всем мире. Это качество, по мнению авторов, не доступно любой коммерческой ротави-русной вакцине. Кроме того, стоимость коммерческих вакцин от ротавирусной инфекции слишком высока для беднейших масс населения в развивающихся странах. В этом случае ежедневно поставляемые дешевые IgY-антитела в восприимчивую популяцию могут быть экономически эффективным решением для подавления ротавирусной диареи. Для сравнения, суточная пероральная доза IgY в пик диареи среди младенцев и маленьких детей намного дешевле (несколько яиц птицы на период лечения), чем использование коммерческих вакцин [29]. Поэтому IgY, как антивирус, существенно усиливает защиту детей, у которых уровень иммунитета слишком низок, чтобы бороться с ротавирусом.
Кандидоз
Клиническое исследование было выполнено на двух здоровых пожилых добровольцах. Таблетки с добавлением IgY-антител против C. albicans из желтков иммунизированных кур были использованы для профилактического лечения. 4-недельный ежедневный прием таблеток чередовался с 4-недельным перерывом. Цикл лечения повторялся 3 раза. Контроль лечения осуществлялся путем определения колониеобразующих единиц (КОЕ) C. albicans в слюне добровольцев. Масса
I Дискуссии
одной таблетки в первом цикле исследований составила 500 мг/сутки, во втором цикле - 250 мг/сутки, в третьем - 100 мг/ сутки. В течение первого цикла пассивной иммунизации было отмечено снижение количества КОЕ возбудителя от 104-3 до начала лечения и снижение КОЕ до нуля. 4-недельный перерыв в лечении характеризовался увеличением КОЕ возбудителя в слюне пациентов, практически до исходного значения. Второй цикл лечения начался с показаний КОЕ 1034"25 и снижался до нуля. После 4-недельного перерыва уровень КОЕ возбудителя в слюне пациентов повысился до 103'5"3. На третьем цикле лечения уровень КОЕ не снижался ниже 1015. Следовательно, 100 мг/сутки было недостаточным, чтобы подавить патоген. Эти результаты говорят о том, что таблетки с добавлением IgY-антител против C. albicans дают хороший профилактический эффект в борьбе с этим патогеном [29].
Только IgY-антитела против синегной-ной палочки были зарегистрированы в качестве лекарственного средства [35], а йогурты, пастилки, таблетки, капсулы, молочные смеси и т.д., обогащенные IgY-антителами для профилактики против кариеса, гингивита, молочницы, детского ротавируса и язвенной болезни желудка, были зарегистрированы как нутрицевтики или пищевые добавки [36].
IgY-антитела в ветеринарии
Самое масштабное исследование по терапевтическому и профилактическому применению IgY проводилось на телятах и поросятах в полевых условиях. В качестве патогена использовался энтеротоксиген-ный штамм E. coli. Контрольные телята получали яичный порошок от неиммунизиро-ванных кур с добавлением молока. В этой группе была отмечена тяжелая диарея, обезвоживание и смертность составляла 100% через 72 часа после заражения. В отличие от этого у телят, которых кормили молоком, содержащим порошок яичного желтка от иммунизированных кур, была переходная диарея, 100% выживаемость и хорошее увеличение массы тела в течение всего исследования [24].
Эксперименты проводились на 3-дневных поросятах. Кур иммунизировали энтеротоксигенным штаммом E. coli К88. Для опытных животных в качестве добавки использовали желточный порошок от иммунизированных кур, а для контрольных - неиммунизированных. Результаты показали, что диарея была вылечена через 24 часа после скармливания иммунных желтков, в то время как контрольные животные продолжали испытывать серьезную диарею и 62% из них умерло [24].
Аналогичные исследования проводились на телятах при подавлении диареи, вызванной ротавирусами и коронавируса-ми, с теми же результатами [36].
Использование птичьих антител при лечении и профилактике заболеваний сельскохозяйственных животных в научной литературе отражено довольно много. Пассивная иммунизация описана для профилактики ротавирусной, коронавирусной инфекций, сальмонеллеза и заражений стрептококками [24]. Показаны варианты использования ^-технологий для аква-культуры - лечение рыб и креветок.
Только в Новой Зеландии препарат; содержащий ^-антитела против ротавируса, был зарегистрирован в качестве лекарственного средства для борьбы с диареей молодых телят [36]. В остальных странах ^-препараты поставляются как кормовые добавки.
Заключение
Желточные антитела, как уже говорилось, имеют множество преимуществ по сравнению с ^-антителами млекопитающих. Более того, ^-технологии находятся в согласии с международными требованиями, которые направлены на снижение или замену млекопитающих животных в научных экспериментах на птиц. Из-за увеличения устойчивости микроорганизмов к антибиотикам исследования по всем аспектам, связанным с разработкой специфичных ^-антител против патогенных микроорганизмов, постоянно усиливаются. Таким образом, учитывая все указанные преимущества ^-технологий, можно сделать один основной вывод - более широкое применение птичьих антител в научных исследованиях, диагностике и иммунотерапии - вопрос ближайшего времени.
И С П О Л Ь З О В А Н Н А Я Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Руководство по вакцинному и сывороточному делу. - М.,1978. - 440 с.
2. Руководство по профилактике в практическом здравоохранении // Под ред. И.С. Глазунова, Р.Г. Оганова и др. - М., 2000. - 217 с.
3. Каплин В.С., Банковская А.В., Каплина О.Н. и др. Куриные желточные антитела - перспективный препарат для иммунотерапии // Дни иммунологии в Сибири: материалы XII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием / Под ред. В.А. Козлова, С.В. Смирновой. - Новосибирск, Красноярск, 2015. - С.93-94
4. AdachiK, Handharyani E, Sari D.K., et al. // Mol. Med. Rep. - 2008. - Vol.1, N2. - P.203-209.
5. Alvarez A, Montero Y, Jimenez E., et al. // Toxicon. -2013. - Vol.74. - P.208-214.
6. Behiing E. // Dt. Med. Wochenschr. - 1890. -Vol.16. - P.1145-1148.
7. Brady D. Gaines, Fenelon S, Mcpartlin L, O'Farrelly J.C. // J. Food Sci. - 2002. - Vol.67. - P.3096-3103.
8. CarlanderD. // Avian IgY antibody: In vitro and in vivo. Uppsala University, Medicinska vetenskapsomredet, Faculty of Medicine, Department of Medical Sciences. -2002.
9. Caskey M, Klein F, Lorenzi J.C, et al. // Nature. -2015. - Vol.25, N522. - P.487-491.
10. Cats A,, Kuipers E.J., Bosschaert M.A.R., et al. // Alimentary Pharmacol. Therapeutics. - 2003. - Vol.17, N3. - P.429-435.
11. Chen J.P., Chang M.C. // Taiwanese J. Agricultural Chemistry Food Science (in Taiwanese). - 2003. -Vol.41. - P.408-414.
12. DhingraK, VandanaK.L. // J. Periodontol. - 2010. -Vol.81. - P.1529-1546.
13. Fan M, Jiang Q, Bian Z. // Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. - 2003. - Vol.21, N5. - P.339-341.
14. Fujibayashi T, Nakamura M, Tominaga A., et al. // Jpn J. Infect. Dis. - 2009. - Vol.62, N5. - P.337-342.
15. Gujial N, Löbenberg R, Suresh M, Sunwoo H. // J. Agric. Food Chem. - 2012 - Vol.60, N12. - P.3166-3172.
16. Horie K, Horie N, Abdou A.M., et al // J. Dairy Sci. - 2004. - Vol.87, N12. - P.4073-4079.
17. Justiz Vaillant A.A., Eberechi Akpaka P., McFarlane A.N., Smikle M, Brian W. // J. Vaccines Vaccin. - 2012. - Vol.3, N2. - P.1-4.
18. Justiz Vaillant A.A., McFarlane A, Smikle M,, et al. // J. Vaccines Vaccin. - 2013. - Vol.4, N7. - P.1-3.
19. Klemperer F// Archiv für experimentelle pathologie und pharmakologie. - 1893. - Vol.31. - P.356-382.
20. Krishnan L.K., Saroja J.B., Rajalingam M, et al. // Am. J. Clin. Experim. Mede. - 2015. - Vol.3, N1. -P.32-38.
21. Kuehn A, Kovac P,, Saksena R, et al. // Clin. Vaccine Immunol. - 2009. - Vol.16, N12. - P.1728-1737.
22. Kurreck J, Lauster R, Garbe L, Ellerbrok H. Präventions- und Therapiestrategien gegen Orthopockenviren. - Berlin, 2013. - P.1-133.
23. Megha P.U., Sentila R, MichaelA. // Res. J. Animal Veterinary Fishery Sci. - 2014. - Vol.2, N2. - P.9-12.
24. Mine Y, Kovacs-Nolan J. // J. Med. Food. - 2002. -Vol.5, N3. - P.159-169.
25. Nilsson E, Kollberg H, Johannesson M., et al. // J. Med. Food. - 2007. - Vol.10, N2. - P.375-378.
26. Nilsson E, Larsson A, Olesen H.V., Weaker P.E., Kollberg H. // Pediatr. Pulmonol. - 2008. - Vol.43, N9. -P.892-899.
27. Pauly D, DornerM, ZhangX., et al. // Poult. Sci. -2009. - Vol.88, N2. - P.281-290.
28. Rahman S, Higo-Moriguchi K, Htun K.W., et al. // Vaccine. - 2012. - Vol.30. - P.4661-4669.
29. Rahman S, Van Nguyen S, Icatlo FC., Umeda K, Kodama Y. // Hum. Vaccin Immunother. - 2013. -Vol.9. - P.1039-1048.
30. Rahman S, Faustino C. Icatlo, Nguyen Van Sa // Austin J. Clin. Med. - 2014. - Vol.1, N3. - P.1012.
31. Russell W.M.S., Burch R.L. The Principles of Humane Experimental Technique. - London, 1959. - 238 p.
32. Sakamoto I., IgarashiM., Kimura K., et al. // Antimicrobial Chemotherapy. - 2001. - Vol.47. - P.709-710.
33. Sarker S.A., Casswall TH., Juneja L.R., et al. // J. Pediatric Gastroenterol. Nutrition. - 2001. - Vol.32. -P.19-25.
34. Schade R., Staak C., et al. // ATLA. - 1996. -Vol.24. - P.925-934.
35. Schade R., Calzado E.G., Sarmiento R, et al. // ATLA. - 2005. - Vol.33. - P.129-154.
36. Shofiqur Rahman, Faustino C. Icatlo, Nguyen Van Sa // Austin J. Clin. Med. - 2014. - Vol.1, N3. - P.1012.
37. Spillner E, Braren I., Greunke K., et al. // Biologi-cals. - 2012. - Vol.40. - P.313-322.
38. Sugano N. // J. Periodontol. - 2009. - Vol.80. -P.1901-1903.
39. Sugita-Konishi Y, Sakanaka S, SasakiK., et al. // J. Agric. Food Chem. - 2002. - Vol.50. - P.3607-3613.
40. Sunwoo H.H., Sim J.S. IgY as ovo-nutraceuticals: Anti-gluten specific IgY enforced egg products for celiac disease. 2004. The 3rd International Symposium on Egg Nutrition for Health Promotion. April 18 to 21 Banff, Alberta, Canada.
41. Wallach M.G., Webby R.J., Islam F, et al. // Clin. Vaccine Immunol. - 2011. - Vol.18, N7. - P.1083-1090.
42. Wang Z, Wang Q. // Chinese J. Conservative Dentistry. - 2008. - Vol.6. - P.015.
43. Worledge K.L.., Godiska R, Barrett T.A., Kink J.A. // Dig. Dis. Sci. - 2000. - Vol.45, N12. - P.2298-2305.
44. Yamane T, Saito Y, Takizawa S., et al. // Food Processing Ingredients (in Japanese). - 2003. -Vol.38. - P.70.
45. Yokoyama K., Sugano N., Shimada T, et al. // J. Oral Sci. - 2007. - Vol.49. - P.201-206.
Поступила 10.02.2016 г.
