CC BY
66
ИММУНОЛОГИЯ
УДК 619: 616.074
Специфичность гуморальной иммунной реакции у быков-производителей на маркированную вакцину против ИРТ
Г.К. Юров, кандидат биологических наук, С.В. Алексеенкова, кандидат биологических наук,
К.П. Юров, доктор ветеринарных наук
ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко» (ВИЭВ) (Москва)
Ключевые слова: антитела, быки-производители, вакцина, вирус, гликопротеин Е, иммуноблоттинг, ИРТ, ИФА
Сокращения: ДСН — додецилсульфат натрия, ДТТ— дитиотрейтол, ИРТ — инфекционный ринотрахеит, ИФА — иммуноферментный анализ, КРС — крупный рогатый скот, М.м. — молекулярная масса, МЭБ — Международное Эпизоотическое Бюро, ПААГ — полиакриламидный гель, РН—реакция нейтрализации, ТЦД — тканевая цитопатическая доза
Введение
Создание высокопродуктивного животноводства — одно из приоритетных направлений развития сельского хозяйства страны. Задача в значительной степени решается путем импорта племенного скота. При этом возникает проблема обеспечения ветеринарного благополучия ввозимых животных (как правило, нетелей и быков-производителей) по инфекционным болезням, в первую очередь, включенным в список МЭБ. К числу этих болезней относится ИРТ — пустулезный вульвовагинит КРС. Животные, переболевшие ИРТ, могут оставаться скрытыми вирусоносителями и быть источником возбудителя инфекции. Особую опасность представляют быки-производители, которые передают вирус с инфицированной спермой [5]. Согласно рекомендациям МЭБ, КРС, экспортируемый в страны, неблагополучные по ИРТ, подлежит вакцинации против ИРТ. Как показывает практика, страны-экспортеры неукоснительно выполняют эти рекомендации. В результате в наши хозяйства поступает скот, вакцинированный против ИРТ. При этом следует иметь в виду, что антитела на вакцину могут маскировать постинфекционные антитела к эпизоотическому вирусу. Альтернативой в этом случае является использование генно-инженерных «маркированных» вакцин на основе «дефектного» по одному из мажорных гликопротеинов вируса [6]. В частности, известна вакцина на основе рекомбинантного вируса ИРТ, дефицитного по гликопротеину Е — «Bovilis IBR marker» [4].
Цель исследования
Оценить достоверность контроля гуморального ответа на маркированную вакцину против ИРТ у быков-производителей и возможность его дифференциации от иммунной реакции в результате заражения эпизоотическим вирусом ИРТ
Материалы и методы
Вирус. В работе использовали штамм «ТК-А» вируса ИРТ КРС из музея отдела вирусологии ВИЭВ.
Исследуемые сыворотки. Исследовали 24 сыворотки крови от импортных племенных быков ОАО «Московское по племенной работе», иммунизированных рекомбинантной вакциной против ИРТ КРС, сконструированной на основе вируса ИРТ с делецией гена, кодирующего гликопротеин Е.
Реакция нейтрализации. Уровень специфических антител определяли в РН на 96-луночных культуральных планшетах (фирмы «Согш^», США)» методом двукратных разведений испытуемой сыворотки против 100 ТЦД5о/мл вируса на лунку согласно стандарту МЭБ.
ИФА для обнаружения антител к гликопротеину Е вируса ИРТ КРС. Для постановки реакции использовали коммерческий диагностический набор «НеЫСЬек Anti-IBRgE» (фирмы «ГОЕХХ», Германия) по инструкции разработчика.
ИФА для обнаружения антител к различным полипептидам вируса ИРТ КРС. Для постановки реакции использовали «Набор для иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота» (ВИЭВ) по инструкции разработчика.
Электрофорез в буферной системе Лемли. ДСН-ПААГ электрофорез полипептидов вируса ИРТ КРС проводили в буферной системе Лемли [3] в 12%-м ПААГ в пластинах толщиной 0,75 мм на аппарате для выполнения вертикального электрофореза (фирмы «Хели-кон», Россия). Полипептиды разделяли в денатурирующих условиях с прогреванием в присутствии ДТТ, окрашивали 10%-м раствором нитрата серебра, как было описано ранее [1].
Иммуноблоттинг. После ДСН-ПААГ электрофореза проводили электроперенос на нитроцеллюлозную мембрану в полусухой буферной системе по методу Бюрнет [2]. Трек, содержащий маркер молекулярной массы белков (фирмы «Хеликон», Россия) окрашивали раствором Кумаси. Треки, содержащие антиген вируса ИРТ КРС, использовали для постановки имму-ноблоттинга. Реакцию проводили с моноклональными антителами к гликопротеину Е вируса ИРТ КРС из коммерческого диагностического набора «НеЫСЬек Anti-IBRgE» (фирмы «ГОЕХХ», Германия), контрольными сыворотками из набора для иммуноферментной диагностики ИРТ КРС (ВИЭВ) и исследуемыми сыворотками от серопозитивных быков. После инкубации с сыворотками полоски мембраны инкубировали с иммунопероксидазным коньюгатом против имму-
Специфичность гуморальной иммунной реакции у быков-производителей на маркированную вакцину против ИРТ
ноглобулинов класса G КРС (для моноклональных антител — с иммунопероксидазным коньюгатом против иммуноглобулинов класса G мышей). В качестве блокирующего раствора использовали овальбумин в концентрации 0,2 %. Для проявления реакции применяли субстратную смесь на основе хромогена — ортоди-анизидина.
Статистическая обработка. Иммунологические показатели оценивали с помощью средних геометрических величин, используя компьютерную программу Microsoft Office Excel 2003 для Windows.
Результаты и обсуждение
Проведено серологическое исследование на ИРТ бы-ков-производителей, импортировавнных из Германии, Дании и Голландии (племпредприятие ОАО «Московское по племенной работе»), вакцинированных согласно рекомендациям МЭБ. В данном случае использовали вирус-вакцину, сконструированную на основе рекомбинантного вируса ИРТ, дефицитного по гликопротеину Е (маркированная вакцина «Bovilis IBR marker», Германия). Иммунизированных быков размещали в изоляторе, где от них получали пробы крови для лабораторного исследования.
Результаты исследования проб в РН приведены в таблице 1. Вируснейтрализующие антитела выявляли у 41,7 % животных, из них с титром 1:4 — у 16,7 %; с титром 1:8 — у 25 %. Нейтрализующие антитела к вирусу ИРТ отсутствовали у 58,3 % вакцинированных животных, что можно расценивать, как низкую иммунореактивность быков или недостаточную чувствительность теста (РН).
Для исследования тех же проб использовали метод ИФА. Диагностический титр антител в этом тесте составлял 1 : 400. Чувствительность использованной тест-системы позволила выявить гуморальную иммунную реакцию у всех вакцинированных быков. Антитела к поверхностным полипептидам вируса ИРТ в разведении 1 : 400 выявили у 79,2 % ж:ивотных, в титре 1 : 800 — у 20,8 % (табл. 2).
Однако, на основании полученных результатов не удалось дифференцировать иммунную реакцию у быков на маркированную вакцину от иммунной реакции на инфицирование эпизоотическим вирусом. Поэтому те же пробы исследовали с использованием коммерческого набора «HerdChek Anti-IBRgE» (фирмы «IDEXX», Германия), предназначенного для выявления специфических антител к гликопротеину E вируса ИРТ. Посредством данного теста можно дифференцировать ранее зараженных животных от вакцинированных при условии использования вакцины, дефицитной по гликопротеину E. С использованием компонентов набора «HerdChek Anti-IBRgE» в ИФА удается различать животных, иммунизированных маркированной вакциной, от инфицированных или иммунизированных обычными вакцинами, поскольку присутствие антител к гликопротеину E свидетельствует о заражении эпизоотическим вирусом ИРТ и/или иммунизации полновирионной вакциной.
1. Вируснейтрализующие антитела в сыворотках крови быков
№ Инвентарный п/п номер животных Результаты исследования (титр антител) № п/п Инвентарный номер животных Результаты исследования (титр антител)
1 1 0 13 31 1 : 8
2 2 0 14 34 1 : 8
3 10 0 15 35 0
4 11 0 16 39 0
5 12 1 : 8 17 51 1 : 8
6 13 1 : 4 18 57 1 : 8
7 14 1 : 4 19 59 0
8 15 0 20 63 0
9 16 0 21 64 1 : 8
10 21 1 : 4 22 71 1 : 4
11 24 0 23 90 0
12 25 1 : 4 24 96 0
Средняя геометрическая величина (для титра антител) m м 2 сл 1+ 0 01 7
2. Выявление антител к различным полипептидам вируса ИРТ в сыворотке крови быков в ИФА
№ Инвентарный Результаты № Инвентарный Результаты
номер исследования номер исследования
п/п животных (титр антител) п/п животных (титр антител)
1 1 1 400 13 31 1 800
2 2 1 400 14 34 1 400
3 10 1 400 15 35 1 400
4 11 1 400 16 39 1 400
5 12 1 800 17 51 1 400
6 13 1 400 18 57 1 800
7 14 1 400 19 59 1 400
8 15 1 400 20 63 1 400
9 16 1 800 21 64 1 400
10 21 1 400 22 71 1 400
11 24 1 400 23 90 1 400
12 25 1 400 24 96 1 800
Средняя геометрическая величина (для титра антител) 63 о2 3о +1 2о 462 £
3. Выявление антител к гликопротеину Е вируса ИРТ в сыворотке крови быков в ИФА
№ п/п Инвентарный номер животных Результаты исследования № (коэффициент п/п S/N) Инвентарный номер животных Результаты исследования (коэффициент S/N)
1 1 1,8 13 31 1,9
2 2 2,0 14 34 2,7
3 10 2,1 15 35 1,8
4 11 1,9 16 39 1,9
5 12 1,8 17 51 2,3
6 13 2,1 18 57 1,8
7 14 1,9 19 59 1,9
8 15 1,8 20 63 1,8
9 16 1,9 21 64 1,7
10 21 2,3 22 71 2,1
11 24 2,2 23 90 1,9
12 25 1,9 24 96 1,8
Средняя геометрическая величина (для коэффициента S/N) m 1 9 О) 1+ 0 1
Результаты ИФА с компонентами коммерческого набора «НеЫСЬек Anti-IBRgE» приведены в таблице 3. Реакцию учитывали по значению 8/№ (образец/отрицательный контроль). Если 8/№ менее или равно 0,60, то образец классифицируют как положительный для антител к гликопротеину Е — антигену вируса ИРТ; если менее
0,7, но более 0,6, то такие образцы должны быть протестированы повторно. При 8/№ более 0,7 образец классифицируют как отрицательный для антител к гликопротеину Е. Вычисления выполняли по инструкции разработчика. У всех животных коэффициент составил выше 0,7, что свидетельствовало об отрицательной реакции.
РВЖ • СХЖ • № 3/2012
Г.К. Юров, С.В. Алексеенкова, К.П. Юров
По результатам исследований был сделан вывод, что выбранные методики ИФА специфичны, обладают высокой чувствительностью и позволяют проводить комплексный анализ иммунного ответа на вакцину.
Молекулярную массу и возможный состав вирусных полипептидов, с которыми взаимодействуют антитела в сыворотках крови быков, определяли посредством иммуноблоттинга после электрофореза в буферной системе Лемли с рядом незначительных модификаций. Для этого был приготовлен высокоочи-щенный антиген вируса ИРТ. Качество и количество антигена вируса ИРТ для постановки иммуноблоттинга было определено электрофорезом. Для этой цели вирусные полипептиды в различных концентрациях разделяли методом вертикального электрофореза в денатурирующих условиях. Результаты показали, что вирусный антиген содержит полипептиды с М.м. от 20 кДа до 97 кДа. Оптимальная нагрузка на трек антигена с активностью в ИФА 1 : 1000 составила 2,0 мкл.
На основе данных, полученных после электрофоретического анализа, был проведен иммуноблоттинг (рис.). При использовании поликлональной антисыворотки установлено взаимодействие антител с гликопротеинами вируса ИРТ, но моноклональные антитела к гликопротеину Е не реагировали с этим же гликопротеином. По-видимому, моноклональные антитела взаимодействуют с конформационными детерминантами полипептида, которые разрушаются в процессе проведения электрофореза в денатурирующих условиях. В исследованных пробах были обнаружены антитела только к вирусному полипептиду с М.м. приблизительно 30 кДа, что соответствует М.м. гликопротеина В — одного из главных иммунодоминант-ных полипептидов вируса ИРТ, ответственного за проникновение вируса в клетку хозяина.
Таким образом, установлено, что в пробах сыворотки крови быков-производителей, импортированных
Библиография
1. Юров Г.К., Народицкий Б.С., Ганиев А. Межмолекуляр-ные дисульфидные связи поверхностных полипептидов вируса инфекционного ларинготрахеита кур // Вопросы вирусологии, 1993; 4:174—176.
2. Burnette W.N. «Western blotting»: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioio-dinated protein A // Anal Biochem, 1981; 112 (2): 195—203.
3. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature, 1970; 227 (5259): 680—685.
Результаты иммуноблоттинга. Треки: 1 — отрицательная контрольная сыворотка;
2 — моноклональные антитела к гликопротеину Е вируса ИРТ;
3 — положительная контрольная сыворотка; 4 — сыворотка от серопозитивного быка;
5 — маркеры М.м.
из Голландии, Германии и Дании, циркулируют антитела к вирусу ИРТ КРС. Исследованиями, проведенными нами с коммерческим набором «HerdChek Anti-IBRgE», содержащим в качестве антигена гликопротеин Е, во всех случаях получены отрицательные результаты. Указанное позволяет сделать заключение, что в крови импортированных быков присутствуют специфические антитела, индуцированные вакциной «Bovilis IBR marker». При этом антитела к гликопротеину Е вируса ИРТ не были обнаружены.
Выводы
На основании полученных результатов можно сделать вывод, что импортированные быки свободны от носительства эпизоотического вируса ИРТ. Следовательно, комплексное исследование иммунизированных коммерческим препаратом «Bovilis IBR marker» быков в трех тестах (ИФА для определения антител к различным полипептидам вируса ИРТ, ИФА с моноклональными антителами к гликопротеину Е возбудителя; иммуноблоттинг) доказывает достоверность иммунной реакции на маркированную вакцину против ИРТ. При использовании этих тестов можно достоверно дифференцировать животных, иммунизированных маркированной вакциной, от зараженных вирусом (или иммунизированных обычными вакцинами).
4. Muylkens B., Meurens F., Schynts F., Farnir F., Pourchet A., Bardiau M., Gogev S., Thiry J., Cuisenaire A., Vanderplasschen A., Thiry E. Intraspecific bovine herpesvirus 1 recombinants carrying glycoprotein E deletion as a vaccine marker are virulent in cattle // J Gen Virol, 2006; 87 (8): 2149—2154.
5. Turin L., Russo S., Poli G. BHV-1: New molecular approaches to control a common and widespread infection // Molecular Medicine, 1999; 5: 261—284.
6. Van Drunen Little - Van Den Hurk S., Tikoo S. K., Liang X., Babiuk L. A. Bovine herpesvirus-1 vaccines // Immunology and Cell Biology, 1993; 71: 405—420.
Summary
G.K. Yurov, S.V. Alexeyenkova, K.P. Yurov. Specificity of Immune Responses in Cattle after Immunization by Marker IBRV Vaccine. Probes of sera from the bulls immunized by IBRV vaccine with deletion gene encoding gpE were tested with the purpose to reveal antibodies to all developed glycoproteins and simple gpE of IBRV in ELISA and Western blotting. It was able to differentiated the bulls immunized by marker vaccine from bulls that were naturally infected or immunized by ordinary vaccines. The results received are important for IBR prophylaxis of bulls at breeding farms.
