CC BY
126
Поведенческие реакции глубокостельных коров и проявление послеродовых заболеваний
3. Иммунобиологический статус сухостойных коров Библиография разных типов этологической активности
1. Анохин П.К. Системные механизмы высшей нервной деятельности. — М.: Наука, 1979.
2. Великжанин В.И. Методические рекомендации по использованию этологических признаков в селекции молочного скота. — Санкт-Петербург: Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных, 2000.
3. Зухарь А.В. Репродуктивная функция у крыс разного типа высшей нервной деятельности при стрессе, вызванном электростимуляцией // Журнал высшей нервной деятельности им. Павлова, 1985; 35(3): 585—587.
4. Колбаев С.В. Взаимосвязь гематологических показателей у нетелей с различным типом высшей нервной деятельности: автореф. дисс. ... канд. биол. наук. — Рязань, 2002.
5. Семагин В.Н., Зухарь А.В., Куликов М.А. Тип нервной системы, стрессоустойчивость и репродуктивная функция. — М.: Наука, 1988.
6. Функциональные системы организма / Под ред. К.В. Судакова. — М.: Медицина, 1987.
7. Шабунин С.В., Нежданов А.Г., Алехин Ю.Н. Проблемы профилактики бесплодия у высокопродуктивного молочного скота // Ветеринария, 2011; 2:3—8.
Summary
E.V. Smirnova, A.G. Nezhdanov, N.T. Klimov, V.I. Mikhalev. Behavioral Reactions of Late Pregnancy Cows and Development of Postpartum Diseases. 82 highly productive dairy cows had been used to study the effect of type’s animal behavior on the system of immunological protection and reproductive function. It is shown that ethological activity can be the extent indicator of susceptibility to development of obstetric-gynecological diseases.
ИММУНОЛОГИЯ
УДК 619: 616.98: 578.833.3: 616-076
Проверка клеточных культур на контаминацию вирусом диареи крупного рогатого скота -необходимое условие производства биологических препаратов
Показатели Типы поведения
ультраактивный активный пассивный инфрапассивный
Общий белок, г/л 75,5±2,17 77,8±1,48 75,3±2,92 76,4±1,28
Альбумины, % 47,0±2,11 44,0±1,46 43,2±2,18 45,8±1,41
а-глобулины, % 8,7±0,38 8,9±0,62 9,6±0,46 9,5±0,28
(3-глобулины, % 15,4±0,81 17,4±0,61 16,3±0,60 15,4±0,68
у-глобулины, % 28,9±1,83 29,7±1,36 30,9±1,53 29,3±1,19
Иммуноглобулины, г/л 26,9±1,50 34,0±2,21 33,7±3,43 24,6±1,42
БАСК, % 58,2±4,49 64,3±3,29 66,1±4,07 56,8±5,16
Лейкоциты, 109/л 7,70±0,40 8,68±0,45 8,50±0,44 8,78±0,35
Эозинофилы, % 6,25±1,17 5,25±1,19 6,29±0,71 3,88±0,87
Нейтрофилы, % 41,5±1,91 36,7±4,93 36,5±2,85 39,0±3,09
Моноциты,% 3,63±0,65 4,75±0,72A 5,38±0,46 3,00±0,59
Лимфоциты, % 48,6±1,96 54,0±5,46 52,6±2,71 54,5±2,88
Индексы: моноциты/ эозинофилы нейтрофилы/ моноциты нейтрофилы/ лимфоциты 0,58 11,4 0,85 0,90 7,7 0,68 0,86 6,8 0,69 0,77 13,0 0,71
С.В. Алексеенкова, кандидат биологических наук, Г.К. Юров, кандидат биологических наук,
Т.В. Гальнбек, кандидат биологических наук, И.А. Калита, К.П. Юров, доктор ветеринарных наук. ГНУ «<Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко» (ВИЭВ) (Москва).
Ключевые слова: вирусная диарея-болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота, культура клеток, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, реакция иммунофлуоресценции, филогенетический анализ, субгенотип 1а
Сокращения: ВД-БС — вирусная диарея-болезнь слизистых, ИРТ-ИПВ — инфекционным ринотрахеит-инфек-ционный пустулезный вульвовагинит, КРС — крупный рогатый скот, КЧС — классическая чума свиней, МЭБ — Международное эпизоотическое бюро, ОТ-ПТТР— полимеразная цепная реакция с обратной транскрип-
РВЖ • СХЖ • № 1/2013
цией, пн—последовательность нуклеотидов, ФИТЦ— флуоресцеин изотиоцианат, ID — infectious dose (инфекционная доза), INSD — International Nucleotide Sequence Data (Международная база данных нуклеотидных последовательностей)
Введение
В последние годы рядом авторов изучена биология ВД-БС КРС — представителя семейства Flaviviridae [1]. Особенностью возбудителя является распространенность штаммов, способных индуцировать персистентную инфекцию как в организме хозяина, так и в культурах клеток. В первом случае формируется стойкое неблагополучие стад по ВД-БС, во втором — скрытая контаминация клеточных линий, используемых в биологической промышленности и лабораторной практике.
Известны случаи контаминации разных клеточных культур и сывороток для их роста (в частности, культур перевиваемых линий «MDBK», «ПЭК», «Vero», «MDCK» и др.) штаммами вируса ВД-БС нецитопатогенного биотипа [2, 4]. Вследствие этого культуральные живые вакцины, приготовленные с использованием некачественного сырья, могут быть потенциальным источником вируса ВД-БС для восприимчивых животных, а контами-нированные диагностические антигены послужить причиной ложных результатов исследования. Первый вариант развития событий является особенно опасным.
23 февраля 1999 года сотрудники голландской Службы охраны здоровья животных рекомендовали всем ветеринарным врачам отложить вакцинацию КРС против ИРТ-ИПВ. За день до этого серьезное заболевание было зарегистрировано у коров на четырех молочных фермах после применения вакцины «IBR marker». В составе вакцины с помощью моноклональных антител был обнаружен контаминирующий агент — вирус ВД-БС КРС генотипа 2. Первые симптомы заболевания наблюдали у коров в 11 из 12 исследованных хозяйств в среднем через шесть дней после вакцинации. В пяти хозяйствах заболели более 70 % животных. В течение 1-й недели после вакцинации значительно уменьшились надои молока. В течение 2-й недели у некоторых животных развились клинические признаки: выделения из носовой полости, лихорадка и диарея. В конце 2-й недели и в начале 3-й число заболевших животных резко возросло, симптомы болезни стали более тяжелыми, а некоторые животные погибли. На вскрытии обнаруживали эрозии и язвы слизистой оболочки пищеварительного тракта, дегенерацию паренхимы печени, гиперемию слизистой оболочки сычуга и увеличение мезентериальных лимфатических узлов и селезенки. Всего в Голландии зарегистрировали три крупные вспышки ВД-БС КРС, связанные с применением зараженной вакцины. Причиной заболевания был эпизоотический вирус ВД-БС из сыворотки крови КРС в составе культуральной среды, использованной при изготовлении вакцины против ИРТ-ИПВ.
Таким образом, совершенствование системы контроля, направленного на предотвращение биологического загрязнения, является чрезвычайно важным этапом в производстве вакцин [3]. Источники вируса для контаминации культур клеток различны — сыворотка крови, входящая в состав среды для культивирования клеток; органы инфицированных животных, используемые для приготовления культур первичной линии клеток; другие контаминированные клеточные культуры. Согласно стандарту МЭБ для диагностических исследований, все клеточные культуры перед целевым использованием должны быть подвергнуты контролю на отсутствие вируса ВД-БС в нескольких пассажах. Сыворотка для роста культуры клеток должна быть свободна не только от вируса ВД-БС, но и от специфических антител [5].
Цель исследования
Проверка клеточных культур, хранящихся в коллекции лаборатории клеточной биотехнологии ВИЭВ, на возможную контаминацию вирусом ВД-БС нецитопатогенного биотипа.
Материалы и методы
Вирус. Штаммы вируса ВД-БС КРС: 1) референтный штамм цитопатогенного биотипа, выделенный из коммерческой вакцины «Mucosiffa», сконструированной на основе штамма «Oregon C24V», условно обозначенный как «Mucosiffa/12»; 2) лабораторный штамм нецитопатогенного биотипа «LU/12», адаптированный к росту в культуре клеток почки кролика «RK», из музея отдела вирусологии ВИЭВ.
Исследуемые культуры клеток. Субкультура первичной линии клеток почки теленка «ПТ» (15 пассаж); культуры перевиваемых линий клеток почки теленка — «MDBK» и «Таурус», почки эмбриона поросенка «СПЭВ», коронарных сосудов теленка «КСТ», легкого эмбриона коровы — «ЛЭК» и «ЛПК», почки кошки «FK», тестикул эмбриона коров «ТЭБ», почки кролика «RK», почки африканской зеленой мартышки «Vero» и селезенки эмбриона овцы, продуцирующей вирус лейкоза КРС, — «FLS» из коллекции клеточных культур ВИЭВ.
ОТ-ПЦР и определение нуклеотидных последовательностей. ОТ-ПЦР для идентификации генов неструктурного полипептида NS3 вируса ВД-БС КРС выполнена по методу, описанному ранее [8]. Нуклеотидные последовательности были определены в компании ЗАО «Постгеномные и нанотехнологические инновации» сотрудником Т.А. Акопиан на генетическом анализаторе ABI Prism Genetic Analyzer 3100.
Филогенетический анализ. Выравнивание частично расшифрованных последовательностей генов NS3 исследуемых штаммов с полными нуклеотидными последовательностями известных штаммов вируса ВД-БС КРС проводили, используя компьютерную программу «FASTA3» (Европейский институт биоинформатики). Филогенетический анализ и построение дерева выполнены с помощью компьютерных программ «dustalX2» (Дублинский Университет, Ирландия), «MEGA 5.0» (Университет штата Аризона, США) методом «присоединения соседей» со значениями «Bootstrap» на основе 1000 повторов с использованием нуклеотидных последовательностей из INSD.
Реакция иммунофлуоресценции. Для постановки реакции иммунофлуоресценции использовали прямой вариант. Монослой клеток промывали охлажденным фосфатно-солевым буферным раствором (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 2 мМ K2HPO4; pH 7,2) и фиксировали ацетоном. Затем клетки инкубировали с иммуноглобулинами мышей против вируса ВД-БС, мечеными ФИТЦ, взятыми в объеме 300 мкл в рабочем разведении. Инкубировали во влажной камере при 37°С в течение 45 мин. После этого клетки отмывали фосфатно-солевым буферным раствором 3.. .4 раза по 2.. .3 мин, после чего готовили для исследования под микроскопом с нефлуоресцирующим иммерсионным маслом. О наличии вируса ВД-БС КРС судили по яркой желто-зеленой флуоресценции.
Проверка клеточных культур на контаминацию вирусом диареи крупного рогатого скота — необходимое условие производства биологических препаратов
Результаты
Результаты исследований методом ОТ-ПЦР показали, что некоторые линии клеточных культур, а именно MDBK, СПЭВ и КСТ — хронически инфицированы вирусом ВД-БС КРС нецитопатогенного биотипа. Обнаруженные варианты вируса были условно обозначены как штаммы «MDBK/12», «SPEV/12» и «KST/12», соответственно. Культура клеток MDBK была проверена на разных стадиях роста. При этом максимальное накопление вируса наблюдали в стадии логарифмического роста клеток, а через 120 ч после формирования клеточного монослоя количество вируса значительно снижалось. Другие культуры были свободны от контаминации вирусом ВД-БС.
Продукты ОТ-ПЦР изучили методом филогенетического анализа. Конструкция филограммы (рис. 1) демонстрирует уровень нуклеотидных различий генома исследуемых вариантов вируса и штаммов вируса ВД-БС КРС, нуклеотидные последовательности которых были получены из INSD, и наглядно отражает принадлежность всех исследуемых образцов, включая контрольные штаммы, к генотипу 1 субгенотипу 1а.
Сравнительный анализ с помощью компьютерной программы «FASTA3» нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих неструктурный полипептид вируса NS3 (p80), штаммов «MDBK/12», «SPEV/12», «KST/12» и штаммов вируса ВД-БС КРС, зарегистрированных в INSD, показал общность происхождения исследуемых штаммов между собой и с эпизоотическим штаммом вируса ВД-БС — «190NCP» [7], выделенным в 1987 г. в Японии от телят во время вспышки геморрагического гастроэнтерита. Гомология составила в целом более 98 %. Позиция расшифрованных нуклеотидов в геноме исследуемых штаммов была определена относительно полноразмерной копии генома (12310 пн) известного штамма вируса ВД-БС КРС «Oregon C24V». Результаты приведены в таблице. По-видимому контаминация трех клеточных культур вирусом ВД-БС нецитопатогенного биотипа имеет единый источник происхождения. Результаты изучения контрольного штамма «LU/12» выявили его сходство с штаммом ВД-БС нецитопатоген-ного биотипа «IS13 NCP/99» [7], выделенным от коров в Японии в период 1974—1999 гг. (гомология 95,7 %).
Следующий этап нашей работы заключался в разработке экспресс-теста для обнаружения вируса ВД-БС КРС методом иммунофлуоресценции, который был выбран из-за быстроты выполнения и экономической целесообразности. Результаты представлены на рисунке 2. Применили прямой вариант метода. Для этого из гипериммунной сыворотки к вирусу ВД-БС, полученной путем иммунизации лабораторных мышей, выделили фракцию иммуноглобулинов и пометили флуорохромом — ФИТЦ. Активность конъюгата определили экспериментально в различных разведениях 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 на культуре клеток MDBK, хронически инфицированной вирусом ВД-БС. Использовали рабочее разведение конъюгата 1:20. Результаты проверки культуры клеток MDBK на контаминацию вирусом ВД-БС методом иммунофлуоресценции коррелировали с данными ОТ-ПЦР.
Далее мы выяснили методом иммунофлуоресценции титры вируса «Mucosiffa/12» при его накоплении без предварительной адаптации в субкультуре первичной линии
и от *nsttn юоиіаов» ими»? мяим
97/730 МОЯ?*
1 Мр7 AYMJ0M
mC24V АЮНМ
ММ »1
AF52(311 m?
L
«Of««?» сопіи і “1оі«шовю»ш I
,------B«e» 0«« I j
j jmv% unmu
2gl--1044 Д/2Ю064
-----0-16 Af256005 у
0U*tt ИМ4І7 *1
ері тип ]Ti
Рис. 1.
Филограмма, отражающая уровень нуклеотидных различий фрагмента гена NS3 исследуемых штаммов и известных нуклеотидных последовательностей вируса ВД-БС КРС, полученных из базы данных INSD
Л* *• у . •
, V ф%і
! • # *
Рис. 2. Обнаружение вируса ВД-БС КРС нецитопатогенного биотипа в культуре клеток методом иммунофлуоресценции, х200: а — выявление нецитопатогенного биотипа вируса ВД-БС в хронически инфицированной культуре клеток MDBK.
Яркое свечение в ядрах клеток и перинуклеарной зоне цитоплазмы; б — контроль, незараженная культура клеток RK.
Отсутствие флуоресценции
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей штаммов вируса ВД-БС КРС нецитопатогенного биотипа с помощью компьютерной программы «FASTA3»
Исследуемые штаммы Расшифрованные нуклеотидные последовательности Длина, пн Позиция* Наиболее сходные штаммы (инвентарный номер в базе даншх нуклеотидных последовательностей ШвР) Сходство (%)
«MDBK/12» 1046 5804... 7262 1) «190NCP» (АВ105726) 2) «KC86-1cp» (АВ078950) 3) «Oregon C24V» (AF091605) 98,6 98,1 87,9
«KST/12» 783 5803. 6882 1) «190NCP» (АВ105726) 2) «KC86-1cp» (АВ078950) 3) «Oregon C24V» (AF091605) 899 246
«SPEV/12» 917 5810. 7329 1) «190NCP» (АВ105726) 2) «KC86-1cp» (АВ078950) 3) «Oregon C24V» (AF091605) 98.1 98.1 89,4
«LU/12» 1096 5794. 7361 1) «IS13 NCP/99» (АВ105706) 2) «08GB44-1» (JQ418633) 3) «Oregon C24V» (AF091605) 95,7 94,6 88,2
* Позиция нуклеотидных последовательностей генов полипептида NS3
исследуемых штаммов определена относительно полноразмерной копии (1...12310 пн) генома, зарегистрированного в базе данных INSD штамма вируса ВД-БС КРС — «Oregon C24V» (AF091605).
клеток почки теленка ПТ и адаптированного вируса «ии/12» в культуре перевиваемой линии клеток почки кролика RK. Для этого культуры клеток были инфицированы указанными штаммами вируса в серийных десятикратных разведениях. Титры вируса составили 10 ГОбо/мл и 100000 ГО50/мл, соответственно. Полученные данные указывают, что метод иммунофлуоресценции мо-
а)
РВЖ • СХЖ • № 1/2013
жет быть удобным для быстрой проверки клеточных культур на контаминацию вирусом ВД-БС КРС, а также применим для определения титра по инфекционному действию на культуру клеток, что особенно важно для вируса нецитопатогенного биотипа.
Обсуждение
Термином «вирус ВД-БС» определяют группу вирусов, которые различаются по своей нуклеотидной последовательности, антигенным свойствам и влиянию на клетки хозяина. Установлены 2 генотипа вируса. Генотип 1 подразделяют на 11 субгенотипов: 1а, 1b, 1с и т. д., роль которых в патологии ВД-БС пока не выяснена. Генотип 2 включает в себя 2 субгенотипа: 2а и 2b и объединяет штаммы, вызывающие острое и сверхострое течение болезни, характеризующейся высокой смертностью, тромбоцито-пенией и геморрагиями [6]. Результаты изучения вариантов вируса ВД-БС, обнаруженных в культурах клеток из коллекции ВИЭВ, показали, что все они принадлежат к генотипу 1 субгенотипу 1 а. Филограмма (см. рис. 1), включает зарегистрированные в базе данных INSD штаммы различных генотипов и субгенотипов вируса ВД-БС, а также родственный ему другой вид рода Pestívirus семейства Fla-viviridae — вирус КЧС. В естественных условиях вирус ВД-БС является патогенным для КРС и свиней.
Учитывая полученные нами результаты и проанализировав литературные данные [2], можно сделать вывод, что клеточные культуры бычьего и свиного происхождения подвержены контаминации вирусом ВД-БС в наибольшей степени. Филогенетический анализ штаммов «MDBK/12», «SPEV/12» и «KST/12», обнаруженных в одноименных клеточных культурах, выявил их значительное сходство между собой и с эпизоотическим штаммом вируса ВД-БС — «190NCP» [7] нецитопатогенного биотипа, обнаруженным у
Библиография
1. Сергеев О.В. Иммунобиологические и патогенетические особенности вирусной диареи крупного рогатого скота // Ветеринария, 2011; 5:16—21.
2. Урываев Л.В., Дедова А.В., Дедова Л.В., Ионова К.С., Пара-сюк Н.А., Селиванова Т.К., Бунькова Н.И., Гущина Е.А., Гребенникова Т.В., Подчерняева Р.Я. О контаминации клеточных культур вирусом диареи — болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (BVDV) // Бюллетень экспериментальной биологии медицины, 2012; 1:88—93.
3. Barkema H.W., Bartels C.J., van Wuijckhuise L., Hesselink J.W., Holzhauer M., Weber M.F., Franken P., Kock P.A., Bruschke C.J., Zimmer G.M. Outbreak of bovine virus diarrhea on Dutch dairy farms induced by a bovine herpesvirus 1 marker vaccine contaminated with bovine virus diarrhea virus type 2 // Tijdschr. Diergeneeskd., 2001; 126 (6): 191—197.
4. Castro M.D., Stoffregen W.C., Bregman G.P., Hillard K.A. A method to detect bovine viral diarrhea virus contamination in cell cul-
телят в Японии в 1987 г. во время вспышки геморрагического гастроэнтерита (гомология составила в целом более 98 %). Очевидно, что контаминация культур вирусом имеет единый источник происхождения, возможно, это зараженная сыворотка для культивирования клеток. В настоящее время известно, что вирулентные нецитопатогенные штаммы вируса ВД-БС, обусловливающие развитие геморрагической болезни телят, также могут вызвать лихорадку, тяжелую диарею, геморрагические поражения слизистых и гибель взрослых животных в течение двух недель [1].
Таким образом, исследуемые штаммы вируса ВД-БС КРС, обнаруженные в хронически инфицированных клеточных культурах MDBK, СПЭВ и КСТ из коллекции культур клеток ВИЭВ, могут представлять опасность для восприимчивых животных, если они случайным образом кон-таминируют биологические препараты, предназначенные для профилактики и лечения КРС.
Выводы
Методом ОТ-ПЦР обнаружена контаминация вирусом ВД-БС КРС культур перевиваемых линий клеток почки теленка «MDBK», почки поросенка «СПЭВ» и коронарных сосудов теленка «КСТ» из коллекции культур клеток ВИЭВ. Филогенетический анализ вирусов, обнаруженных в клеточных культурах, выявил их значительное сходство между собой и с эпизоотическим штаммом вируса ВД-БС — «190NCP» нецитопатогенного биотипа, обнаруженным у телят в Японии в 1987 г. во время вспышки геморрагического гастроэнтерита (гомология составила в целом более
98 %). Результаты экспресс-теста для обнаружения вируса ВД-БС методом иммунофлуоресценции коррелируют с данными ОТ-ПЦР. Метод иммунофлуоресценции удобен для определения титра вируса ВД-БС нецитопатогенного биотипа в зараженных клеточных культурах.
tures using immunoperoxidase staining // J. Vet. Diagn. Invest., 1997; 9: 427—431.
5. Edwards S., Doyle A., Griffiths J.B. & Newell D.G. Bovine viral diarrhea virus. // Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, 1993; 7B (5): 1—8.
6. Nagai M., Hayashi M., Itou M., Fukutomi T., Akashi H., Kida H., Sakoda Y. Identification of new genetic subtypes of bovine viral diarrhea virus genotype 1 isolates in Japan // Virus Genes, 2008; 36:135—139.
7. Nagai M., Hayashi M., Sugita S., Sakoda Y., Mori M., Murakami T., Ozawa T., Yamada N., Akashi H. Phylogenetic analysis of bovine viral diarrhea viruses using five different genetic // Virus Res., 2004;
99 (2): 103—113.
8. Uruno K., Shibata I., Nakane T. Detection of Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV) Using Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Assay // J. Vet. Med. Sci., 1998; 60 (7): 867—870.
Summary
S.V. Alexeyenkova, G.K. Yurov, T.V. Galnbek, I.A. Kalita, K.P. Yurov. Cell Cultures Control Contamination by Bovine Viral Diarrhea Virus is the Necessary Condition for Biology Drugs Production. Cell cultures of bovine and porcine origin are subject to contamination by BVDV. Results of phylogenetic analysis of strains: «MDBK/12», «SPEV/12» and «KST/12» which are detected in the corresponding cell cultures showed significant similarity to each other and to epizootic strain of BVDV — «190NCP» of noncytopathogenic biotype that was discovered in calves in Japan in 1987 during an outbreak of hemorrhagic gastroenteritis (nucleotide sequence similarity was generally more than 98 %). The results indicate that the source of the virus, probably served as bovine serum used in the growth medium for cell culture.
