CC BY
487
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
Иммунологические методы диагностики инфекционной анемии лошадей
Г.К. Юров, кандидат биологических наук, С.В. Алексеенкова, кандидат биологических наук,
К.А. Диас Хименес, К.П. Юров, доктор ветеринарных наук.
ГНУ «<Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко» (ВИЭВ) (Москва).
Ключевые слова: диагностика, иммуноблоттинг, иммуноферментный анализ, инфекционная анемия лошадей, реакция диффузионной преципитации Сокращения: ВИЧ — вирус иммунодефицита человека, ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота, ДСН— додецилсульфат натрия, ДТТ — дитиотрейтол, ИНАН — инфекционная анемия, ИФА — иммуноферментный анализ, МЭБ — Международное Эпизоотическое Бюро, ОТ-ПЦР—полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, ПААГ — полиакриламидный гель, РДП — реакция диффузионной преципитации, РН—реакция нейтрализации, РНГА — реакция непрямой гемагглютинации, РТГА — реакция торможения гемагглютинации, РСК — реакция связывания комплемента, РТСК — реакция торможения связывания комплемента
Введение
Ретровирусная инфекция лошадей, или ИНАН, характеризуется длительной (пожизненной) персистен-цией возбудителя, который наряду с возбудителями лейкоза крупного рогатого скота, ВИЧ, медленных инфекций овец и др. относится к семейству ретровирусов (Retroviridae), подсемейству лентивирусов ^епиутпае). В механизме длительной персистенции вируса и периодических рецидивов болезни ключевую роль играют дефектность ретикулоэндотелиаль-ной системы, низкая иммунная реакция на вирус, стабильная интеграция вирусного генома в ДНК клетки-хозяина и антигенный дрейф. Эти особенности патогенеза обусловливают трудности диагностики и борьбы с заболеванием. Клинически заболевание может протекать в острой, подострой или хронической форме.
В организме лошади вирус поражает макрофаги, моноциты и, возможно, другие типы клеток. Ответная иммунная реакция организма возникает на имму-нодоминантные вирусные белки, ответственные за продукцию антител [5]. Последние обнаруживают с по-
мощью иммунологических (серологических) реакций, представленных в таблице.
Нейтрализующие антитела к поверхностным гликопротеинам вируса появляются в среднем через 30 дней после заражения и обнаруживаются на протяжении многих лет. Однако защитное действие нейтрализующих антител невысокое. Ю. Коно с со-авт. экспериментально доказали, что вирус ИНАН подвержен антигенному дрейфу в течение его репродукции в организме [11]. Сыворотка крови зараженной лошади нейтрализует вирус, который используют для заражения, но она не активна против вновь репродуцированного вируса. Новые антигенные варианты вируса появляются в течение каждого рецидива болезни. При этом у лошади создается состояние нестерильного иммунитета, когда в крови одновременно присутствуют специфические антитела и инфекционный вирус. В результате формируются иммунные комплексы антиген-антитело.
Патологические изменения при ИНАН в значительной степени обусловлены иммунопатологической реакцией [7], поскольку иммунная реакция у зараженных лошадей ассоциируется с постоянной виремией. Иммунные комплексы, образующиеся при ИНАН посредством иммунопатологических реакций, индуцируют пролиферативный гломерулонефрит, истощение комплемента и лихорадку [1, 18]. Состояние нестерильного иммунитета (одновременное нахождение в крови вируса и антител к нему) позволяет использовать иммунологические методы для диагностики ИНАН. Первое сообщение о серологической диагностике ИНАН было сделано в 1966 г. японскими исследователями Ю. Коно и К. Кабаяши, которые предложили использовать РСК с культуральным антигеном [12]. Позже, однако, выяснилось, что РСК выявляет только ранние антитела (иммуноглобулины класса М). В настоящее время основным методом определения больных лошадей служит РДП в геле — тест Коггинса [3...5, 9].
Иммунологические реакции у лошадей на вирус ИНАН
Антитела Тест Специфичность Первое появление Титр Продолжительность
Преципитирующие РДП Групповая 14...50 дней после заражения, 2...10 дней после пирексии 1:4.1:16 (до 1:128) В течение жизни
Комплемент-зависимые РСК » То же ~ 1:128 В течение жизни (не определяются после 3.60 дней)
Комплемент-зависимые ингибирующие РТСК » » До 1:512 В течение жизни
Нейтрализующие РН Типовая к штамму 10.60 дней после заражения 1:128.1:256 (до 1:2048) То же
Ингибирующие гемагглютинацию РТГА То же Не установлено До 1:256 »
Гемагглютинины РНГА Групповая 14.50 дней после заражения, 2.10 дней после пирексии До 1:10240 »
Иммунологические методы диагностики инфекционной анемии лошадей
Современная стратегия серологическом диагностики ИНАН
РДП — эталонный метод диагностики ИНАН лошадей, принятый за международный стандарт. Специфичность реакции и достоверность результатов были доказаны путем проведения международных испытаний этого теста, организованных профессором В. Тома (Высшая ветеринарная школа, Альфор, Франция) [6]. Установлена строгая корреляция положительных результатов теста с присутствием вируса в крови больных животных [6]. Кровь от лошадей, положительно реагирующих в РДП, содержит инфекционный вирус и при парентеральном введении здоровой лошади вызывает типичное заболевание. Надежность теста позволила МЭБ рекомендовать РДП для диагностики ИНАН при международных перевозках лошадей, их продаже на аукционах, участии в конноспортивных соревнованиях и т. д. [3]. Посредством РДП можно выявлять зараженных лошадей независимо от формы течения и продолжительности инфекционного процесса.
Основной вирусный антиген, участвующий в реакции, — полипептид с молекулярной массой 26 кДа (р26), продукт экспрессии вирусного гена gag, который составляет около 40 % всей массы полипептидов ви-риона. Ген gag представляет собой высококонсервативный участок генома и присутствует у всех антигенных вариантов вируса. В РДП выявляют антитела преимущественно к р26, так как он доминирует в составе антигенов. В редких случаях в РДП можно обнаружить антитела к полипептиду р15. В организме больной лошади вирус реплицируется в моноцитах и макрофагах крови, что обусловливает лихорадку и другие клинические симптомы. Первый раз виремию можно обнаружить уже через 5...7 дней после заражения, гуморальный иммунный ответ — через 12 дней. В РДП противовирусные антитела обычно выявляют через 15.25 дней после заражения. В очень редких случаях антитела обнаруживаются значительно позже. Инфицированные лошади до конца жизни остаются хроническими вирусоносителями, что обязательно учитывается в современных программах по контролю распространения ИНАН в мире [4].
Тем не менее РДП, как и все серологические методы, имеет недостатки. Например, может быть получен отрицательный результат с пробами сыворотки крови, собранными от больных лошадей в начале заболевания, когда титр специфических антител в крови не достигает уровня, необходимого для их обнаружения. Такие лошади должны быть протестированы повторно через 10.14 дней. В данном случае проблема не считается истинным ложноотрицательным результатом, несмотря на то, что инфицированные лошади уже являются вирусоносителями, но результат РДП временно остается отрицательным. В подобных случаях для уточнения результатов может быть использован метод ОТ-ПЦР в модификации с вложенной парой праймеров («nested RT-PCR») [15]. Истинные ложноотрицательные результаты в редких случаях получают при исследовании инфицированных ви-
русом ИНАН лошадей с первичным (врожденным) или вторичным иммунодефицитом [5, 10]. Подобные лошади остаются хроническими вирусоносителями, но их инфекцию невозможно подтвердить серологическими методами. Положительный результат, который не является истинным ложноположительным, но может быть неверно истолкован, встречается у жеребят, которые приобретают пассивный иммунитет с молозивом больной матери, но сами при этом остаются свободными от инфекции. У жеребят, полученных от зараженных кобыл, в крови сохраняются коло-стральные антитела, количество которых постепенно снижается в течение первых трех—шести месяцев жизни. Установить отрицательную динамику антител можно, применив ИФА — альтернативный метод исследования лошадей на ИНАН.
Конкурентный вариант ИФА для определения антител к р26 впервые применили для диагностики ИНАН лошадей в США в конце 80-х гг. прошлого века. Успешные опыты по размножению некоторых штаммов вируса ИНАН в культурах клеток кожи или почки лошади позволили производить достаточное количество вируса, чтобы приготовить диагностический антиген для ИФА. Вирионы очищали центрифугированием в изопикническом градиенте, дезинтегрировали ацетоном и разделяли полученные полипептиды на хроматографической колонке методом гель-фильтрации. Современные тест-системы для диагностики ИНАН в ИФА, как правило, включают в себя антигены рекомбинантных белков, полученных методом генной инженерии. В настоящее время коммерческие ИФА-наборы для серологической диагностики ИНАН производят по 4 схемам: 1) конкурентный вариант ИФА, антиген р26; 2) непрямой вариант ИФА, антиген р26; 3) непрямой вариант ИФА, антиген gp45; 4) непрямой вариант ИФА, антиген р26 + gp45. По результатам сравнительного анализа тест-систем наиболее специфичным считают набор схемы №3, но по чувствительности он уступает всем остальным [17]. В целом ИФА — менее субъективный метод в сравнении с РДП, учет результатов реакции может быть полностью автоматизирован. Преимущества метода — быстрота выполнения (около 2 ч) и высокая чувствительность. Результаты ИФА коррелируют с данными РДП. Противоречивые результаты (положительные в ИФА и отрицательные в РДП) могут быть получены по двум причинам: из-за низкого уровня антител к р26 в образце; из-за содержания в образце антител против межвидовых разновидностей р26, которые можно определить только в ИФА, но не в РДП. Межвидовые разновидности антигена р26 образуются в процессе эволюции лентивирусов в природе [13]. При этом в соответствии с рекомендациями МЭБ, все пробы, положительно реагирующие на ИНАН в ИФА, должны быть проверены в РДП [16].
Иммуноблоттинг — метод, посредством которого выявляют антитела к различным полипептидам вируса ИНАН — р26, gp45 и gp90, гомологичным поверхностным гликопротеинам gp120 и gp41 ВИЧ. Несмотря на тот факт, что белки gp45 и gp90 обнаружены в
РВЖ • СХЖ • № 1/2013
Г.К. Юров, С.В. Алексеенкова, К.А. Диас Хименес, К.П. Юров
составе вируса ИНАН в меньшем количестве, чем р26, они являются иммунодоминантными антигенами и стимулируют образование антител на уровне, более высоком, чем в случае р26. После заражения вначале образуются антитела к gp90, а затем к р26. Это свойство используют для ранней лабораторной диагностики лошадей. Таким образом, иммуноблоттингом можно выявить зараженных лошадей раньше, чем в РДП.
Практическое применение альтернативных методов диагностики ИНАН в лаборатории вирусологии ВИЭВ
В нашей лаборатории при мониторинге, диагностических исследованиях, а также исследованиях лошадей при международных перевозках используют помимо РДП альтернативные методы, в частности им-муноблоттинг с антигеном вируса ИНАН — р26. Порядок применения метода представлен на примере частного случая исследования лошадей.
ДСН-ПААГ электрофорез полипептидов вируса ИНАН и белков-маркеров молекулярной массы от 21 до 97 кДа проводили в буферной системе Лем-ли [14] в 12%-м ПААГ в пластинах толщиной 0,75 мм на аппарате для вертикального электрофореза. Разделение полипептидов в денатурирующих условиях с прогреванием в присутствии ДТТ, окраску 10%-м раствором нитрата серебра проводили по методу, предложенному ранее [2]. После ДСН-ПААГ электрофореза переносили белки на нитроцеллю-лозную мембрану в полусухой буферной системе по методу Бюрнет [8]. Трек, содержащий белки-маркеры, окрашивали раствором Кумаси. Треки, содержащие антиген р26 вируса ИНАН, использовали для постановки иммуноблоттинга. Реакцию проводили с сыворотками крови животных, положительно или сомнительно реагирующими в РДП. После инкубации с сыворотками полоски мембраны инкубировали с иммунопероксидазным коньюгатом против иммуноглобулинов класса G лошадей. В качестве блокирующего раствора использовали овальбу-мин в концентрации 0,2 %. Для проявления реакции применяли субстратную смесь на основе хромогена — ортодианизидина. Результаты частного исследования на ИНАН десяти проб сыворотки крови лошадей методом иммуноблоттинга представлены на рисунке. В пробе № 6 обнаружены антитела к антигену р26 вируса ИНАН, с другими пробами получены отрицательные данные. Результаты исследования всех проб были подтверждены в РДП.
1 2 3456789 10 Маркер
97 «д*
ЗІОі
21 кДа
положительный результат, антитела в сыворотке крови больной лошади взаимодействуют с антигеном р26 вируса ИНАН.
Результаты иммуноблоттинга
Заключение
ИНАН лошадей характеризуется длительной (пожизненной) персистенцией возбудителя независимо от формы течения болезни — острой, подострой или хронической. При этом в крови лошадей одновременно присутствуют антитела и вирус. Основные патологические изменения у лошадей обусловлены патологическим действием иммунных комплексов антиген-антитело.
Иммунная реакция организма развивается на им-мунодоминантные вирусные белки, ответственные за продукцию антител. Последние обнаруживают с помощью иммунологических (серологических) реакций. Стандартным методом диагностики ИНАН служит РДП в геле (тест Коггинса). Иммунологические (серологические) тесты позволяют выявлять больных лошадей на разных стадиях инфекционного процесса и течения болезни. Исключение составляют начальный период формирования гуморального иммунного ответа, сверхострая форма инфекции и др. В подобных случаях для прямого обнаружения вируса можно прибегнуть к методу ОТ-ПЦР в модификации с вложенной парой праймеров («nested RT-PCR»).
К альтернативным методам относят ИФА и имму-ноблоттинг. С помощью иммуноблоттинга можно выявлять антитела к различным полипептидам вируса ИНАН — р26, gp 45 и gp90, гомологичным поверхностным гликопротеинам gp120 и gp41 ВИЧ. Несмотря на тот факт, что белки gp45 и gp90 обнаружены в составе вируса ИНАН в меньшем количестве, чем р26, они являются иммунодоминантными антигенами и стимулируют образование антител на уровне, более высоком, чем р26. Указанное позволяет использовать метод для дифференциации сомнительных и ложноположительных результатов.
Библиографию см. на сайте http://logospress.ru/
Summary
G.K. Yurov, S.V. Alexeyenkova, K.A. Dias-Himenes, K.P. Yurov. Immunological Methods for Diagnostic of Equine Infectious Anemia. Equine infectious anemia (EIA) is characterized by long-term pathogen persistence regardless of the clinical course: acute, subacute and chronic. Antibodies and virus are presented in the blood of horses simultaneously. Cause of main pathological changes in horses is abnormal immune effect of antigen-antibody complexes. Immune response occurs on the immunodominant viral proteins responsible for the production of antibodies. Standard diagnostic method of EIA that allows to identify infected horses regardless of the clinical course of the infection is the agar gel immunodiffusion (AGID — Coggins test). Alternative methods there is ELISA and immunoblot-ting. For the direct detection of the virus in some cases the method of nested RT-PCR are used.
