CC BY
104
ВИРУСОЛОГИЯ
УДК 619:616.98:616-078
Ретроспективная иммуноферментная диагностика гриппа птиц H5N1
Г.К. Юров1, М.М. Сайдарова2, С.В. Алексеенкова1, М. Амирбеков3, К.П. Юров1
1 ГНУ «<Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко (ВИЭВ)» РАСХН.
2 НП «Биологические препараты» ТАСХН (Республика Таджикистан).
3 Служба государственного ветеринарного надзора Министерства сельского хозяйства Республики Таджикистан.
Ключевые слова: вирус гриппа птиц H5N1, иммуно-ферментный анализ, иммуноблотинг, куры, Республика Таджикистан
Сокращения: ДСН — додецилсульфат натрия, ДТТ— дитиотрейтол, ИФА — иммуноферментный анализ, ОП — оптическая плотность, ПААГ—полиакрила-мидный гель, РГА — реакция гемагглютинации, SPF— specific pathogen free (свободные от специфических патогенов)
Введение
Вирусы гриппа имеют постоянного природного хозяина — птиц, у которых данная инфекция характеризуется разнообразным течением — от массового острого заболевания с летальностью, приближающейся к 100 %, до бессимптомной атипичной формы [7]. Локализация природных очагов и пути распространения вирусов гриппа связаны с местами гнездования и маршрутами перелета многих видов диких птиц. Через Республику Таджикистан пролегают основные пути миграции перелетных птиц из Индокитая и Китая. Вследствие этого на данной территории можно ожидать частые вспышки гриппа птиц. Действительно, ранее были обнаружены штаммы нескольких подтипов вируса гриппа птиц — Н6 (1972 г.), Н7 (1976—1978 гг.) и Н4 (1978— 1979, 1983—1984 гг.) [3].
Однако, несмотря на то, что в сопредельных странах периодически возникают эпизоотии высокопатогенного вируса гриппа птиц (H5N1), до настоящего времени вспышки этой инфекции в Республике Таджикистан не регистрировали [1], а результаты лабораторных исследований на грипп, проводившиеся в 2006—2010 гг. оставались отрицательными [2].
Цель исследования
Объективно оценить эпизоотическую обстановку по гриппу птиц в указанном регионе посредством ретроспективных иммунологических исследований с тем, чтобы выявить возможную циркуляцию вируса H5N1 в популяции домашней птицы.
Материалы и методы
Вирусы. В работе использовали штамм «А/ск/8кс*/59» (H5N1) вируса гриппа птиц, предоставленный Центром ВОЗ в порядке научно-технической помощи Республике Таджикистан по программе «Проект по контролю за птичьим гриппом». Для размножения вируса использовали 9.. .10-суточные куриные эмбрионы SPF (фирмы «VALO-SPF», Германия). Накопление вируса контролировали в РГА с 1 % взвеси куриных эритроцитов.
ИФА для обнаружения антител к типоспецифическо-му антигену вируса гриппа А птиц. Для постановки реакции использовали коммерческий диагностический набор «FLOCKSREEN Avian Influenza virus ELISA KIT (AI)» (фирмы «x-OvO», Великобритания) по инструкции разработчика.
ИФА для обнаружения антител к субтипоспецифи-ческому антигену вируса гриппа H5N1 птиц. 96-лу-ночные иммунологические планшеты (фирмы «Greinerbio», Германия) сенсибилизировали антигеном вируса гриппа птиц H5N1 в фосфатном буфере (рН 7,4). В качестве тест-контролей использовали отрицательную и положительную контрольные сыворотки из коммерческого диагностического набора «AniGen H5 AIV Ag ELISA» (фирмы «Animal Genetics, Inc», Южная Корея). Сыворотки крови кур в двукратных разведениях инкубировали в течение 2 ч при 37°С. После инкубации с сыворотками добавляли иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов класса G кур. В качестве хромогена использовали 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (фирмы «Медико — диагностическая лаборатория», Россия).
Электрофорез в буферной системе Лемли. ДСН-ПААГ электрофорез полипептидов вируса гриппа кур H5N1 проводили в буферной системе Лемли [6] в 12%-м ПААГ в пластинах толщиной 0,75 мм на аппарате для вертикального электрофореза (фирмы «Хеликон», Россия). Полипептиды разделяли в денатурирующих условиях с прогреванием в присутствии ДТТ, как было описано ранее [4].
Иммуноблотинг. После ДСН-ПААГ электрофореза проводили электроперенос на нитроцеллюлозную мембрану в полусухой буферной системе по методу Бюрнет [5]. Трек, содержащий маркер молекулярной массы белков (фирмы «Хеликон», Россия), окрашивали раствором Кумаси. Треки, содержащие антиген вируса гриппа птиц H5N1, использовали для постановки иммуноблотинга. Реакцию проводили с моноклональными антителами к гемагглютинину H5 вируса гриппа птиц, отрицательными и положительными контрольными сыворотками из коммерческого диагностического набора «AniGen H5 AIV Ag ELISA» (фирмы «Animal Genetics, Inc», Южная Корея) и сыворотками серопозитивных кур из различных областей Республики Таджикистан. После инкубации с сыворотками полоски мембраны инкубировали с иммуно-пероксидазным коньюгатом против иммуноглобулинов класса G кур (для моноклональных антител — с имму-нопероксидазным коньюгатом против иммуноглобулинов класса G мышей). В качестве блокирующего раствора использовали овальбумин в концентрации 0,2 %. Для проявления реакции использовали субстратную смесь на основе хромогена — ортодианизидина.
Г.К. Юров, М.М. Сайдарова, С.В. Алексеенкова, М. Амирбеков, К.П. Юров
Рис. 1. Выявление антител к типоспецифическому антигену вируса гриппа А птиц в ИФА (разведение сыворотки 1 : 400) п = 108
ОП, усл. ед
V//''/ «V
Рис. 2. Выявление антител к субтипоспецифическому антигену вируса гриппа Н5Ы1 птиц в ИФА (разведение сыворотки 1:200), п=108.
В районах ГБАО, Джилликул, Кабадиян, Файзабад, Варзоб проводили профилактическую вакцинацию кур против гриппа птиц инак-тивированной вакциной, сконструированной на основе вируса гриппа птиц H5N1 (ОАО «Покровский завод биопрепаратов», Россия).
- 35 кЛа
97 кЛа 66 кЛа
■ 45 кЛа
■ 31 кЛа 21 кЛа
Рис 3. Результаты иммуноблотинга: 1, 2 - исследуемые сыворотки (район Шахринав); 3, 4 - исследуемые сыворотки (район Рашт); 5 - моноклональные антитела к H5 вируса гриппа птиц из коммерческого набора «AniGen H5 AIV Ag ELISA», 6 - положительный тест-контроль из коммерческого набора «AniGen H5 AIV Ag ELISA»; 7 - отрицательный тест-контроль из коммерческого набора «AniGen H5 AIV Ag ELISA»; 8 - маркеры молекулярной массы
Результаты и обсуждение
Чтобы выявить антитела к типоспецифическому антигену вируса гриппа А птиц, мы исследовали в ИФА пробы сывороток, полученных от кур из районов: Вахдат, Шахринав, Файзабад, Рашт Республики Таджикистан — с помощью диагностического коммерческого набора «FLOCKSREEN Avian Influenza virus ELISA KIT (AI)» (фир-
мы «x-OvO», Великобритания). Результаты приведены на рисунке 1. Антитела к типоспецифическому антигену вируса гриппа А птиц в достоверно диагностических титрах были выявлены в пробах, полученных из 4-х административных районов. Наиболее высокие титры антител обнаруживали в сыворотках, полученных из района Шахринав и в более низких титрах — в пробах из других 3-х районов. Наличие иммунного ответа у кур на типо-специфический белок вируса гриппа А свидетельствует о циркуляции возбудителя гриппа в популяции птиц на территории Республики Таджикистан. Полученные результаты послужили основанием для продолжения исследований с целью выяснения подтиповой принадлежности вирусов.
Первостепенное значение мы придавали изучению возможной циркуляции штаммов высокопатогенного вируса гриппа птиц H5N1. Принимая во внимание отсутствие острых вспышек гриппа птиц в популяции кур Таджикистана, особый интерес представляло обнаружение с помощью методов ретроспективной иммуно-ферментной диагностики факта циркуляции гриппа птиц. С этой целью мы разработали тест-систему на основе непрямого варианта твердофазного ИФА для выявления антител у кур к субтипоспецифичекому антигену вируса гриппа птиц H5N1. Компоненты тест-системы использовали для исследования сывороток крови кур, полученных из районов: ГБАО (Горно-Бадахшанская автономная область), Джилликул, Кабадиян, Файзабад, Варзоб, Вахдат, Рашт и Шахринав Республики Таджикистан. Результаты приведены на рисунке 2. Наиболее высокие титры антител в ИФА были выявлены в пробах из района Шахринав, и они превышают уровень антител положительного тест-контроля, что коррелирует с результатами по выявлению антител к типоспецифическо-му антигену вируса гриппа А птиц. Данные, полученные по районам: ГБАО, Джилликул, Кабадиян, Файзабад, Варзоб, по-видимому, объясняются проведенной вакцинацией кур против гриппа и не отражают картину распространения эпизоотического вируса.
Чтобы подтвердить специфичность результатов, полученных в ИФА, использовали иммуноблотинг. Предварительно был проведен вертикальный электрофорез в ДСН-ПААГ с целью аналитического разделения полипептидов вируса гриппа птиц H5N1. ДСН — один из наиболее эффективных детергентов, растворяющих не связанные ковалентно белковые агрегаты. Под действием ДСН в сочетании с восстанавливающим дисульфид-ные связи реагентом ДТТ и нагреванием при температуре 96О С все белки денатурируются и расщепляются на отдельные полипептидные цепи. Известно, что молекулы ге-магглютинина вируса гриппа имеют молекулярную массу 70.. .80 кДа и состоят из двух субъединиц, соединенных дисульфидными связями. Таким образом, метод вертикального электрофореза в выбранной модификации приводит к разделению молекул гемагглютинина на субъединицы. Указанное обстоятельство подтверждают результаты наших исследований. Для иммуноблот-тинга мы использовали положительный и отрицательный тест-контроли из коммерческого диагностического набора «AniGen H5 AIV Ag ELISA» (фирмы «Ani-
Ретроспективная иммуноферментная диагностика гриппа птиц H5N1
mal Genetics, Inc», Южная Корея), а также испытуемые пробы от серопозитивных кур. Сыворотки крови кур были получены из районов Шахринав и Рашт Республики Таджикистан, где домашнюю птицу не вакцинировали против гриппа. В качестве дополнительного контроля применили моноклональные антитела против гемагглютинина Н5 вируса гриппа птиц из коммерческого набора «AniGen H5 AIV Ag ELISA» (фирмы «Animal Genetics, Inc», Южная Корея). Результаты показали, что исследуемые сыворотки, положительная контрольная сыворотка и специфические моноклональные антитела взаимодействуют с вирусным гликопротеином с молекулярной массой примерно 35 кДа, что соответствует молекулярной массе субъединицы гемагглюти-нина вируса гриппа (рис. 3).
Библиография
1. Махмадшоев М.М., Тошматов Н. Сайдарова М.М. Пособие для ветеринарных специалистов для борьбы с птичьим гриппом. — Душанбе.: Служба государственного ветеринарного надзора Министерства сельского хозяйства и охраны природы Республики Таджикистан при поддержке представительства ЮНИСЕФ, 2007.
2. Сайдарова М.М., Амирбеков М., Юров Г.К., Алексеенкова С.В., Аноятбеков М., Юров К.П. Иммунологический мониторинг гриппа птиц на территории Республики Таджикистан // Иммунология, 2009; 5: 309—312.
3. Салимов Т.М., Фатхудинова М.Ф., Тиллоев Т. Обзор: грипп птиц в Таджикистане. В кн. «Грипп человека, животных и птиц в Таджикистане». — Душанбе.: Душанбе, 2008.
4. Юров Г.К., Народицкий Б.С., Ганиев А. Межмолекулярные дисульфидные связи поверхностных полипептидов вируса ин-
Выводы
Обнаружение антител к типоспецифическому антигену нуклеопротеина вируса гриппа А птиц посредством ИФА и к поверхностным гликопротеинам вируса гриппа птиц Н5№ посредством ИФА и иммуноблоттинга указывает, что домашняя птица (куры) на территории Республики Таджикистан (район Шахринав) имела контакт с вирусом гриппа птиц Н5№. Наличие у домашней птицы специфических иммуноглобулинов к высокопатогенному вирусу НР5№ при отсутствии манифестной формы инфекции, очевидно, объясняется циркуляцией авирулентных штаммов возбудителя. Совпадающие результаты исследования при использовании трех отдельных методов регистрации иммунного ответа у птиц на типо- и субтипоспецифические антигены вируса гриппа птиц Н5№ свидетельствуют о достоверности полученных данных.
фекционного ларинготрахеита кур. // Вопросы вирусологии, 1993; 4: 174—176.
5. Burnette W.N. Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A // Anal Biochem, 1981; 112 (2): 195— 203.
6. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature, 1970; 227 (5259): 680—685.
7. Lipatov A.S., Krauss S., Guan Y., Peiris M., Rehg J.E., Perez D.R., Webster R.G. Neurovirulence in Mice of H5N1 Influenza Virus Genotypes Isolated from Hong Kong Poultry in 2001 // Journal of Virology, 2003; 77 (6): 3816—3823.
Summary
G.K. Yurov, M.M. Saidarova, S.V. Alexeyenkova, M. Amirbekov, K.P. Yurov. Retrospective diagnostic of avian influenza H5N1 by ELISA. In this article the methods of diagnostic of avian influenza H5N1 by ELISA and Western blotting were described.
БИОТЕХНИКА РАЗМНОЖЕНИЯ
УДК 636.32/38.082Ы
Сравнительная характеристика различных способов криоконсервации спермы козла
П.В. Аксенова, ГНУ «<Ставропольский НИИ животноводства и кормопроизводства» РАСХН
Ключевые слова: акросома, гранулы, козлы-производители, криоконсервация, пайеты, спермопродукция
Введение
После разработки и широкого внедрения в производство метода искусственного осеменения сельско-
хозяйственных животных возможности влияния на селекционный процесс коренным образом изменились. Благодаря массовому применению искусственного осеменения в период 30—70-х гг. прошлого столетия значительно повысилась продуктивность домашних животных всех видов [3, 4]. В условиях новых
