CC BY
80
удк 619.616-079:616.9 Сравнительная оценка ИФА
для ретроспективной диагностики
гриппа лошадей
В.В. Иванов, Г.К. Юров, C.B. Алексеенкова, К.П. Юров, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ)» РАСХН
Ключевые слова: антитела, ИФА, грипп лошадей, ОРГ, РТГА, НЗЫ8, Н7М7
Сокращения: ВГЛ — вирус гриппа лошадей, ГАЕ — гемагглютинирующая единица, ИФА — иммунофермент-ный анализ, МЭБ — Международное эпизоотическое бюро, ОП — оптическая плотность, ОРГ — одиночный радиальный гемолиз, РГА — реакция гемагглютинации, РТГА — реакция торможения гемагглютинации
Введение
Грипп лошадей возникает в различных странах в виде эпизоотий и реже панзоотий. Известны два подтипа возбудителя: вирус гриппа А/лошадь1 (117X7) и вирус гриппа А/ло-шадь2 (НЗЫ8) [2,3].
Вирус 1-го подтипа (прототипный штамм А/лошадь1/ Прага/56) был впервые изолирован в середине 50-х годов прошлого века. Считается, что в настоящее время этот вирус выпал из активной циркуляции. В связи с этим группа экспертов МЭБ рекомендовала не использовать штаммы вируса А/лошадь1 (П7М7) в производстве вакцин. Однако нельзя полностью исключить возможности возвращения этого возбудителя в активную циркуляцию. Очевидно, учитывая это обстоятельство, известные производители вакцин по-прежнему включают вирус гриппа лошадей А/лошадь1 (Н7Х7) в состав противогриппозных коммерческих препаратов.
Вирус гриппа 2-го подтипа (НЗХ8) периодически продолжает распространяться в популяции лошадей на территории большинства стран мира и наносит существенный экономический ущерб спортивному и племенному коневодству [4, 6|. Для ретроспективной диагностики гриппа лошадей МЭБ рекомендует РТГА и ОРГ |7|. Последний предпочтителен для оценки напряженности поствакцинального иммунитета. Несмотря на высокую специфичность и стабильность получаемых в РТГА и ОРГ результатов, нельзя считать эти гесты полностью удовлетворительными. Существенным недостатком представленных методов является: возможное подавление агглютинации эритроцитов неспецифическими ингибиторами, что имитирует ложноположительные результаты РТГА; вариабельность эритроцитов; колебания активности комплемента; возможные погрешности при визуальном учете реакции и др.
Перспективным методом иммунологической диагностики гриппа лошадей, по нашему мнению, является ИФА.
Цель исследования
Цель исследования — сравнить перечисленные реакции, используя пробы сыворотки крови от переболевших (в период вспышки гриппа), вакцинированных, а также здоровых невакцинированных лошадей.
Материалы и методы
Вирусы. В работе использовали штаммы 1-го и 2-го серо-типов вируса гриппа лошадей: А/лошадь1/Прага/56 (117X7)
и А/лошадь2/Францня/98 (НЗХ8) из музея отдела вирусологии ВИЭВ. Для размножения вирусов использовали 9... 10-суточные куриные эмбрионы СПФ («УАГО-ЯРР», Германия). Накопление вирусов контролировали в РГА с 1% взвеси куриных эритроцитов.
Сыворотки. Для исследования использовали три группы сывороток:
9 проб сыворотки крови, полученных в неблагополучном по гриппу очаге (2007 г.) от переболевших лошадей. Лошади, иммунизированные согласно рекомендациям изготовителя вакциной «Эквилис Эквенза» («Интервет»), заболели после участия в конноспортивных соревнованиях с характерной для гриппа симптоматикой, на основании чего был поставлен предварительный клинический диагноз, затем подтвержденный лабораторными исследованиями (К.П. Юров, неопубликованные данные);
60 проб сыворотки крови лошадей, иммунизированных «Поливалентной инактивированной вакциной против гриппа лошадей» (ФГУП «Курская биофабрика»);
15 проб сыворотки крови клинически здоровых лошадей, не вакцинированных против гриппа.
РТГА. Перед постановкой реакции все пробы сыворотки инактивировали на водяной бане при температуре 56 °С в течение 30 мин. Кроме того, все испытуемые сыворотки дополнительно обрабатывали перйодатом калия для освобождения от термостабильных ингибиторов. Далее готовили серии двукратных разведений исследуемых проб сывороток. После этого к 0,025 мл каждого разведения добавляли 0,025 мл суспензии антигена, содержащей 4 ГАЕ. Смесь оставляли на 40 мин, после чего добавляли 0,05 мл 1%-й суспензии эритроцитов кур. Результаты учитывали после полного оседания эритроцитов в контроле (0,05 мл физиологического раствора + 0,05 мл 1%-й суспензии эритроцитов). За титр антител исследуемой сыворотки принимали наибольшее ее разведение, при котором наблюдали полную задержку гемагглютинации.
ОРГ. Для исследования испытуемых сывороток получали кровь барана в растворе Альсивера, эритроциты отделяли путем трехкратного низкоскоростного центрифугирования в фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7,2...7,4). В качестве антигенов вирусов гриппа лошадей применяли штаммы вируса гриппа лошадей 1-го и 2-го подтипов в виде вируссо-держащей аллантоисной жидкости. Готовили взвесь эритроцитов и вируса, в которую вносили раствор СгС13, после этого смешивали с комплементом и 1%-м гелем агара (низкоплавкий сорт). При этом температура расплавленного агара не превышала 42 °С. Смесь разливали равномерным слоем в чашки Петри и оставляли на ночь при 4 °С. Затем в застывшем агаре делали отверстия диаметром 3 мм на расстоянии друг от друга 12 мм. Каждую пробу исследуемой сыворотки вносили в объеме 10 мкл. Реакцию учитывали через 24 ч. Для этого измеряли диаметр зон и вычисляли их площадь. Определяли среднее значение зон гемолиза по каждой группе испытуемых проб сывороток для построения графика.
ИФА. Применяли методику, описанную нами ранее [1, 5]. Пробы исследовали начиная с разведения 1:100 с двойным повтором. Титр специфических антител определяли по ОП. Результаты ИФА по трем группам лошадей (переболевшие, вакцинированные и невакцинированные) сравнивали с данными РТГА и ОРГ.
Результаты и обсуждение
В ИФА антитела выявляли в диагностических титрах к вирусу гриппа обоих подтипов у животных первых двух групп (рис. 1). Титры антител ко 2-му подтипу ВГЛ (НЗЫ8) в пробах сыворотки переболевших животных находились в интервале от 1:1600 до 1:12 800, в пробах сыворотки вакцинированных животных — от 1:400 до 1:1600, а во всех отрицательных пробах от невакцинированных лошадей не превышали 1:100. Средний титр антител в группе положительных проб превышает значение титра группы отрицательных (невакцинированных) проб сыворотки более чем в 4 раза.
Наличие антител к 1-му подтипу ВГЛ (117К7) в группе № 1 обусловлено прививкой им вакцины «Эквилис Эквенза» и, следовательно, отражает уровень гуморального ответа на вакцину. Высокий уровень антител к вирусу НЗЫ8, который отмечается у лошадей первой группы, следует рассматривать как иммунную реакцию на инфекцию нолевым вирусом, что соответствует выраженной клинической картине заболевания лошадей этой группы гриппом, подтвержденной положительными результатами лабораторного исследования.
1,4 1,2 1
се
Q)
5 0,8
0,6 0,4 0,2 0
.¿d
□ H7N7
□ H3N8
Переболевшие
Вакцинированные
Невакцинированные
2560 2240 | 1920 | 1600 « 1280 I" 960 Н 640 320 0
.Л
□ H7N7
□ H3N8
Переболевшие
Вакцинированные
Невакцинированные
Рис. 2. Антитела к гемагглютинину вирусов гриппа лошадей (Н7М7) и (НЗЫ8)
На следующем этапе определяли специфические антитела к вирусу гриппа лошадей 1-го и 2-го подтипов методом ОРГ (рис. 3). Для этого использовали неразведенные сыворотки, прогретые на водяной бане.
Результаты, полученные в этом опыте, коррелируют с данными ИФА и РТГА. Вместе с тем данные ОРГ, очевидно, более показательны для характеристики гуморального ответа на прививку вакцины.
Выводы
Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать вывод, что ИФА является альтернативой РТГА и ОРГ, которые рекомендованы МЭБ. Данный метод исключает действие факторов, отрицательно влияющих на результаты анализа, характеризуется высокой специфичностью. По своей чувствительности ИФА превосходит два других теста (РТГА и ОРГ). Метод характеризуется высокой воспроизводимостью, позволяет проводить автоматический учет реакции и, следовательно, обеспечивает получение объективных результатов. Вследствие этих причин метод предпочтителен при массовых мониторинговых исследованиях на грипп лошадей.
Рис.1. Результаты исследования проб сыворотки крови лошадей на наличие антител к вирусу гриппа лошадей 1-го (Н7Ы7) и 2-го (НЗЫ8) подтипов в ИФА (разведение сыворотки 1: 100)
Результаты титрования тех же проб в РТГА, в общем, повторяют результаты ИФА. Следует отметить высокий титр антител к вирусу 2-го подтипа у животных первой группы — среднее значение 1:2048 (в диапазоне 1:512...1:4096). Указанное свидетельствует о заболевании их гриппом и, следовательно, неэффективной вакцинации. Антигемагглютинины к вирусу 2-го подтипа в пробах сыворотки, полученных от вакцинированных животных второй группы, выявляли в пределах от 1:32 до 1:128. Достоверность результатов подтверждается, в частности, данными, полученными по третьей группе невакцинированных лошадей.
Титры антител, специфичных 1-му подтипу ВГЛ, колеблются в пробах сыворотки, полученных от переболевших животных, в пределах от 1:16 до 1:128; в пробах сыворотки, полученных от вакцинированных животных, в пределах от 1:8 до 1:256.
В пробах сыворотки, полученных от невакцинированных лошадей антитела к подтипам 1 и 2 ВГЛ не выявлены. Средние титры антигемагглютининов в исследуемых пробах сыворотки приведены на рисунке 2.
аз
m
с
о
X
о m _о
о с С
200 s
180 /
160
140 /
120 /
100
80
60
40 у
20 0J
□ H7N7
□ H3N8
Переболевшие
Вакцинированные
Невакцинированные
Рис. 3. Результаты, полученные методом ОРГ
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Иванов В.В., Юдин В.И., Юров Г.К., Алексеенкова C.B., Юров К.П. Разработка набора для выявления антител к вирусу гриппа лошадей иммунофер-ментным методом. // Материалы международной конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». —М.: ВНИТИБП, 2009; 18—20.
2. Самуйленко А.Я.. Соловьев Б.Н.. Непоклонов Е.А., Воронин Е.С. Инфекционная патология животных. — М.: Академкнига, 2006.
3. Сюрин B.H., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.Н., Фомина H.B. Вирусные болезни животных. — М.: ВНИТИБП, 1998.
4. Юров К.П. Инфекционные болезни лошадей.— М.: ГРААЛЬ, 2000.
5. Юров Г.К., Иванов В.В., Алексеенкова C.B., Сайдарова М.М., Юров К.П. Иммуноферментный анализ в диагностике гриппа лошадей // Материалы 10-го Международного конгресса Всемирной конской ветеринарной ассоциации. —М.,2008: 696.
РВЖСХЖ. №4-2009
23
6. Bryant N.A., Rash A.S., Russell C.A., Ross J., Cooke A., Bowman S., MacRae S., European and North American equine influenza vims strains (H3N8) isolated Lewis N.S., Paillot R„ Zanoni R„ Meier H„ Griffiths L.A., Daly J.M., Tiwari A., from 2006 to 2007. // Vet Microbiol., 2009: Jul 2;138(1-2):41—52. Chambers T.M., Newton J.R., Elton D.M. Antigenic and genetic variations in 7. OIE Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals., 2009. — Vol.1.
SUMMARY
V.V. Ivanov, G.K. Yurov, S.V. Alexeenkova, K.P. Yurov. Comparison of ELISA and others serological methods to diagnose on equine influenza. ELISA is alternative test to HI and SRH. Using of the method allows to exclude negative factors. Sensitivity of ELISA is more than HI and SPH. The method is characterized by high reproducibility, allows to carry out the automatic reaction measurement and so provides the objective results. Owing to these reasons ELISA is preferable at routine tests on equine influenza.
удк 636 1 082 3 6 2 2 Изучение биохимического
полиморфизма крови лошадей карачаевской породы и местных тувинских
Л.В. Ольховская, С.В. Криворучко, М.И. Целовальникова, ГНУ «Ставропольский НИИ животноводства и кормопроизводства Российской академии сельскохозяйственных наук» (ГНУ СНИИЖК РАСХН)
Ключевые слова: аллелофонд, генетика популяций, генетический полиморфизм, иммуногенетика, породы лошадей
Сокращения: А1 — альбумин, Ар — щелочная фофо-таза, Еэ — карбоксилэстераза, НЬ — гемоглобин, Tf — трансфераза
Введение
Локальные, аборигенные, сравнительно мало распространенные породы хотя и характеризуются относительно пониженной продуктивностью, но, как правило, имеют лучшую резистентность, крепость конституции, большую длительность продуктивной жизни; они нетребовательны к условиям содержания, являясь, таким образом, носителями резерва ценных наследственных качеств и комбинаций генов.
Как лошади карачаевской породы, известной с XIV века и широко распространенной в условиях высокогорья Северного Кавказа, так и местные тувинские лошади отличаются необыкновенной выносливостью, высокой работоспособностью, крепким копытным рогом, мягким и производительным шагом, что позволяет им пробираться по горным тропам, недоступным для других лошадей.
До настоящего времени нет данных об особенностях генофонда и генетической структуры, не установлен иммуногене-тический статус этих лошадей. Сравнительное изучение им-муногенетических характеристик крови таких однотипных популяций животных необходимо, т. к. важно получить объективную информацию об их генетическом состоянии и потенциале. Каждое стадо животных имеет присущую только ему генофондную структуру, которая может отличаться от других популяций даже в пределах одной и той же породы.
Существует достаточно много методических подходов, практических приемов, направленных на совершенствование существующих, создание новых пород высокопродуктивных животных. Но полная гарантия получения ожидаемого результата возможна только при использовании методов системы иммуногенетического мониторинга.
Полиморфные системы белков, ферментов благодаря закономерностям кодоминантного наследования, неизменяемости в течение всей постэмбриональной жизни животного представляют генетическую модель, по которой удобно изучать генетическую структуру (аллелофонд), а также следить за изменениями, происходящими в процессе селекции, под-
тверждать достоверность происхождения племенного молодняка, выявлять генетические маркерные аллели, сопряженные с продуктивностью. Видоизменения в процессе селекции отражаются прежде всего на генетической структуре как породы, популяции, так и отдельных животных.
Цель исследования
Изучить иммуногенетические характеристики крови лошадей карачаевской породы и местных тувинских.
Материалы и методы
Аллелофонд популяций лошадей изучали (с участием специалистов Тывинского государственного университета [3]) по полиморфизму шести систем белков и ферментов крови в лаборатории иммуногенетики, биохимии и общей химии ГНУ СНИИЖК. Отобрали животных карачаевской породы из ООО «Племрепродуктор «Тай» с. Коф-Джюс в условиях высокогорья (п=91) и КФХ «Сатурн» с. Учкекен — 700 м над уровнем моря (п=194) Карачаево-Черкесской Республики, а также местных лошадей Республики Тыва (п=50).
Типы белков и ферментов крови лошадей идентифицировали по методу горизонтального электрофореза в крахмальном геле согласно методическим указаниям и рекомендациям ВНИИК 11] и ГНУ СНИИЖК |2] в нашей модификации, генетико-статистические расчеты — Л.В. Ольховская, В.В. Абонеев [4].
Для изученной популяции лошадей карачаевской породы ООО «Племрепродуктор «Тай» характерна высокая концентрация атлелей А локуса гемоглобина, В — сывороточной арил-эстеразы, Р — карбоксилэстеразы и А — альбумина и (0,725; 0,852; 0,401 и 0,544, соответственно), низкая — аллелей М и О локуса трансферрина (0,016 и 0.055). Локус щелочной фосфа-тазы оказатся мономорфным (частота аллеля В равна 1,000), аллели А и С не выявлены в данном локусе (табл.).
Наиболее часто встречаются в популяции лошади — носители фенотипов О Я, ГН, Г К локуса трансферрина (30,8; 13,2 и 23,1 %, соответственно), РС, РН, Н — карбоксилэстеразы (15,4; 17,6 и 34.1 %, соответственно), АВ — гемоглобина и альбумина (54,9 и 60,4 %, соответственно), ВВ — сывороточной арилэстеразы (70,3 %), значительно реже, до полного отсутствия, — носители фенотипов ЭО, Е)М, 1-Т, НН, НМ, НО, ММ, МО, МЛ, ОО, 011, ЯИ. локуса трансферрина (0...2,2 %), НН, Н1, II - карбоксилэстеразы (по 2,2 %), ВВ -гемоглобина и НН — сывороточной арилэстеразы (0 %).
