CC BY
22
УДК 619:615.371
Ключевые слова: реассортантный холодоадаптированный штамм, грипп лошадей, безвредность, иммуногенность
Key words: reassortant cold-adapted strain, equine influenza, safety, immunogenicity
Табынов К. К., Кыдырбаев Ж. К., Сансызбай А .Р., Рыскельдинова Ш. Ж., Асанжанова Н. Н., Кожамкулов Е. М., Инкарбеков Д. А.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ БЕЗВРЕДНОСТИ И ИММУНОГЕННОСТИ ХОЛОДОАДАПТИРОВАННОГО РЕАССОРТАНТНОГО ШТАММА А/НК/ОТАР/6:2/2010 ВИРУСА ГРИППА НА ЛОШАДЯХ
EXPERIMENTAL STUDY OF THE SAFETY AND IMMUNOGENICITY OF COLD-ADAPTED REASSORTANT STRAIN A/HK/OTAR/6:2/2010 OF INFLUENZA VIRUS IN HORSES
РГП Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности (НИИПББ) КН МОН РК Адрес: 080409, Республика Казахстан, Жамбылская область, Кордайский район, пгт. Гвардейский
RGE Research Institute for Biological Safety Problems (RIBSP) SC ME&S RK Address: 080409, Republic of Kazakhstan, Zhambylskaya oblast, Kordaiskiy region, pgt. Gvardeiskiy
Табынов Кайсар Казыбаевич, к. в. н., зав. лабораторией / Tabynov Kaissar K., Ph.D., Laboratory Chief Кыдырбаев Жайлаубай, к. в. н., доцент, вед. научн. сотрудник Kydyrbayev Zhailaubai, Ph.D., Associate Professor, Leading Researcher Сансызбай Абылай Рысбайулы, д. в. н., проф., академик КАСХН, ген. директор Sansyzbay Abylai R., Doctor of Veterinary Medicine, Professor, Academician of the Kazakhstan Academy of Agricultural Sciences, General Director Рыскельдинова Шолпан Жанбырбаевна, ст. научн. сотрудник / Ryskeldinova Sholpan Zh., Senior Researcher Асанжанова Нурика Нарынбековна, к. м. н., ст. научн. сотрудник / Assanzhanova Nurika N., Ph.D., Senior Researcher Кожамкулов Еркен Муратханович, научн. сотрудник / Kozhamkulov Yerken M., Researcher Инкарбеков Дулат Амангельдиевич, мл. научн. сотрудник / Inkarbekov Dulat A., Junior Researcher
Аннотация. В настоящей работе представлены результаты экспериментального изучения безвредности и им-муногенности реассортантного холодоадаптированного штамма А/НК/Отар/6:2/2010 вируса гриппа, полученного методом классической генетики из штаммов: донора аттенуации А/Гонконг/1/68/162/35 (ffiN2) и эпизоотически актуального вируса А/лошадь/Отар/764/07 (ffiN8). Установлено, что реассортантный вирус безвреден и иммуногенен для жеребят годовалого возраста при интраназальном инфицировании в дозе 2 х 8,0 lg EID50/ животное (по 1 мл в каждую ноздрю). Жеребята, привитые реассортантным холодоадаптированным штаммом А/НК/0тар/6:2/2010, при контрольном заражении эпизоотическим штаммом А/лошадь/0тар/764/07 (Н3Ш) вируса гриппа лошадей интраназальным способом в дозе 8,0 lg ЭИД50/мл (в каждую ноздрю) в 100 % случаев проявляли устойчивость к гриппозной инфекции и не выделяли вирус в окружающую среду.
Summary. The given paper presents results of experimental study of the safety and immunogenicity of influenza virus's reassortant cold-adapted strain A/NK/ûtar/6:2/2010, obtained by the method of classical genetics of strains: attenuation donor A/Hong Kong/1/68/162/35(Н3N2) and epizootic actual virus A/horse/Otar/764/07(Н3N8). It was established, that reassortant virus is safety and immunogenic for foals one year of age in intranasal infection in a dose of 2 x 8,0 lg EID/ animal (1 ml in each nostril). Foals, vaccinated with reassortant cold-adapted strain A/NK/ûtar/6:2/2010, after reference intranasally infection with equine influenza virus's epizootic strain A/horse/Otar/764/07(Н3N8) in a dose of 8.0 lg EID / ml (in each nostril) showed resistance to influenza infection and didn't excrete a virus in the environment.
Введение
Вирус гриппа лошадей (ВГЛ) является ведущей причиной болезней органов дыхания у лошадей. Различают два субтипа ВГЛ: суб-тип 1 - Н7Ы7 и субтип 2 - Н3Ш. Несмотря на то, что ВГЛ субтипа Н7Ы7 в последние годы не регистрируется, ВГЛ субтипа Н3Ш на сегодня является серьезной угрозой здоровью лошадей и экономической проблемой для всего коневодства [1].
Основным звеном в системе противоэпи-зоотических мер при гриппе лошадей является специфическая профилактика инфекции. При этом стратегия вакцинации в настоящее время сводится к применению инактивиро-ванных и живых вакцин.
Начиная с 1960-х годов, после ряда успешных полевых испытаний в ветеринарную практику были широко внедрены инак-тивированные вакцины, содержащие целые
вирусные частицы или их субъединицы. Главные преимущества этих вакцин заключаются в безвредности, отсутствии вирусной репликации и возможности распространения вируса среди поголовья привитых лошадей. Основными недостатками инактивирован-ных вакцин являются их слабая иммуно-генность, обусловленная формированием исключительно гуморального иммунитета, а также непродолжительный иммунитет, нуждающийся в многократном введении препарата [7]. Некоторые инактивирован-ные вакцины с масляными адъювантами к тому же обладают высокой реактогенностью у привитых животных, вызывая воспалительные реакции на месте введения препарата [10].
Указанные недостатки инактивирован-ных вакцин побудили многих исследователей приступить к поиску наиболее эффективных вакцинных препаратов против этой опасной инфекции. Исследованиями НаппаП D. et а1. [4] показано, что иммунный ответ, вызванный экспериментальной инфекцией с вирусом гриппа, сохраняется и защищает лошадей от заболевания в течение одного года. Авторами отмечено, что вакцины, имитирующие инфекционный процесс, являются более эффективными по сравнению с инактивированными препаратами. И по этой причине за последние 20 лет разработка живых аттенуированных и векторных вакцин являлась главным подходом в создании эффективных препаратов против гриппа лошадей.
Среди разработанных живых аттенуи-рованных вакцин особое место занимают препараты, приготовленные на основе холо-доадаптириванных штаммов. В естественных условиях холодоадаптированные штаммы вируса гриппа лошадей эффективно репродуцируются в верхних дыхательных путях, где они вызывают местные и системные иммунные ответы. Наиболее значимое преимущество этого штамма заключается в том, что он неспособен размножаться при высоких температурах нижних дыхательных путей, где репликация дикого вируса обычно сопровождается развитием бронхита, пневмонии и отека легких [5].
Описанный подход в создании живой вакцины против гриппа лошадей из холодоадап-тированного штамма с успехом применен в странах Северной Америки. С 1999 года в Северной Америке лицензирована и широко применяется живая холодоадаптированная модифицированная вакцина (Flu Avert™ I.N., Intervet), вводимая интраназально. В своем составе вакцина содержит штамм Кентукки/91 H3N8 североамериканского происхождения, но вакцина также может вызывать защиту от европейского штамма H3N8. Несмотря на то, что вакцина Flu Avert™ I.N. не стимулирует высокий уровень гуморального ответа, однократное введение этой вакцины вызывает более продолжительную защиту от инфекции (12 месяцев), чем инактивированные вакцины. Наиболее значимым преимуществом этой вакцины является то, что она формирует иммунный ответ, сходный с таковым при естественной инфекции [3, 9].
В Казахстане, также как и в странах Северной Америки, для специфической профилактики гриппа лошадей в рамках Научно-технической программы «Грипп лошадей: эпизоотологический мониторинг, разработка средств специфической профилактики и диагностики» на 2010-2012 годы разрабатывается живая вакцина на основе реассортантного холодоадаптированного штамма А/НК/0тар/6:2/2010 со структурой генома 6 : 2 (6 генов от донора и 2 гена от актуального вируса), полученного методом классической генетики из штаммов: донора аттенуации А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) и эпизоотически актуального вируса А/ло-шадь/0тар/764/07(Н3Ш). Исходя из этого, целью настоящих исследований было экспериментальное подтверждение безвредности и иммуногенности полученного в НИИПББ реассортантного холодоадаптированного штамма А/НК/0тар/6:2/2010 на лошадях.
Материалы и методы
Определение безвредности вируса
Для определения безвредности лошадям (n=4) годовалого возраста и серонегатив-ных к вирусу гриппа субтипа Н3 (титр антител в РТГА ниже чем 1:16) интраназально
с помощью шприца-распылителя вводили аллантоисную вируссодержащую суспензию штамма А/НК/Отар/6:2/2010 в дозе 2 х 8,0 ^ ЭИД50/животное (по 1 мл в каждую ноздрю). Лошадям из группы негативного контроля (п=4) аналогичным образом вводили стерильный физиологический раствор.
Наблюдение за общим клиническим состоянием животных опытной и контрольной групп вели в течение 4 недель. При этом клиническое состояние здоровья животных оценивали по бальной системе по следующим параметрам.
Общее состояние: общее состояние в норме (0); недуг / депрессия / нормальный аппетит (1); недуг / депрессия / понижение аппетита (2); обезвоживание (2); истощение (4); неспособность стоять (30); на грани смерти (50) и гибель (100).
Наблюдение за дыханием: учащенное дыхание (2); одышка (4); кашель: 2-5 раза в 10 минут (1); 6-20 раз в 10 минут (2); больше чем 20 раз в 10 минут (3).
Наблюдение за состоянием глаз: слезотечение (1); умеренное слизисто-гнойное выделение (2); сильное слизисто-гнойное выделение (4); умеренный конъюнктивит (2); сильный конъюнктивит (4).
Наблюдение за состоянием носа: выделение серозной слизи из носа (1); умеренное слизисто-гнойное выделение из носа (2); сильное слизисто-гнойное выделение из носа (4); чихание 2-5 раз в 10 минут (1); 6-20 раз в 10 минут (2); больше чем 20 раз в 10 минут (3).
Ректальная температура: диапазон температуры между 38,5 и 39,0 °С (1); между 39,1 и 39,5 °С (2) и между 39,6 и 40,0 °С (3).
Ввиду того,что испытуемый штамм вируса будет использован для разработки живой вакцины, провели исследования по определению степени выделения вируса у инфицированных животных в окружающую среду через верхние дыхательные пути. Для этого у лошадей опытной и контрольной групп на 3, 7, 14 сутки после введения вакцины и физиологического раствора, соответственно, брали пробы носоглоточных смывов в пробирки с 1 мл транспортной вирусной среды (стерильный раствор телячьего инфу-
зионного бульона, фракция V бычьего альбумина, гентамицина сульфата и нистатина). Отобранные смывы закладывали на низкотемпературное хранение при минус 70 °С для последующего титрования на 10-суточных куриных эмбрионах. Специфичность вируса, выделенного из носоглоточных смывов, определяли с помощью коммерческой экспресс тест-системы Directigen Flu A (Becton-Dickinson, США).
Определение иммуногенности и про-тективности вируса
Для определения иммуногенности и про-тективности штамма А/НК/0тар/6:2/2010 у лошадей (опытная и контрольная группы), находящихся в опыте по оценке безвредности, на 7, 14 и 28 сутки после инфицирования (п. и.) брали образцы крови для определения уровня накопления сывороточных антител в РТГА. РТГА ставили по общепринятой методике с использованием 1%-й взвеси эритроцитов петуха.
На 28 сутки п. и. лошадей опытной (n=4) и контрольной (n=4) групп подвергли контрольному заражению эпизоотическим штаммом А/лошадь/Отар/764/07 (H3N8) вируса гриппа интраназальным способом с помощью шприца-распылителя в дозе 8,0 lg ЭИД50/мл (в каждую ноздрю).
За зараженными лошадьми опытной и контрольной групп в течение 28 суток вели клиническое наблюдение с ежедневным измерением температуры тела животных. Клиническое состояние инфицированных животных оценивается по бальной системе, описанной в опыте по определению безвредности вируса.
Для оценки степени репродукции вируса в верхних дыхательных путях у лошадей опытной и контрольной групп на 3, 7, 14 сутки после заражения брали пробы носовых смывов в пробирки с 1 мл транспортной вирусной среды (стерильный раствор телячьего инфу-зионного бульона, фракция V бычьего альбумина, гентамицина сульфата и нистатина) для титрования на 10-суточных куриных эмбрионах. Специфичность вируса, выделенного из носоглоточных смывов, определяли с помощью коммерческой экспресс тест-системы Directigen Flu A (Becton- Dickinson, США).
Статистическая обработка экспериментальных данных
Определяли среднее значение выборки (Х), среднеквадратичную ошибку (т) и доверительный интервал средних значений. Достоверность различий между показателями (р < 0,05) определяли с применением критерия Стьюдента.
Результаты исследований
В первых сериях исследований оценивали безвредность реассортантного холодоадап-тированного штамма А/НК/0тар/6:2/2010 вируса гриппа на лошадях. По результатам проведенных исследований установлено, что испытуемый штамм вируса безвреден для жеребят годовалого возраста при инрана-зальном введении. Общее состояние жеребят
39
-
36 ......................
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 25 11 29
дни поел« инфицирования
< опыт идя группа —в—контрольная группа
Рис. 1. Динамика изменения температуры тела жеребят опытной и контрольной групп, инфицированных реассортантным холодоадаптированным штаммом А/НК/Отар/6:2/2010 вируса гриппа.
дни после инфицирования
■контрольна* группа —■—опытная группа
Рис. 2. Динамика проявления клинических признаков заболевания (по балльной системе) у животных опытной и контрольной групп после контрольного заражения эпизоотическим вирусом А/лошадь/ 0тар/764/07 (Н3Ш).
как опытной, так и контрольной групп в течение 28 суток наблюдения было в пределах нормы, слезотечение, слизисто-гнойное выделение, признаки конъюнктивита или истечение из носа у инфицированных жеребят не наблюдались, температура тела животных была в пределах нормы (рис. 1).
В верхних отделах органов дыхания животных опытной группы (п=4) репродукция реассортантного холодоадаптированного вируса не происходила, так как в носоглоточных смывах инфицированных лошадей на 3, 7 и 14 сутки исследования вирус выделен не был. В носоглоточных смывах животных контрольной группы (п=4), не подвергнутой инфицированию, вирус также не был обнаружен.
При оценке динамики накопления анти-гемагглютинирующих антител к вирусу гриппа лошадей субтипа Н3 у инфицированных животных было установлено, что реас-сортантный холодоадаптированный штамм
Рис. 3. Слизистые выделения из носа лошади (контрольная группа), инфицированной эпизоотическим вирусом А/лошадь/0тар/764/07 (Н3Ш).
«
я
П
ю «
Н
К «
к 5
£ щ
и О
5 В »
о О
5 ^
£ ю
Ч
§ ^
И А
В Ч
ля к
<э Э
В о
Н .14
3 ^
в ^ о
в
.д в н о а в
«
м К В
в
м и Рч
о
и ^
а в а
в
и и Т В н о о
ч в
2
ч
ю «
В
о и о а
и
в
т
К
в в
И «
а
«
2 м г
в в в
ч
А
Н «
е ^ 2
о и о в л Ч о а н в о а
ч
и о в
Общ. сумма о о о о СП а ^
Дни после инфицирования 00 <м о о о о о о О о
<м о о о о о о о о
<м о о о о о о о о
<М о о о о о о о о
<М о о о о о о о о
СП <м о о о о о о о о
<М <М о о о о о о о о
<м о о о о о о о о
о <м о о о о о о о о
о о о о и УО а ю о о
00 о о о о и УО а ЧЙ а ю а ю а
о о о о и ЧЙ СП и УО 'й а 'й а
ю о о о о и УО и УО 'й а и УО а
ич о о о о 0 1П ЧЙ а 'й а и УО а
о о о о и ю ЧЙ а 'й а и УО а
СП о о о о и ■а а А а и а
<М о о о о и ю а ЧЙ а 'й а и УО а
- о о о о и ю а н ю н ю а 13 а
о о о о о о а Чй а ^й а ^Й а
о о о о и ^ а а а
00 о о о о о О а 'й а
о о о о о о а ^й а
ю о о о о и о а и
о о о о а а О
о о о о о а о
СП о о о о а а а
гч о о о о н о а о
- о о о о о о О н
о о о о о о о о О
№ опытной и контрольной лошади Лошадь № 1 (опытная) Лошадь № 2 (опытная) Лошадь № 3 (опытная) Лошадь № 4 (опытная) Лошадь № 5 (контрольная) Лошадь № 6 (контрольная) Лошадь № 7 (контрольная) Лошадь № 8 (контрольная)
^ А/НК/Отар/6:2/2010 вируса
я ® гриппа не формирует детек-
а 5 тируемый уровень антител
о в РТГА на 7, 14 и 28 сутки
я § п. и., то есть не обладает анти-
Н генными свойствами. У жи-
? н
^ " вотных контрольной группы
§ я антитела к вирусу гриппа ло-® я
X ' ■
§ шадей субтипа Н3 в течение
4 а всего срока испытания также <3 <3 не были обнаружены.
№ О
5 ® В дальнейших исследо-0 §
^ я ваниях для подтверждения
я ¡2 протективных свойств ре-
§ <3 ассортантного холодоадап-я 5
со Я
Я Я
я | 0тар/6:2/2010 на 28 сутки пою & сле инфицирования лошадей 'З | опытной (п=4) и контроль-£ ^ ной (п=4) групп подвергли 5 || контрольному заражению
К И
<3 1 эпизоотическим штаммом
я '
п
2§| пература тела животных была
Л 8 £ в пределах нормы (рис. 4).
0 3 ^
* Анализ динамики про-
еЗЕЗсЗ явления клинических при-
Н ^ й
знаков заболевания у инфи-
я || | цированных животных (п=4)
§Я ^ контрольной группы (рис. 2)
^ показал, что признаки забо-
& | ® левания у зараженных живот-
1 « а
ных стали проявляться уже с
я н- ® первых суток (0,25±0,25 бал-
I? л ^ лов) после инфицирования
|| § (п. и.) и достигли своего мак-
Сия симального пика на 11 сутки
тированного штамма А/НК/
А/лошадь/Отар/764/07 (Н3N8)
& ¡н ВГЛ. Результаты исследова-
§ |н ний показаны в таблице 1 и на
¡1 § рисунках 2, 3. я н
<ц я В опытной группе живот-
5 § ных (инфицированных штам-
§ § мом А/НК/Отар/6:2/2010),
^ (з подвергнутых контрольному
К Д
►с заражению эпизоотическим
| о вирусом, в течение всего сро-
^Ьн^ ка наблюдения не отмечались клинические признаки грип-
§ 5 ¡1 позной или какой-либо другой
§я^ инфекции (табл. 1, рис. 2), тем-
Таблица 2.
Титр вируса в носоглоточных смывах лошадей опытной и контрольной групп после контрольного заражения эпизоотическим вирусом А/лошадь/Отар/764/07 (^N8)
Номер опытной и контрольной лошади Титр вируса в носоглоточных смывах лошадей, lg ЭИД50/мл
3 сут.* 7 сут.* 14 сут.
Лошадь № 1 (опытная) - - -
Лошадь № 2 (опытная) - - -
Лошадь № 3 (опытная) - - -
Лошадь № 4 (опытная) - - -
Лошадь № 5 (контрольная) 3,20±0,14 1,78±0,08 -
Лошадь № 6 (контрольная) 1,45±0,0 - -
Лошадь № 7 (контрольная) 1,53±0,08 - -
Лошадь № 8 (контрольная) 2,45±0,14 - -
Примечание: «-» вирус не обнаружен; «*» - Р < 0,005, положительно реагировали в тест-системе Directigen Flu A.
болевания (табл. 1) проявлялись в виде угнетения, снижения или потери аппетита у животных, кашля (2-5 раз в 10 минут), слезотечения и различной степени выделения из носа (рис. 3). Общая сумма баллов при оценке клинических признаков заболевания в опытной группе была в пределах от 37 до 47 балов. Следует отметить, что температура тела животных в контрольной группе (рис. 4) в течение всего срока наблюдения (28 сут.) была в пределах нормы (37,5-38,5 °С), за исключением незначительного увеличения температуры тела животных (38,5±0,07 °С) в пиковой фазе заболевания (11 сутки п. и.).
Анализ репродукции эпизоотического вируса (табл. 2) в верхних органах дыхания животных опытной группы (п=4) показал, что вакцинация лошадей реассортантным холодоадаптированным штаммом А/НК/ 0тар/6:2/2010 полностью предупреждает выделение вируса в окружающую среду через верхние органы дыхания в течение срока испытания (до 14 суток). В то время как у 100 % инфицированных животных контрольной группы на 3 сутки п. и. отмечено выделение вируса в титрах от 1,45±0,0 до 3,2±0,14 ^ ЭИД50/мл. На 7 сутки п. и. выделение вируса было отмечено лишь у одного животного (лошадь № 5) в титре 1,78±0,08 ^ ЭИД50/мл, на 14 сутки п. и. ни у одной лошади выделение вируса через верхние органы дыхания отмечено не было.
При оценке динамики накопления антител к вирусу гриппа лошадей субтипа Н3
Рис. 4. Динамика изменения температуры тела животных опытной и контрольной групп после контрольного заражения эпизоотическим вирусом А/лошадь/0тар/764/07 (Н3Ш).
Рис. 5. Динамика накопления антител у инфицированных животных опытной и контрольной групп в РТГА.
п. и. (4,25±0,25 баллов). Проявление клинических признаков заболевания в контрольной группе животных продолжалось вплоть до 19 суток п. и. (1,0±0,57 баллов). При этом клинические признаки в пиковой фазе за-
у животных контрольной группы (рис. 5) было установлено, что эпизоотический вирус А/лошадь/0тар/764/07 (Н3Ш), также как и реассортантный холодоадаптирован-ный вирус, не обладает достаточно высокими антигенными свойствами, так как у инфицированных животных на 14 сутки п. и. не были обнаружены антитела в РТГА, а на 28 сутки п. и. выявленный титр антител в РТГА (22±6) был чуть выше детектируемого уровня. Напротив, у животных опытной группы, которые предварительно были привиты реассортантным холодоадаптирован-ным штаммом А/НК/0тар/6:2/2010, антитела к вирусу гриппа лошадей субтипа Н3 в РТГА были обнаружены уже на 14 сутки п. и. в титре 24±4,5, а на 28 сутки п. и. достигли титра 48±9.
Обсуждение результатов
Настоящие исследования посвящены экспериментальному изучению безвредности и иммуногенности реассортантного холодоа-даптированного штамма А/НК/0тар/6:2/2010 со структурой генома 6 : 2 (6 генов от донора и 2 гена от актуального вируса), полученного методом классической генетики в НИИПББ из штаммов: донора аттенуации А/Гон-конг/1/68/162/35 (Н3№) и эпизоотического вируса А/лошадь/0тар/764/07(Н3Ш), выделенного на территории Республики Казахстан в 2007 году. Результаты исследований, представленные в настоящей работе, позволят определить принципиальную возможность разработки живой аттенуированной вакцины против гриппа лошадей (А/Н3№) на основе реассортантного холодоадаптиро-ванного штамма А/НК/0тар/6:2/2010.
Предпосылкой для разработки в Казахстане живой аттенуированной вакцины против гриппа лошадей из реассортантного холодо-адаптированного вируса послужили литературные данные [3, 9], свидетельствующие о том, что данный тип вакцины по сравнению с инактивированными (цельновирионные и субъединичные) препаратами обладает высокой степенью иммуногенности и более длительным иммунитетом (не менее 1 года) при однократном применении. Наиболее значимым преимуществом живой аттенуи-
рованной вакцины является то, что она формирует иммунный ответ, сходный с таковым при естественной инфекции. При этом преимущественно развивается клеточный иммунитет. Кроме того, у привитых животных образуются иммуноглобулины класса А или так называемые секреторные антитела, способные нейтрализовать болезнетворный агент в самой ранней стадии развития инфекционного процесса в верхних дыхательных путях. В производственных условиях высокую практическую ценность также представляет удобный способ иммунизации (интраназаль-ный) лошадей, который по сравнению с внутримышечным введением не травматичен и расширяет возможности массовой иммунизации животных в случаях обострения эпизоотической обстановки по данному заболеванию [8].
На фоне перечисленных достоинств живых вакцин некоторыми учеными ставится вопрос о вероятности мутации или реассор-тации вакцинного вируса с другими дикими вирусами с последующим появлением патогенных вариантов возбудителя. 0днако несмотря на это, в настоящее время лицензирована и разрешена к применению живая аттенуированная вакцина (FluMist®) для здравоохранения, в которой использована смесь двух типов вируса (НШ1 и Н3№). Кроме того, многолетний опыт России и Восточноевропейских стран по использованию живых человеческих вакцин против гриппа показал, что применение этих вакцин не способствует появлению новых вирусных реассортантов гриппа. В исследованиях на лошадях установлено, что холодоадаптиро-ванный штамм проявляет фенотипическую стабильность, не вызывает клинических осложнений и не передается при контакте другим животным [3].
Следует отметить, что Казахстан, в лице НИИПББ, в период возникновения и распространения гриппа лошадей в республике в 1992-1995 гг., также как и другие государства мира, разработал собственную технологию изготовления инактивированной цельнови-рионной вакцины против гриппа лошадей. Технология получения вакцины основывалась на использовании широко известных
штаммов А/лошадь 1/Киргизия/74 (НЖ7) и А/лошадь 2/Майами/63 (Н3К8). По разработанной технологии вируссодержащие суспензии производственных штаммов, наработанные в системе куриных эмбрионов, инактивировались формальдегидом, подвергались очистке и концентрированию методами двукратного замораживания-оттаивания и диализа. В качестве иммуностимуляторов вакцина содержала гидроокись алюминия и сапонин. Бустерная вакцинация разработанным препаратом лошадей обеспечивала у них формирование иммунитета продолжительностью 6-12 мес. Но в технологическом аспекте разработанная вакцина имеет ряд свойственных всем инактивированным препаратам недостатки, поэтому, учитывая данные мировой литературы по вакцинам против гриппа лошадей, мы остановились на технологии получения высокоэффективной живой вакцины из реассортантного холодоадаптированного штамма А/0тар/НК/6:2/2010 (Н3Ш).
Согласно требованиям МЭБ [6], предъявляемым к вакцинным препаратам против гриппа лошадей, новые вакцинные штаммы предварительно должны быть испытаны на безвредность и иммуногенность, поэтому целью настоящих исследований являлось изучение безвредности и иммуногенности реассортантного холодоадаптированного штамма А/НК/0тар/6:2/2010 вируса гриппа на лошадях.
Анализ экспериментальных данных позволяет заключить, что реассортантный холодо-адаптированный штамм А/НК/0тар/6:2/2010 безвреден для жеребят годовалого возраста при интраназальном инфицировании в дозе 2 х 8,0 ^ ЭИД50/животное (по 1 мл в каждую ноздрю). В период срока наблюдения (28 суток) клиническое состояние инфицированных животных, оцениваемое по бальной системе, было в переделах нормы, слезотечение, сли-зисто-гнойное выделение, признаки конъюнктивита или истечение из носа у жеребят не наблюдались, температура тела животных была в пределах нормальных значений (рис. 1),репродукция вируса (3, 7, 14 сутки п. и.) в верхних органах дыхания не установлена.
При оценке иммуногенных возможностей вируса на жеребятах установлено, что реас-
сортантный холодоадаптированный штамм А/НК/0тар/6:2/2010 не формирует детектируемый уровень антител в РТГА на 7, 14 и 28 сутки п. и., то есть не обладает достаточными антигенными свойствами. 0днако при контрольном заражении жеребят (опытная группа) эпизоотическим штаммом А/лошадь/ 0тар/764/07 (Н3Ш) ВГЛ они в 100 % случаев проявляли устойчивость к заболеванию, в течение всего срока наблюдения клиническое состояние животных было в переделах нормы (табл. 1, рис. 2), температура тела животных также имела нормальные значения (рис. 4), репродукция вируса (3, 7, 14 сутки п. и.) в верхних органах дыхания установлена не была. При этом в контрольной группе инфицированные жеребята проявляли ярко выраженные клинические признаки гриппозной инфекции (угнетение, снижение или потеря аппетита, кашель, слезотечение и различной степени выделения из носа) с выделением большого количества вируса (от 1,45±0,0 до 3,2±0,14 ^ ЭИД50/мл) в окружающую среду вплоть до 7 суток п. и.
Следует отметить, что температура тела животных в контрольной группе (рис. 4) в течение всего срока наблюдения (28 суток) была в пределах нормы (37,5-38,5 °С), за исключением незначительного увеличения температуры тела животных (38,5±0,07 °С) в пиковой фазе заболевания (11 сутки п. и.), что, по-видимому, связано со штаммо-выми особенностями контрольного вируса, о чем свидетельствуют данные Юрова К. П. [10], согласно которым при доброкачественной форме гриппа повышение температуры тела может регистрироваться лишь у отдельных лошадей. Также следует отметить, что контрольный вирус А/лошадь/0тар/764/07 (Н3№) в опыте на лошадях, также как и реас-сортантный холодоадаптированный штамм А/НК/0тар/6:2/2010, не показал высокие антигенные свойства, о чем свидетельствует накопление низкого титра антител в РТГА на 28 сутки после инфицирования.
Экспериментальные данные, полученные в ходе изучения иммуногенности реассор-тантного холодоадаптированного штамма А/НК/0тар/6:2/2010 на лошадях, согласуются с данными Townsend Н. & е! а1. [9], исследова-
ниями которых впервые на основе аттенуиро-ванного холодоадаптированного дикого штамма Кентукки/91 Н3№ была получена живая вакцина против гриппа лошадей А/Н3№ ^1и AvertTM I.N., Шегуе!), которая при однократном применении у пони формирует у них напряженный иммунитет (преимущественно клеточный), обеспечивающий надежную защиту животных от гриппа в течение 1 года.
Таким образом, экспериментальное изучение безвредности и иммуногенности реас-сортантного холодоадаптированного штамма А/НК/0тар/6:2/2010 на жеребятах годовалого возраста показало, что по изучаемым показателям вирус соответствует требованиям МЭБ, предъявляемым к новым вакцинным штаммам ВГЛ, и в этой связи может быть использован для разработки живой вакцины против гриппа лошадей.
Выводы
1. Реассортантный холодоадаптированный штамм А/НК/0тар/6:2/2010 вируса гриппа безвреден для жеребят годовалого возраста при интраназальном инфицировании в дозе 2 х 8,0 ^ ЭИД50/животное (по 1 мл в каждую ноздрю). В период срока наблюдения (28 суток) клиническое состояние и температура тела животных была в переделах нормы, слезотечение, слизисто-гнойное выделение, признаки конъюнктивита или истечение из носа не наблюдались, репродукция вируса в верхних органах дыхания не установлена.
2. Реассортантный холодоадаптирован-ный штамм А/НК/0тар/6:2/2010 вируса гриппа у инфицированных жеребят не формирует детектируемый уровень антител в РТГА на 7, 14 и 28 сутки после инфицирования.
3. Жеребята годовалого возраста, привитые реассортантным холодоадаптирован-ным штаммом А/НК/0тар/6:2/2010 вируса гриппа, при контрольном заражении эпизоотическим штаммом А/лошадь/0тар/764/07 (Н3Ш) ВГЛ в дозе 8,0 ^ ЭИД50/мл (в каждую ноздрю) в 100 % случаев проявляют устойчивость к гриппозной инфекции. В течение всего срока наблюдения клиническое состояние и температура тела животных была в переделах нормы, репродукция вируса в верхних органах дыхания установлена не была.
4. Контрольная группа жеребят при заражении эпизоотическим штаммом А/лошадь/ 0тар/764/07 (H3N8) ВГЛ в дозе 8,0 lg ЭИД50/ мл (в каждую ноздрю) проявляет ярко выраженные клинические признаки гриппозной инфекции (угнетение, снижение или потеря аппетита, кашель, слезотечение и различной степени выделения из носа) с выделением большого количества вируса (от 1,45±0,0 до 3,2±0,14 lg ЭИД50/мл) в окружающую среду вплоть до 7 суток после инфицирования.
5. По показателям безвредности и им-муногенности на лошадях реассортант-ный холодоадаптированный штамм А/НК/ 0тар/6:2/2010 соответствует требованиям МЭБ, предъявляемым к новым вакцинным штаммам ВГЛ, и в этой связи может быть использован для разработки живой вакцины против гриппа лошадей.
Список литературы
1. Сидорчук, А. А. Инфекционные болезни животных / А. А. Сидорчук, Б. Ф. Бессарабов, Е. С. Воронин и др. - М. : Колос, 2007. - 671 с.
2. Юров, К. П. Инфекционные болезни лошадей / К. П. Юров. - М. : Росагропромиздат, 1991. - 192 с.
3. Chambers, T. M. A new modified live equine influenza virus vaccine: phenotypic stability, restricted spread and efficacy against heterolo-gous virus challenge / T. M. Chambers, R. E. Holland, L. R. Tudor et al. // Equine Vet J. - 2001. - Vol. 33. - № 7. - Р. 630-6.
4. Hannant, D. Duration of circulating antibody and immunity following infection with equine influenza /
D. Hannant, J. A. Mumford, D. M. Jesset // Veterinary Record. - 1988. - Vol. 122. - P. 125-128.
5. Holmes, D. F. Live temperature senseitive equine-2 influenza A virus vaccine : production and efficacy in experimental ponies / D. F. Holmes, L. M. Lamb, L. Coggins, B. R. Murphy, J. H. Gillespie // VI. Proceedings of the Sixth International Conference. Newmarket: R&W Publications Ltd. - 1991. - P. 253-8.
6. OIE. Terrestrial manual equine influenza. - 2008, chapter 2.5.7. - P. 877-881.
7. Paillot, R. Vaccination against equine influenza: Quid novi? / R. Paillot, D. Hannant, J. H. Kydd, J. M. Daly // Vaccine. - 2006. - Vol. 24. - P. 4047-4061.
8. Soboll, G. Mucosal co-administration of cholera toxin and influenza virus hemagglutinin-DNA in ponies generates a local IgA response / G. Soboll, K. M. Nelson,
E. S. Leuthner et al. // Vaccine. - 2003. - Vol. 21. -Р. 3081-3092.
9. Townsend, H. G. Efficacy of a cold-adapted, intranasal, equine influenza vaccine: challenge trials / H. G. Townsend, S. J. Penner, T. C. Watts et al. // Equine Vet J. - 2001. - Vol. 33. - № 7. - Р. 637-43.
10. Wilson, W. D. Equine influenza / W. D. Wilson // Vet Clin North Am Equine Pract. - 1993. - Vol. 9. -№ 2. - Р. 257-82.
