CC BY
35
УДК 578.832.1.083.3
Ключевые слова: вирус гриппа лошадей, реакция гемагглютинации, иммуноферментный анализ, реакция диффузионной преципитации, матричный белок
Key words: Equine influenza virus, hemagglutination reaction, immune-enzyme analysis, diffusion precipitation reaction, matrix protein
Матвеева В. М., Кошеметов Ж. К., Бурабаев А. А., Нурабаев С. Ш.
ПОЛУЧЕНИЕ АНТИСЫВОРОТОК К ВИРУСУ ГРИППА ЛОШАДЕЙ ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ
OBTAINING OF ANTISERUM FOR SERUM DIAGNOSIS AND IDENTIFICATION OF EQUINE INFLUENZA VIRUS AGENT
РГП Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности (НИИПББ) КН МОН РК Адрес: 080409, Республика Казахстан, Жамбылская область, Кордайский район, пгт. Гвардейский
RGE Research Institute for Biological Safety Problems (RIBSP) SC ME&S RK Address: 080409, Republic of Kazakhstan, Zhambylskaya oblast, Kordaiskiy region, pgt. Gvardeiskiy
Матвеева Валентина Михайловна, к. б. н., ст. научн. сотрудник
Matveeva Valentina M., Ph.D., Senior Staff Scientist Кошеметов Жумагали Каукарбаевич, к. б. н., зав. лабораторией «Диагностика и индикация вирусных инфекций» Koshemetov Zhumagali K., Ph.D., Head of the Laboratory "Infectious diseases diagnostics and indication" Бурабаев Асылбек Амирбекович, к. б. н., ст. научн. сотрудник Burabaev AsylbekA., Ph.D., Senior Staff Scientist Нурабаев Сергазы Шуратбаевич, ст. научн. сотрудник Nurabaev Sergazy Sh., Senior Staff Scientist
Аннотация. В настоящей работе представлены результаты по получению активных и специфичных антисывороток к вирусу гриппа лошадей (ВГЛ) на козах и кроликах, пригодных для разработки и производства диагностических тест-систем с целью обнаружения и идентификации выделяемых изолятов вируса гриппа лошадей. В результате проведенных исследований были подобраны оптимальные способы очистки и концентрирования ВГЛ и выделения типоспецифических (NP и М1) белков из очищенных препаратов вируса. С применением этих препаратов разработаны оптимальные схемы получения активных и специфичных антисывороток против данных штаммов вируса гриппа лошадей и его внутренних белков. Приготовленные антисыворотки пригодны для разработки и производства отечественных диагностических тест-систем с целью обнаружения типоспецифического антигена А и идентификации выделенных изолятов вируса гриппа лошадей. Summary. In the given paper the results of obtaining the active and specific antiserum to equine influenza virus suitable for the development and production of diagnostic kits for the detection and identification of equine influenza virus isolates are presented.
In the result of the research the most optimal ways ofpurification and concentration of equine influenza virus and ways of allocation the type specific (NP and M1) proteins from purified virus preparations were chosen. With the use of these preparations optimum layouts for obtaining the active and specific antiserum to the given strains of equine influenza virus and to its internal proteins were developed. Prepared antiserum is suitable for the development and production of domestic diagnostic kits which are useful for the detection of type specific antigen and equine influenza virus isolates.
Введение
Несомненную важность для эпизоотоло-гической службы Казахстана, а также для биологической безопасности страны, наряду с опасными заболеваниями, такими как грипп птиц, ящур, сибирская язва, оспа овец, чума мелких животных, представляют «возвращающиеся» инфекционные заболевания, к которым относится грипп лошадей. Грипп лошадей также относится к группе опасных вирусных болезней животных [5, 9].
Потенциальная опасность гриппа лошадей вызвана тем, что данное заболевание наряду с гриппом птиц может являться источником появления пандемического штамма гриппа человека. Ежедневные тесные контакты человека с лошадью, высокий мутационный потенциал являются условием для совместного смешивания нескольких штаммов вируса гриппа, обмена генетической информацией и возможным появлением пандемического гриппа для человека [2, 7].
Расширяющиеся международные связи способствуют распространению данной инфекции по всему миру. Поэтому предупреждение заноса и распространения возбудителя этой опасной болезни на территории нашей страны является одной из приоритетных задач.
Эпизоотическая ситуация по гриппу лошадей в Казахстане характеризуется как чрезвычайная и свидетельствует о необходимости проведения в стране оперативных мер по локализации и ликвидации болезни. С другой стороны, как показывает печальный опыт других стран, для которых грипп лошадей стал «вновь возникающей» болезнью, в Казахстане инфекция может стать эндемичной, борьбу с которой необходимо вести среди естественно восприимчивых животных.
В общем комплексе мероприятий по предупреждению заноса и ликвидации особо опасных вирусных болезней сельскохозяйственных животных существенная роль принадлежит лабораторной диагностике и идентификации возбудителей заболевания.
Следует отметить, что в Республике Казахстан до настоящего времени не проводились научно-исследовательские работы по разработке диагностических тест-систем при гриппе лошадей.
Целью наших исследований являлось получение активных и специфичных сывороток к вирусу гриппа лошадей, пригодных для серологической диагностики и типирования данного вируса.
Материалы и методы
Вирус. В работе использовали штаммы А/лошадь/Отар/764/07 (Н3Ш) и А/лошадь 1/ Киргизия/74 (Н7К7) ВГЛ. ВГЛ выращивали в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) согласно установленным регламентам [6]. Инфекционная и гемагглютинирующая активность вируса до инактивации составляла не менее 7,0-7,5 ^ ЭИД50 и 1 : 512-1024 соответственно.
Реакция гемагглютинации (РГА). Гемаг-глютинирующую активность вируса определяли в РГА микрометодом по общепринятому методу [6].
РТГА. Реакцию проводили микрометодом в U-образных лунках 96-луночного планшета фирмы "Costar" (США) для иммунологических исследований согласно рекомендациям МЭБ [12]. Титр антител 1 : 16 и выше считали положительным.
Иммуноферментный анализ (ИФА) ставили в непрямом варианте, по отработанным нами условиям.
Реакцию диффузионной преципитации (РДП) ставили по отработанным нами условиям.
Содержание белка определяли по методу Лоури [11], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин (БСА) фирмы "Sigma" (США).
Тест-система Directigen Flu A. Постановку осуществляли согласно наставлению по применению данной тест-системы.
Животные. В качестве доноров противогриппозных антител к ВГЛ служили козы местной породы в возрасте до одного года, вследствие того что использование высокоспецифичных антисывороток, полученных от этих животных, рекомендовано Экспертным комитетом ВОЗ для уверенного антигенного субтипирования НА и NA и идентификации вируса гриппа А, так как они дают минимальные неспецифические реакции [10]. А также кролики местных пород весом 2-2,5кг.
Антиген. Иммунизацию животных проводили очищенными препаратами концентрированного ВГЛ и его внутренних белков по отработанным нами способам. В качестве стимулятора иммуногенеза использовали сапонин и монтанид.
Результаты и обсуждение
Для получения активных и специфичных сывороток к ВГЛ необходимо было отработать методы очистки и концентрирования вируса из вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ). Для выделения и очистки вируса из вируссодержащих суспензий нами были испытаны следующие методы:
- осаждение вируса с помощью ПЭГ-6000 в 7%-й конечной концентрации при рН 8,5 с последующим концентрированием его методом ультрацентрифугирования и осветлением низкоскоростным центрифугированием;
- концентрирование вируса методом ультрацентрифугирования и дальнейшей очисткой в градиенте плотности сахарозы.
В результате проведенных исследований нами были подобраны следующие оптимальные условия очистки данного вируса:
- ВАЖ осветляли центрифугированием при 3000g в течение 10 мин., обрабатывали антибиотиками в дозе 1000-2000 Ед./мл. Из осветленной ВАЖ вирус осаждали с помощью ПЭГ-6000 в 7%-й конечной концентрации при рН 8,5 в течение 24 ч при 4 °С с последующим ультрацентрифугированием при 100000g в течение 1 часа и 5000g в течение 10 минут.
Очищенный вирус представлял собой гомогенный препарат, гемагглютинирую-щая активность его составляла 1 : 102400204800, при исходной активности вируса 1 : 512 - 1 : 1024, а содержание белка -970-1100 мкг/мл.
Для проведения идентификации возбудителя гриппа лошадей по гемагглютинину необходимым условием является наличие штаммоспецифичных диагностических сывороток вируса гриппа лошадей.
Для получения антисывороток к гемаг-глютинину вируса гриппа, по литературным данным, используют в основном крыс [1].
Специфические сыворотки к ВГЛ для РТГА и РДП мы в своих опытах получали на козах местной породы.
Нами была отработана схема гипериммунизации коз, которая состояла из трех введений очищенных препаратов штаммов А/лошадь 1/Киргизия/74 (^N7) и А/лошадь/ 0тар/764/07 (Н3Ш). ВГЛ в возрастающих дозах внутримышечно в область предлопа-точных лимфоузлов с интервалом между введениями в 2 недели в комплексе с сапони-
ном (0,05 %) при втором введении. Оценку активности и специфичности полученных антисывороток проводили в РТГА и РДП.
Результаты проведенных опытов по получению антисывороток к подтипам Н7Ы7 и Н3№ ВГЛ на козах и оценка их активности в серологических тестах представлены в таблице 1. Как видно из результатов этой таблицы, активность антисыворотки к штамму А/лошадь/0тар/764/07 (Н3Ш) ВГЛ составила в РТГА - 1 : 320 и в РДП 1 : 4, а сыворотки к штамму А/лошадь 1/Киргизия/74 (^N7) в РТГА - 1 : 1280 и в РДП 1 : 8. Сыворотки специфичны в РТГА, так как не дают перекрестных реакций с антигенами ВГЛ гете-рологичных подтипов и с вирусом гриппа А подтипов Н1Ш и Н5Ш.
Таким образом, в результате проведенных опытов получены активные иммунные поли-клональные антисыворотки к эпизоотически актуальным для территории Казахстана и республик Средней Азии штаммам А/лошадь/ 0тар/764/07 (Н3Ш) и А/лошадь 1/Кирги-зия/74 (^N7) ВГЛ на козах, пригодные для постановки РТГА и РДП.
Для получения активных и специфичных антисывороток к внутренним структурным белкам ВГЛ были проведены исследования по выделению типоспецифических вирусных белков, нуклеопротеидного (№) и матричного (М), из очищенных препаратов штамма А/лошадь/0тар/764/07 (Н3Ш) ВГЛ.
В результате проведенных исследований отработана следующая схема выделения белка КР из очищенных препаратов ВГЛ:
- вирус обрабатывали ферментом - броме-лайном в течение 24 ч при 37 °С при соотношении вируса и фермента 9 : 1, при этом фермент использовали в концентрации 13 мг/мл. Затем вирус осаждали при 106000 g
Таблица 1.
Оценка активности и специфичности антисывороток, полученных к подтипам ^N7 и ^N8 ВГЛ на козах, в серологических тестах
Наименование антисывороток Активность и специфичность антисывороток в РТГА с антигенами вируса гриппа, подтипов Активность антисывороток в РДП
Н7Ш Н3Ш Н7М Н5М НШ1
к подтипу Н7Ю 1/1280 - 1/160 - - 1/8
к подтипу Н3№ - 1/320 - - - 1/4
в течение 90 мин. и ресуспендировали в 4-кратном объеме 0,05М ФБР (от исходного). Разрушение вируса проводили с помощью твин-эфира. Для этого в суспензию вируса добавляли 0,1 % твина-20 и оставляли на холоду в течение 30 мин., помешивая. Затем смешивали вирус и холодный эфир в соотношении 1 : 1 и выдерживали в течение 2 ч при 4 °С, постоянно встряхивая на шуттель-аппарате. Нижнюю слабоопалесци-рующую водную фазу отделяли и удаляли остатки эфира выветриванием в течение суток при 4 °С, материал осветляли центрифугированием при 2000g. NP осаждали ультрацентрифугированием при 106000 g в течение 90 мин. Очищенный препарат КР исследовали в РГА и ИФА, а также определяли содержание белка по Лоури. Активность в ИФА очищенных препаратов ККР составила 1 : 320 -1 : 640 и содержание белка - 123-155 мкг/мл.
Для выделения белка М1 использовали метод Жирнова О. П. [13], при котором активность очищенных препаратов белка М1 в ИФА составила 1 : 80 - 1 : 160, а содержание белка - 75-91 мкг/мл.
Специфичность очищенных препаратов КР и М белков подтверждали с помощью
тест-системы Directigen Flu A фирмы "Becton Dickinson" (США).
Антисыворотки к NP и М белкам ВГЛ, по литературным данным, получают на кроликах, крысах и мышах [8]. В наших экспериментах для получения сывороток к внутренним белкам ВГЛ использовали коз и кроликов.
Для получения антисывороток в качестве антигена для иммунизации животных использовали очищенные препараты внутренних белков инактивированного ВГЛ.
Схемы получения антисывороток против NP и М белков ВГЛ представлены в таблице 2.
Оценку активности и специфичности полученных антисывороток проводили методами РДП и ИФА. Результаты проведенных опытов по получению антисывороток к ти-поспецифическим внутренним белкам ВГЛ на кроликах и козах и оценка их активности и специфичности в серологических тестах представлены в таблице 3.
Как видно из результатов таблицы 3, кроличьи и козьи антисыворотки, полученные к внутренним белкам ВГЛ, были активны в РДП до разведения 1 : 4 - 1 : 8
Таблица 2.
Схемы получения специфических антисывороток против NP и М белков ВГЛ
на разных видах животных
№ схемы Вид животного Способ введения Концентрация белка в мкг/см3 Интервал между введениями, сут.
Получение анти-сывороток про-тив белка NP ВГЛ
1 Коза в/м, в область пред-лопаточных лимфатических узлов 100 21
300 + 0,05 % сапонина 14
600 14
600 14
1 Кролики, 3 голо-вы п/к, в область подколенных лимфатических узлов 60 14
120 + Монтанид 14
120 + Монтанид 10
Получение анти-сывороток про-тив белка М1 ВГЛ
2 Коза п/к, в область подколенных лимфатических узлов 75 14
150 14
300 + 0,05 % сапонина 14
230 14
Примечания: п/к - подкожно, в/м - внутримышечно, НАФ - неполный адъювант Фрейнда.
Таблица 3.
Оценка активности и специфичности антисывороток,
полученных к типоспецифическим белкам ВГЛ и выделенных из них гамма-глобулинов в РДП и ИФА
Наимнование антисыворотки Схема гипер-иммунизции Активность в РДП Активность в ИФА
АгН АгС ГЛ АгС АЧЛ сыворотки IgG
Кроличьи 1 - 1/4 - 1/20480 1/40960
Козья 1 - 1/8 - 1/20480 1/20480
Козья 2 - 1/8 - 1/20480 1/20480
Примечания: «-» - отрицательный результат; АгН- антиген нормальный, культуральный; АгС ГЛ - антиген специфический гриппа лошадей; АгС АЧЛ - антиген специфический африканской чумы лошадей.
и в ИФА 1 : 20480. Иммуноглобулины, выделенные из этих антисывороток, показали сравнимую активность в ИФА.
Таким образом, антисыворотки, полученные к внутренним белкам (М и ЫР) ВГЛ, в дальнейшем могут быть использованы при разработке отечественных диагностических тест-систем, пригодных для обнаружения типоспецифического антигена А ВГЛ.
Заключение
1. В результате проведенных исследований были подобраны оптимальные способы очистки и концентрирования ВГЛ и выделения типоспецифических (№Р и М1) белков из очищенных препаратов вируса.
2. С применением этих препаратов разработаны оптимальные схемы получения активных и специфичных антисывороток против данных штаммов вируса гриппа лошадей и его внутренних белков. Приготовленные антисыворотки пригодны для разработки и производства отечественных диагностических тест-систем с целью обнаружения ти-поспецифического антигена А и идентификации выделенных изолятов вируса гриппа лошадей.
Список литературы
1. Гусаков, В. В. Совершенствование лабораторной диагностики гриппа лошадей в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) / В. В. Гусаков //Автореферат диссертации. - Киев, 2000 год.
2. Домрачева, З. З. Вспышка гриппа А2 среди людей и лошадей / З. З. Домрачева //Микробиол., эпиди-миол. и иммунол. - 1961. - С. 7-31.
3. Иванова, В. Т. Сравнительная характеристика биофизических свойств белков вирусов гриппа А,
В и С / В. Т. Иванова, Е. А. Говоркова, Л. Я. Зак-стельская // Вопр. вирусол. - 1984. - Т. 29. - № 3. -С. 276-281.
4. Иванова, В. Т. Сравнительное изучение элек-трофоретической подвижности полипептидов вирусов гриппа рода А / В. Т. Иванова, В. А. Исаченко, Л. Я. Закстельская, В. М. Жданов // Вопр. вирусол. -1979. - № 5. - С. 505-510.
5. Иванова, Г. А. Грипп лошадей / Г. А. Иванова, М. В. Лихачев // Ветеринария. - 1970. - № 8. - С. 41.
6. Кыдырбаев, Ж. К. Сравнительная оценка параметров культивирования штаммов А/домашний гусь/ Павлодар/1/05 (H5N1) и А/крачка/Южная Африка/61 (H5N3) вируса гриппа птиц на куриных эмбрионах / Ж. К. Кыдырбаев, К. К. Табынов, Ш. Ж. Рыскельди-нова, С. М. Мамадалиев // Матер. II Откр. Всеросс. науч.-практ. конф. молодых ученых // Ульяновская гос. сельскохоз. акад. - 2007. - С. 78-83.
7. Литвинова, О. М. Этиологический надзор в России на базе Федерального центра по гриппу / О. М. Литвинова, Л. Г. Юхнова, Н. И. Коновалова и др. // Тезисы науч. конф. «Грипп - XXI век», 28 сент. -2 окт. 1997 г. С.-Петербург, Россия. - 1997. - 34 с.
8. Петров, Р. В. Получение гипериммунных сывороток к белку М вируса гриппа / Р. В. Петров, Р. М. Хаитов // Вопр. вирусол. - 1984. - № 3. - 271 с.
9. Слепушкин, А. Н. Эпидемиологические особенности гриппа последних лет / А. Н. Слепушкин, Д. К. Львов, И. Г. Маринич и др. // Вопр. вирусологии. -1998. - № 2.
10. Старов, С. К. Справка по методам диагностики высокопатогенного вируса гриппа птиц / С. К. Старов // БИО. - Август 2006. - С. 13-15.
11. Lowry, O. H. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent / O. H. Lowry, N. I. Rosebrough, A. L. Farr et al. // J. biol. Chem. - 1951. - v. 193. -P. 265-275.
12. OIE, Manual of Standards for Diagnostics Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (mammals, birds and bees). - Vol. 1-2. - 5th ed. - Paris, 2004.
13. Zhirnov, O. P. Solubilization of matririx protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo-and paramyxoviruses / O. P. Zhirnov et.al. // Viroloqy. -1990 May. - 176 (1) : 274-9.
