CC BY
65
Антигенные свойства нецитопатогенных штаммов вируса диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота
Г.К. Юров1, кандидат биологических наук, С.В. Алексеенкова1, кандидат биологических наук,
К.А. Диас Хименес1, М.П. Неустроев2, доктор ветеринарных наук, К.П. Юров1, доктор ветеринарных наук
1 Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко Российской Академии сельскохозяйственных наук (БГНУ ВИЭВ РАСХН) (Москва).
2 Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Российской Академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ЯНИИСХ РАСХН) (Якутск).
Ключевые слова: антитела, бизоны, вирус ВД-БС КРС, генотип 1, иммуноблоттинг, ИФА, филогенетический анализ
Сокращения: Б — бизоны, ВД-БС — вирусная диарея-болезнь слизистых, ДСН — додецилсульфат натрия, ДТТ — дитиотрейтол, ИФА — иммунофер-ментный анализ, К — коровы, Кнт —контроль, КРС — крупный рогатый скот, КЧС — классическая чума свиней, Мм — молекулярная масса, МЭБ — Международное эпизоотическое бюро, ОП — оптическая плотность, ПААГ — полиакриламидный гель, РН — реакция нейтрализации
Введение
Пестивирусы из семейства Flaviviridae у домашних и диких парнокопытных вызывают разнообразные формы заболевания — от острой до бессимптомной персистентной инфекции [3]. Типичный представитель семейства — возбудитель ВД-БС КРС представлен двумя генотипами, которые можно дифференцировать с помощью моноклональных антител к поверхностным полипептидам Е2 и Е™, а также филогенетического анализа [12].
Штаммы первого генотипа распространены во всем мире и относятся более чем к десяти субгенотипам, штаммы второго представлены двумя субгенотипами и обнаруживаются значительно реже. Кроме того, по характеру размножения в культурах клеток различают два биотипа вируса ВД-БС — цитопатогенный и не-цитопатогенный. Последний часто вызывает персистентную инфекцию у ж:ивотных [9]. Возбудитель причиняет серьезный ущерб животноводству, так как приводит к нарушению воспроизводства, формированию иммунотолерантности у плодов и новорожденных телят, респираторной и желудочно-кишечной патологии. [8]. Во многих странах заболевание ВД-БС носит эндемичный характер, при этом серопозитивность взрослого скота достигает 60...80 % [2]. ВД-БС также широко распространена в России: по данным А.Е. Верховской, 90,9 % исследованных животных в 15 российских регионах являются серопозитивными [5].
Исследованиями установлено, что многие клеточные культуры, используемые в диагностической, экспериментальной и производственной работе, персистентно инфицированы возбудителем ВД-БС КРС [1, 6]. Так, анализ 131 клеточной линии и отвивок с помощью
моноклональных антител к оболочечному гликопротеину вируса ВД-БС выявил 33 % инфицированных культур [6]. Основным источником вируса служит сыворотка крови КРС — обычный компонент культуральных сред. Штаммы первого генотипа наиболее часто обнаруживают в популяции КРС и в качестве кон-таминантов клеточных культур.
Цель исследования
Изучить возможную гетерогенность антигенных свойств нескольких нецитопатогенных штаммов вируса ВД-ВС, выявленных в перевиваемых линиях клеточных культур.
Материалы и методы
Вирус. Штаммы вируса ВД-БС КРС: «MDBK/12», «KST/12», «SPEV/12», «LU/12», выявленные в перевиваемых культурах клеток в лаборатории вирусологии ВИЭВ. Для работы были выбраны два штамма — «MDBK/12» и «LU/12», которые филогенетически максимально различаются. Кроме того, штамм «LU/12» имеет значительное сходство последовательности нуклеотидов с штаммом «ZM-95» (AF526381), относящимся, по данным Nagai с соавторами (2008), к новому отдельному субгенотипу 1m [11].
Сыворотки. Пробы сыворотки крови коров и телят фермерских хозяйств Московской области и пробы сыворотки крови лесных бизонов (Bison bison athabas-cae) из Республики Саха (Якутия).
ИФА для обнаружения антител к различным полипептидам вируса ВД КРС. Использовали непрямой вариант твердофазного ИФА. 96-луночные иммунологические планшеты сенсибилизировали антигенами вируса ВД-БС КРС в фосфатном буфере (рН 7,4). Инкубировали с исследуемыми сыворотками крови в двукратных разведениях в течение 2 ч при 37 оС. После инкубации с сыворотками добавляли иммуноперок-сидазный конъюгат. В качестве хромогена использовали 3, 3', 5, 5'-тетраметилбензидин.
Электрофорез в буферной системе Лемли. ДСН-ПААГ электрофорез полипептидов вируса ВД-БС КРС проводили в буферной системе Лемли [10] в 12%-м ПААГ в пластинах толщиной 0,75 мм на аппарате для вертикального электрофореза. Полипептиды разделяли в денатурирующих условиях с прогреванием в
Антигенные свойства нецитопатогенных штаммов вируса диареи — болезни слизистых крупного рогатого скота
ОП, усл. ед.
3
2.5 2
1.5
а)
0.5
□ MDBK/12 ■ LU/12
bind
а
K1 К2 КЗ К4 К5 Кб Б1 Б2 БЗ Б4 Кит+ Кнт-Взрослые животные
Рис. 1. Уровень антител к двум различным штаммам вируса диареи КРС Разведение сыворотки 1 : 400
присутствии ДТТ, окрашивали 10%-м раствором нитрата серебра.
Иммуноблоттинг. После ДСН-ПААГ электрофореза проводили электроперенос на нитроцеллюлозную мембрану в полусухой буферной системе по методу Бюр-нет [7]. Трек, содержащий маркер Мм белков, окрашивали раствором Кумаси. Треки, содержащие антиген вируса ВД-БС КРС, использовали для постановки иммуноблоттинга. Реакцию проводили с контрольными сыворотками из набора для иммуноферментной диагностики ВД-БС КРС (ВИЭВ) и исследуемыми сыворотками от серопозитивных животных. После инкубации с сыворотками полоски мембраны инкубировали с иммунопероксидазным коньюгатом против иммуноглобулинов класса G КРС. В качестве блокирующего раствора использовали овальбумин в концентрации 0,2 %, для проявления реакции — субстратную смесь на основе хромогена (ортодианизидина).
Статистическая обработка. Иммунологические показатели оценивали с помощью средних геометрических величин и метода описательной статистики «Гистограмма», используя компьютерную программу Microsoft Office Excel 2003 для Windows, как было описано ранее [4].
Результаты и обсуждение
На основе двух ранее идентифицированных штаммов: «MDBK/12» и «LU/12» были изготовлены лабораторные серии диагностикумов ВД-БС КРС, которые использовали для исследований. Результаты ретроспективных серологических анализов домашнего КРС и группы лесных бизонов представлены на рис. 1 и в табл. 1, 2. Специфичность результатов ИФА подтверждается исследованием положительных сывороток в имммуноблоттинге (рис. 2).
На рис. 1 представлены результаты опытов по выявлению антител к вирусу ВД-БС КРС посредством ИФА в сыворотках крови КРС фермерского хозяйства, неблагополучного по пневмоэнтеритам телят, а также в сыворотках крови лесных бизонов. В работе использовали приготовленные нами две лабораторные тест-системы с нецитопатогенными штаммами вируса ВД-БС КРС. Результаты филогенетического анализа, проведенного ранее [1], показали, что штаммы вируса ВД-БС «MDBK/12» и «LU/12», использованные в настоящем исследовании, относятся к генотипу 1 субгенотипу 1а.
T1 Т2 T3 Т4 Т5 Тб Т7 Т8 T9 Т10 Т11 Т12 Т13 Т1« Т15 Т16 Т17 Кит* К-Телята
в сыворотке крови взрослых животных (а) и телят (б).
Е2-Е1
97 кДа
2. Результаты иммуноблоттинга. треки: 1 — бизон № 3;
2 — корова № 2; 3 — бизон № 1; 4 — маркер молекулярной массы
Названные штаммы филогенетически максимально различаются. Кроме того, штамм «ии/12» имеет значительное сходство последовательности нуклеотидов с штаммом <^М-95» (AF526381), который, по данным М. Nagai с соавторами (2008), предположительно относится к новому отдельному субгенотипу 1т [11].
Из представленных в таблицах и на рисунках данных следует, что антитела к обоим штаммам вируса ВД-БС выявлены как у домашнего скота, так и у диких жвачных — лесных бизонов, завезенных из Канады в Республику Саха (Якутия) РФ с целью сохранения вида по программе восстановления плейстоценовой мегафауны Северной Америки. При этом титр антител к штамму «MDBK/12» (рис. 1 а и табл. 1) почти у всех взрослых животных (коров) превышал уровень антител к штамму <^и/12». На рис. 1 б и в табл. 2 представлены результаты титрования антител в сыворотке крови телят с теми же штаммами вируса. У телят в возрасте 3.6 мес антитела к вирусу ВД-БС КРС выявлены в достаточно высоких титрах. Все телята этой группы имели антитела к вирусу ВД-БС КРС штамму «MDBK/12». Титр антител в сыворотке крови этих же телят к штамму «ии/12» находился примерно в тех же значениях. В группе телят в возрасте более 6 мес (третья группа) иммунный ответ к вирусу ВД-БС штамму «MDBK/12» был зарегистрирован у трех телят из четырех. Выявлен один теленок с нулевым титром антител к обоим штаммам. Иммунный ответ к штамму
РВЖ • СХЖ • № 2/2013
Г.К. Юров, С.В. Алексеенкова, К.А. Диас Хименес, М.П. Неустроев, К.П. Юров
1. Титр антител в сыворотке крови взрослых животных
2. Титр антител в сыворотке крови телят
«ии/12» был зарегистрирован только у одного теленка. Три других теленка оказались серонегативными. Результаты исследования антител к штамму <^Ц/12» в сыворотке крови телят лесных бизонов свидетельствуют, что почти все они были инфицированы аналогичным (или родственным) штаммом, в результате у них выявлены антитела в достоверно высоких титрах.
Достоверность полученных данных контролировали методом иммуноблоттинга с положительными сыворотками. В пробах от серопозитивных животных были обнаружены антитела к вирусным полипептидам с Мм приблизительно 53 и 48 кДа, что соответствует Мм структурных полипептидов Е2 и Е™8 ви-
руса ВД-БС КРС. Тонкие полосы рядом с ними соответствуют их димерам, например, в пробе 1 отчетливо прослеживается взаимодействие антител с гетеродимером Е2-р7 массой приблизительно 55 кДа. На уровне 100 кДа антитела взаимодействуют с гетеродимером Е2-Е1. Во всех пробах также выявлены антитела к белку на уровне 28 кДа, что, вероятно, соответствует предшественнику всех полипептидов вируса ВД-БС КРС — протеазе №г°.
Неоднородность антигенной структуры различных штаммов возбудителя ВД-БС отмечали разные авторы. Так, Кунгурцева О.В. с совторами (2010), используя РН, установила, что в хозяйствах Сибирского региона циркулируют антигенно различающиеся штаммы вируса ВД-БС. Различия отмечаются внутри одного генотипа. Показано, что в животноводческих хозяйствах циркулируют варианты вируса ВД-БС двух субгенотипов 1а и 1Ь в составе первого генотипа [2].
Инфицированные вирусом ВД-БС клеточные культуры являются своеобразным индикатором штаммов, циркулирующих у домашнего скота. В перевиваемых линиях клеточных культур нами идентифицированы несколько генетически обособленных вариантов вируса, относящихся к одному (первому) генотипу. При этом оставалось неясным, сохранились эти штаммы в активной циркуляции в природе или их следует рассматривать исключительно как клеточные контами-нанты. Представленные выше результаты ретроспективного исследования крови домашнего скота и диких животных указывают на активную циркуляцию этих (или близких) возбудителей.
Выводы
Таким образом, посредством ретроспективного ИФА показано, что в популяциях домашнего скота и диких животных в активной циркуляции находятся, по крайней мере, два представленных в данной работе, антигенно различающихся штамма возбудителя (или близкие к ним), которые принадлежат к генотипу 1 субгенотипу 1а. При этом необходимо отметить, что один из них — «ии/12» имеет значительное сходство последовательности нуклеотидов со штаммом <^М-95» (AF526381), который, по мнению М. Nagai с соавторами (2008), может относиться к новому отдельному субгенотипу 1т. Полученные данные указывают на необходимость учета антигенной гетерогенности эпизоотических штаммов вируса ВД-БС КРС при диагностических исследованиях и специфической профилактике болезни, и в этом отношении следует согласиться с аналогичным мнением О.В. Кунгурцевой с соавторами (2010) [2].
Библиографию см. на сайте http://logospress.ru/
Животные Штамм MDBK/12 Штамм LU/12
К1 1 : 800 0
К2 1 : 800 0
К3 1 :1600 0
К4 1 :1600 1 : 800
К5 1 :1600 0
К6 1 :1600 0
Б1 1 :1600 1 :1600
Б2 1 :1600 1 : 400
Б3 1 : 800 1 : 800
Б4 1 :3200 1 : 400
Средняя геометрическая величина (m) 1392,88 26,39
Исследуемые телята Возраст, мес Штамм MDBK/12 Штамм LU/12
Т1 1 : 400 1:1600
Т2 1 :3200 1:1600
Т3 до 3 1 : 800 1 : 400
Т4 1 : 800 1 :1600
Т5 1 : 800 1 : 800
Т6 1 : 800 1 : 800
Т7 1 : 800 0
Т8 6 4 1 :1600 1 :1600
Т9 1 : 400 1 : 800
Т10 1 :1600 1 : 800
Т11 1 : 400 1 : 400
Т12 0 0 0
Т13 1 : 400 0
Т14 1 : 400 0
Т бизона Т15 0 1 :1600
Т бизона Т16 6 0 1:1600
Т бизона Т17 1 : 400 1 :1600
Средняя геометрическая величина (m) 226,65 203,49
Summary
G.K. Yurov, S.V. Alexeyenkova, K.A. Dias Himenes, M.P. Neustroev, K.P. Yurov. Antigenicity of Noncy-topathogenic Strains of Bovine Viral Diarrhea Virus. Immunological studies (ELISA) showed that populations of livestock and wood bison in Russia were infected by at least two antigenically distinct strains of BVDV belonging to genotype 1 subgemotype 1a. In addition, one strain «LU/12» has considerable genetic similarity with strain «ZM-95» (AF526381), relating to the new single subgemotype 1m. Antigenic heterogeneity of BVDV strains must be considered in diagnostic tests and specific prevention of disease.
