CC BY
196
УДК: 615:322
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В ТРАВЕ VERONICA CHAMAEDRYS (SCROPHULARIACEAE)
Т.С. Шестакова, В.Д. Белоногова, В.М. Петриченко,
ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия»
Шестакова Татьяна Сергеевна - e-mail: rsunderground@mail.ru
Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на апигенин в траве Veronica chamaedrys L. (Scrophulariaceae) с использованием метода УФ-спектрофотометрии. Наилучшими условиями для определения флавоноидов является однократная экстракция 50%-ным этанолом в соотношении 1:100 в течение 15 мин, степень измельчения сырья составляет 0,25-2,0 мм. Определено содержание суммы флавоноидов в образцах травы вероники дубравной, произрастающих на территории Уральского региона. Оно составляет 1,2-3,5%.
Ключевые слова: вероника дубравная, флавоноиды, УФ-спектрофотометрия.
A method of flavonoids quantative determination in herb of Veronica chamaedrys L. (Scrophulariaceae) in equivalent of apigenin was developed with using UV-spectroscopy. The best conditions for the determination of flavonoids are - a single extraction with 50% ethanol at a ratio of 1:100 for 15 minutes, crushing material is 0,25-2,0 mm. Content of flavonoids in the samples of herb of Veronica chamaedrys, growing in the Ural region, was found - it is 1,2-3,5%.
Key words: Veronica chamaedrys, flavonoids, UV spectroscopy.
Введение
Виды рода Вероника - Veronica L., сем. Норичниковые -Scrophulariaceae Juss. применяются в народной медицине [1], гомеопатии [2] и ветеринарии [3], а также служат сырьем для получения БАД с противовоспалительным и кровоостанавливающим эффектами [4]. Вероники широко распространены на территории России, однако большинство из них произрастает изреженно в лесных и луговых фитоценозах [5, 6]. В Пермском крае наиболее часто встречается вероника дубравная - Veronica chamaedrys L. [7, 8]. Фармакологические испытания извлечений из этого растения выявили наличие антикоагулянтной [9], гипотензивной [10], антимикробной и противовоспалительной [11] активности.
Разнообразная биологическая активность показывает перспективность разработки лекарственных препаратов на основе БАВ V. chamaedrys. В ее химическом составе присутствуют иридоиды (аукубин, каталпол, изокаталпол) [12, 13]; фенолокислоты (кофейная, хлорогеновая, п-кумаровая) [7, 14]; флавоноиды (апигенин, лютеолин, космосиин, апигенин-7-глюкуронид) [7, 15].
Цель исследования: разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в траве вероники дубравной (Veronica chamaedrys L.) с использованием метода УФ-спектрофотометрии.
Материал и методы
Для разработки методики использовали надземную часть с корнями вероники дубравной, собранную в 2008 году в пос. Задобрянка Добрянского района Пермского края на обочине проселочной дороги в фазу цветения -плодоношения и высушенную воздушно-теневым способом. Для спектрофотометрических исследований получали спиртовое извлечение (50%-й этанол) в соотношении сырье - экстрагент 1:2500. Определение проводили на приборе СФ-2000. В качестве рабочего стандартного образца использовали апигенин фирмы Sigma.
Результаты и их обсуждение
Разработанная методика основана на реакции комплек-сообразования флавоноидов с хлоридом алюминия (А1С13). Для определения аналитической длины волны были изучены УФ-спектры спиртовых извлечений травы вероники дубравной и стандартного образца апигенина (рис.). Полученные данные показали, что УФ-спектры спиртовых извлечений вероники дубравной содержат два выраженных максимума поглощения при длине волны 204±2 нм и 330±2 нм, а также плечо в области 250-290 нм, что обусловлено присутствием комплекса фенольных
РИС.
Спектральные характеристики извлечений из травы Veronica chmaedrys L. и стандартного образца апигенина: по оси абсцисс длина волны, нм; по оси ординат - оптическая плотность. 1 - извлечение из травы (1:2500), 2 - извлечение из травы с добавлением алюминия хлористого (1:2500); 3 - дифференциальный спектр извлечения (1:833) по реакции с алюминия хлористым; 4 - спиртовый раствор РСО апигенина; 5 - спиртовый раствор РСО апигенина с добавлением алюминия хлористого.
соединений - флавоноидов и фенолокислот [16, 17]. При добавлении AlCl3 появляется дополнительный максимум в области 277 нм и наблюдается гипохромный эффект в точке максимума 330 нм, что не позволяет использовать данную длину волны в качестве рабочей.
Дифференциальная кривая поглощения (рис.) представляет собой интегрированный спектр наложения комплекса флавоноидных веществ, содержащихся в веронике дубравной, имеет выраженный максимум при 380 нм и совпадает с длинноволновой полосой комплекса апиге-нина (380 нм) с AlCl3 [17], что дает возможность использовать данную длину волны в качестве аналитической. Выбранные условия позволяют устранить влияние окрашенных веществ, присутствующих в извлечении, а также других фенольных соединений, не вступающих в реакцию комплексообразования с AlCl3 (оксикоричные кислоты и др.) [18].
Для определения стабильности спектральных характеристик были изучены УФ-спектры извлечений из травы вероники дубравной, заготовленной в различных местообитаниях (таблица 1). Как следует из полученных данных, положение экстремумов поглощения стабильно, а небольшие колебания не превышают погрешности измерения прибора (±2 нм). Значение оптической плотности в точках максимума варьируют в зависимости от места произрастания вероники, что, вероятно, связано с различным количественным содержанием суммы фенольных соединений.
При разработке методики анализа было изучено влияние степени измельчения сырья, соотношение сырья и экстрагента, влияние времени и кратности экстракции на переход флавоноидов в извлечения. Для определения оптимальной степени измельчения сырья получали извлечения на 50%-м этаноле в соотношении 1:833 из травы, измельченной до 2.0, 5.0, 7.0 и 10 мм. Установлено, что флавоноиды извлекаются в экстракты лучше из сырья с размерами частиц от 0.25 до 2 мм (таблица 2).
В качестве экстрагента использовали воду и этанол различной концентрации. Полученные данные показывают, что наилучшей извлекающей способностью по отношению к флавоноидам обладают водные растворы этанола. Оптимальным для экстракции является 50%-й этанол, соотношение сырья и экстрагента составляет 1:100. Дальнейшее увеличение этого соотношения не приводило к повышению содержания суммы флавонои-дов в извлечении (таблица 2).
Время полной экстракции флавоноидов из вероники дубравной 15 мин. Увеличение времени экстракции, а также многократное экстрагирование флавоноидов нецелесообразно, поскольку оно вызывает некоторое снижение содержания суммы флавоноидов в исследуемых извлечениях (таблица 2).
Для пересчета содержания суммы флавоноидов в веронике дубравной на апигенин нами рассчитан удельный показатель поглощения (Е1%1см) комплекса апигенина с AlCl3 при 380 нм, который составляет 550±13. В связи с этим в формулу расчета включено теоретическое значение Е1%1 см= 550, позволяющее не использовать в методике РСО апигенина.
ТАБЛИЦА 1.
УФ-спектральная характеристика извлечений (1:2500) из травы V. chamaedrys различных местообитаний
Растворитель (раствор сравнения) Параметр Пункт сбора, местообитание
г. Пермь, м/р-н Вышка II, суходольный луг Сверд. обл., Кушвинский р-н, пос. Баранчинский, смешанный лес г. Пермь, пос. Южный, смешанный лес
50%-й раствор этанола (50%-й этанол) Xmax нм 330 330 329
D 0.8 1.1 0.5
50%-й раствор этанола с алюминием хлористым (50%-й этанол) Xmax нм 330 330 330
D 0.6 0.9 0.5
Дифференциальный спектр с алюминием хлористым (извлечение из травы) Xmax нм 382 380 379
D 0.5 0.4 0.2
ТАБЛИЦА 2.
Влияние условий экстракции на содержание флавоноидов в траве V. chamaedrys
Условия экстракции Содержание суммы флавоноидов, %
1 2 3
Степень измельчения сырья, мм >0.25 < 2.0 1.0
>0.25 < 5.0 0.7
>0.25 < 7.0 0.8
>0.25 < 10.0 0.7
Экстрагент вода 0.8
30 % этанол 1.0
50 % этанол 1.0
70 % этанол 0.9
90 % этанол 0.4
Соотношение сырья и экстрагента (50%-й этанол) 1:20 0.4
1:50 1.3
1:100 2.0
1:200 1.5
Время экстракции, мин 15 2.0
30 1.7
60 1.6
Кратность экстракции однократно 2.0
двукратно 1.3
трехкратно 1.4
ТАБЛИЦА 3.
Результаты количественного определения содержания флавоноидов в сырье Veronica chamaedrys L. и метрологическая характеристика
№ определения Содержание суммы флавоноидов, % Метрологическая характеристика метода
1 2.7 x= 2.4
2 2.5 S2=0.01725
3 2.4 S=0.13134
4 2.3 Sx=0.04378
5 2.3 P, %=95
6 2.3 t=2.26
7 2.4 Ax=0.10097
8 2.4 E, %=±4.2
9 2.4
10 2.4
Нами проанализирована устойчивость комплекса фла-воноидов вероники дубравной с А1С13 в интервале 20-60 мин. Флавоноидные соединения вероники дубравной образуют устойчивые комплексы с раствором А1С13 через 20 минут после добавления реактива. Устойчивость комплекса сохраняется в течение часа, при этом оптическая плотность реакционной смеси практически не изменяется. Полученные данные позволяют проводить количественное определение флавоноидов в интервале от 20 минут до 1 часа после добавления реактива.
Методика определения. Аналитическую пробу воздушно-сухого сырья измельчают до размера частиц, проходящих через сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 0.5 г (точная навеска) сырья помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл со шлифом, прибавляют 50 мл 50%-го этанола. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин, считая с момента закипания экстрагента. Колбу охлаждают до комнатной температуры, извлечение фильтруют через ватный тампон в плоскодонную мерную колбу вместимостью 50 мл и через этот же фильтр доводят объем раствора 50%-м этанолом до метки. Полученное извлечение фильтруют в плоскодонную колбу через бумажный фильтр (раствор А), первые 10 мл фильтрата отбрасывают. 3 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 1 мл 2% спиртового раствора А1С13, доводят объем до метки 50%-м этанолом и перемешивают. Спустя 20-30 минут измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре марки СФ-2000 при длине волны 380 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 3 мл раствора А, доведенного 50%-м этанолом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл. Содержание суммы флавоноидов в траве вероники дубравной в пересчете на апигенин вычисляют по формуле:
D•25•50•100 %
Х =---------------------------------, где
550^т^(100 - W)
D - оптическая плотность исследуемого раствора; т - навеска сырья, г; V - объем раствора А, взятого для разбавления, мл; 50 - объем раствора А, мл; 25 - объем раствора Б, мл; W - потеря в массе при высушивании сырья, %; 550 - удельный показатель поглощения комплекса апигенина с А1С13 при 380 нм.
Статистическая обработка результатов была выполнена по общепринятой методике [19]. Результаты показали (таблица 3), что ошибка единичного определения с достоверной вероятностью 95% составляет 4,2%.
По разработанной методике нами были проанализированы 10 образцов травы вероники дубравной, собранных в различных пунктах (таблица 4). Полученные данные показывают, что содержание суммы флавоноидов в траве вероники дубравной колеблется в пределах от 1,2 до 3,5%, что необходимо учитывать при разработке нормативной документации.
Таким образом, разработанная методика может быть использована для оценки качества сырья вероники дубравной по содержанию флавоноидов.
ТАБЛИЦА 4.
Характеристика образцов Veronica chamaedrys и содержание суммы флавоноидов в траве
№ образца Пункт сбора образца, местообитание Содержание суммы флавоноидов,%
1 Пермский край:
2 г. Пермь, пос. Южный, суходольный луг, 06.08 1,8 ± 0,1
3 окр. г. Кунгур, опушка смешанного леса, 07.08 1,6 ± 0,1
4 г. Пермь, м/р-н Вышка II, суходольный луг, 06.08 2,0 ± 0,1
5 г. Пермь, пос. Южный, смешанный лес, 06.08 1,2 ± 0,1
6 Окр. г. Перми, смешанный лес, 07.08 1,7 ± 0,1
7 Кунгурский р-н, пос. Шадейка, суходольный луг, 07.08 2,2 ± 0,1
8 Добрянский р-н, пос. Задобрянка, обочина проселочной дороги, 06.08 2,4 ± 0,1
9 Кунгурский р-н, с. Серга, суходольный луг, 06.08 2,0 ± 0,1
10 Нижегородская обл., пос. Шаранга, суходольный луг, 07.08 3,5± 0,2
11 Свердловская обл., Кушвинский р-н, пос. Баранчинский, 07.08 2,1 ± 0,1
Заключение
Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в сырье вероники дубравной (Veronica chamaedrys L.), основанная на реакции комплек-сообразования с алюминием хлористым. Оптимальными условиями для определения содержания флавоноидов являются: однократная экстракция 50%-м этанолом в течение 15 минут в соотношении сырье - экстрагент 1:100. Содержание суммы флавоноидов (в пересчете на апигенин) в сырье определяется методом дифференциальной спектрофотометрии. В образцах, собранных в разных регионах России, оно колеблется в пределах 1,2-3,5%. Ошибка единичного определения с достоверной вероятностью 95% составляет 4,2%.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке губернатора Пермского края и Министерства образования Пермского края в рамках проекта «Разработка новейших препаратов на основе флавоноидов, экстрагированных из растений семейства Норичниковых Уральского региона, способных предотвращать нейротоксическое влияние алкоголя».
ЛИТЕРАТУРА
1. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейства Caprifoliaceae - Plantaginaceae. Л. 1990.
Rastitel'nye resursy SSSR: Cvetkovye rasteniya, ikh khimicheskiy sostav, ispol'zovanie. Semeystva Caprifoliaceae - Plantaginaceae. L. 1990.
2. Михайлов И.В. Гомеопатия: Справочник. М. 2002.
Mikhaylov I.V. Gomeopatiya: Spravochnik. M. 2002.
3. Рабинович М.И. Лекарственные растения в ветеринарии. М. 1987.
Rabinovich M.I. Lekarstvennye rasteniya v veterinarii. M. 1987.
4. Михайлов И.В. Современные препараты из лекарственных растений. М. 2003.
Mikhaylov I.V. Sovremennye preparaty iz lekarstvennykh rasteniy. M. 2003.
5. Еленевский А.Г. Систематика и география вероник СССР и прилежащих стран. М. 1978.
Elenevskiy A.G. Sistematika i geografiya veronik SSSR i prilezhashhikh stran. M. 1978.
6. Савиных Н.П. Биоморфология вероник России и сопредельных государств: автореф. дис. ... докт. биол. наук. Mосква, Z000.
Savinykh N.P. Biomorfologiya veronik Rossii i sopredel'nykh gosudarstv: аvtoref. dis.... dokt. biol. nauk. Moskva, 2000.
7. Гусев Н.Ф. Биологические особенности и перспективы использования растений рода вероника лесостепного и степного предуралья: автореф. дис. ... докт. биол. наук. Орегбург, Z010.
Gusev N.F. Biologicheskie osobennosti i perspektivy ispol'zovaniya ras-teniy roda Veronika lesostepnogo i stepnogo predural'ya: аvtoref. dis. ... dokt. biol. nauk. Oregburg, 2010.
8. Овеснов С.А. Конспект флоры Пермской области. Пермь. 1997.
Ovesnov S.A. Konspekt flory Permskoy oblasti. Perm'. 1997.
9. Петриченко ВМ. Фармакогностические исследования и биологическая активность растений семейства Scrophulariaceae: автореф. дис. ... докт. фарм. наук. Пермь, Z005.
Petrichenko V.M. Farmakognosticheskie issledovaniya i biologicheskaya aktivnost' rasteniy semeystva Scrophulariaceae: аvtoref. dis. ... dokt. farm. nauk. Perm', 2005.
10. Петриченко ВМ., Сухинина Т.В., Сыропятов Б.Я. и др. Гипотензивная активность извлечений из некоторых видов семейства Scrophulariaceae, произрастающих в Пермском крае. Растительные ресурсы. Z009. Вып. 1. С. 140-147.
Petrichenko V.M., Sukhinina T.V., Syropyatov B.Ya. i dr. Gipotenzivnaya aktivnost' izvlecheniy iz nekotorykh vidov semeystva Scrophulariaceae, proizrastayuschikh v Permskom кгae. Rastitel'nye resursy, 2009. Vyp. 1. S. 140-147.
11. Средство, обладающее антимикробным, противовоспалительным и анестезирующим действием и способ его получения. Патент РФ № Z396 971 от г0.08.г010.
Sredstvo, obladayuschee antimikrobnym protivovospalitel'nym i anes-teziruyuschim deystviem i sposob ego polucheniya. Patent RF 2396 971 ot 20.08.2010.
12. Деготь А.В. Распространение и возможность использования в медицине иридоидов семейства Норичниковых. Фарм. журн. 1984. № 5. С. 36-41.
Degot'A.V. Rasprostranenieivozmozhnost'ispol'zovaniya vmedicineiri-doidov semeystva Norichnikovykh. Farm. zhurn. 1984. № 5. S. 36-41.
13. Мнацаканян В.А. Иридоидные гликозиды. Ереван. 1986.
Mnacakanyan V.A. Iridoidnye glikozidy. Erevan. 1986.
14. Zielinska-Sowicka R., Wojcik E., Walas E. Badania ziela niektorych gatunkow Veronica L. z zastosowaniem chromatografii. Farm. pol. 1968. T. 24. № 9. Р. 701-705.
15. Фролова В.И., Джумырко С.Ф. Флавоноиды некоторых видов семейства Scrophulariaceae. Химия природных соединений. 1984. № 5. С. 655-656.
Frolova V.I., Dzhumyrko S.F. Flavonoidy nekotorykh vidov semeystva Scrophulariaceae. Khimiya prirodnykh soedineniy. 1984. №5. S. 655- 656.
16. Бандюкова В.А. Фенолокислоты растений, их эфиры и гликозиды. Химия природных соединений. 1983. № 2. C. 271-276.
Bandyukova V.A. Fenolokisloty rasteniy, ikh efiry i glikozidy. Khimiya prirodnykh soedineniy. 1983. № 2. S. 271-276.
17. Клышев Л.К., Бандюкова В.А., Алюкина Л.С. Флавоноиды растений. Алма-Ата. 1978.
Klyshev L.K., Bandyukova V.A., Alyukina L.S. Flavonoidy rasteniy. Alma-Ata. 1978.
18. Барковский В.Ф., Ганапольский, В.И. Дифференциальный спектро-фотометрический анализ. М. 1989.
Barkovskiy V.F., Ganapol'skiy V.I. Differencial'nyy spektrofotometriches-kiy analiz. M. 1989.
19. Государственная фармакопея СССР. XI изд. М. 1987. Ч. 1.
Gosudarstvennaya farmakopeya SSSR. XI izd. M. 1987. Ch. 1.
