CC BY
132
Химия растительного сырья. 2010. №2. С. 117-121.
УДК 615.32:547.972+543.544 НОВЫЕ ПОДХОДЫ К СТАНДАРТИЗАЦИИ СЫРЬЯ ЭРВЫ ШЕРСТИСТОЙ
© А.В. Куркина , А.А. Осипова
Самарский государственный медицинский университет,ул. Чапаевская, 89;
Самара 443099 (Россия) e-mail: Annushkae@yandex.ru
Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в траве эрвы шерстистой (Aerva lanata L.), заключающаяся в использовании дифференциальной спектрофотометрии (аналитическая длина волны 407 нм). Обоснована целесообразность использования в методике анализа Государственного стандартного образца рутина. Содержание суммы флавоноидов в образцах травы эрвы шерстистой варьирует в пределах от 0,51 до 1,05%.
Ключевые слова: эрва шерстистая (Aerva lanata L.), флавоноиды, тилирозид, нарциссин, рутин.
Введение
Эрва шерстистая (Aerva lanata L.) - двулетнее или однолетнее (в культуре) травянистое растение семейства Амарантовых (Amaranthaceae). Распространена в странах Юго-Восточной Азии (Индия, Цейлон и др.) [1, 2]. Интродуцирована в 1977 г. в зоне влажных субтропиков Грузии из семян цейлонского происхождения. Имеется положительный опыт культивирования данного растения в Грузии (г. Кобулети), Российской Федерации (Краснодарский край, Самарская область) [1, 2]. В качестве лекарственного сырья используют надземную часть растения, в которой допускается наличие 10% корней в соответствии с требованиями, регламентируемыми ФС 42-3635-98 [3]. Сырье содержит флавоноиды (около 1,0-1,5%), среди которых основными являются ацилированные производные кемпферола - тилирозид и кумароилтилирозид [1, 2, 4]. В траве эрвы шерстистой содержатся также гликозиды изорамнетина - эрвитрин и нарциссин [1, 5].
Среди сопутствующих веществ интерес представляют алкалоиды группы кантин-6-она (эрвозид, эрвин, метилэрвин) и p-карболина - в-карболин-1-пропионовая кислота и эрволанин, содержащиеся в минорных количествах в траве [6-8]. К сопутствующим веществам относятся также фенольные кислоты (сиреневая, ванилиновая), ферулоиламиды (ферулоилтирамин, ферулоилгомованилиламин) [9].
Применяют в виде настоя в качестве эффективного диуретического, гипоазотемического и солевыводящего средства при пиелонефритах, циститах, уретритах, мочекаменной болезни, нарушения солевого обмена (подагра, спондилоз). Присутствие в сырье значительного количества нитрата калия позволяет отнести это средство к ценным калийсбрегающим диуретикам, в 3-4 раза превышающим эффект почечного чая.
Качество сырья регламентируется ФС 42-3635-98 [3]. В разделе «Качественные реакции» предусмотрено определение флавоноидов (от 3 до 5 пятен оранжевого цвета в интервале величин Rf 0,2-0,9) методом ТСХ. В методике количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на тилирозид должно быть не менее 0,5% [3].
Сущность количественного определения флавоноидов заключается в первоначальной очистке навески сырья от сопутствующих липофильных веществ в аппарате Сокслета длительной экстракцией хлороформом, последующем извлечении анализируемых веществ 60%-ным этиловым спиртом и определении спектрофотометрическим методом оптической плотности при длине волны 316 нм испытуемого раствора. Определяют процентное содержание суммы флавоноидов в пересчете на тилирозид.
На наш взгляд, количественное определение по фармакопейной методике достаточно трудоемко.
Цель настоящего исследования - разработка методики количественного определения суммы флавонои-дов в траве эрвы шерстистой с использованием дифференциальной спектрофотометрии.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Экспериментальная часть
Объектом исследования служили промышленные образцы травы эрвы шерстистой (ЗАО «Красногорск-лексредства», ОАО «Рослекраспром», ЗАО «Фирма Здоровье», ЗАО «Фито-Эм»), реализуемые через аптечную сеть, а также образцы надземной части, культивируемые в Самарской области. С целью разработки методики нами были определены оптимальные условия экстракции травы эрвы шерстистой: экстрагент - 60%-ным этиловый спирт; соотношение сырье-экстрагент - 1 : 30; время экстракции на водяной бане при температуре 85-90 °С в течение 75 мин (табл. 1).
В ходе разработки методики количественного определения суммы флавоноидов в траве эрвы шерстистой изучены УФ-спектры водно-спиртовых извлечений из данного сырья. Регистрацию спектров проводили с помощью спектрофотометра «Specord 40» (Analytik Jena).
Методика количественного определения суммы флавоноидов в траве эрвы шерстистой. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещали в колбу со шлифом вместимостью 50 мл, прибавляли 30 мл 60% этилового спирта. Колбу закрывали пробкой и взвешивали на тарирных весах с точностью до +0,01. Колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 75 мин. Затем колбу закрывали той же пробкой, снова взвешивали и восполняли недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтровали через фильтр (красная полоса) и охлаждали в течение 30 мин (извлечение из травы). Испытуемый раствор готовили следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводили объем раствора до метки 95%-ным этиловым спиртом (испытуемый раствор А). В качестве раствора сравнения использовали раствор, приготовленный при тех же условиях, но без добавления алюминия хлорида (раствор сравнения А). Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре при длине волны 407 нм. Параллельно измеряли оптическую плотность раствора ГСО рутина при длине волны 407 нм, приготовленного по аналогии с испытуемым раствором (см. примечание).
Примечание: Приготовление раствора рутина - стандартного образца (ФС 42-2508-87). Около 0,02 (точная навеска) ГСО рутина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора 95% этиловым спиртом до метки (испытуемый раствор Б рутина). В качестве раствора сравнения используют раствор, который готовят следующим образом: 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят объем раствора до метки 95%-ным этиловым спиртом (раствор сравнения Б рутина).
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:
A ■ т0 ■ 30-1-25-100-100
X —----------------------,
A0 ■ т ■ 50-1-25 ■ (100 - W)
где A - оптическая плотность испытуемого раствора; Ao - оптическая плотность раствора ГСО рутина; т -масса сырья, г; то - масса ГСО рутина, г; W - потеря в массе при высушивании в процентах.
Таблица 1. Зависимость полноты извлечения суммы флавоноидов из травы эрвы шерстистой от условий
экстракции
№ п/п Концентрация экстрагента (этанол), % Соотношение сырье : экстрагент Время экстракции, мин Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье, в %
1 50 1 З0 45 0,44+0,01
2 б0 1 З0 45 0,48+0,02
З 70 1 З0 45 0,42+0,01
4 80 1 З0 45 0,45+0,01
5 б0 1 З0 З0 0,44+0,01
б б0 1 З0 45 0,47+0,02
7 б0 1 З0 б0 0,49+0,01
8 б0 1 З0 75 0,53+0,02
9 б0 1 З0 90 0,50+0,02
Обсуждение результатов
При разработке методики количественного определения суммы флавоноидов использовали реакцию комплексообразования с раствором алюминия хлорида для исключения вклада в значение оптической плотности других групп соединений. В этом случае наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы флавоноидов [10], который обнаруживается в УФ-спектре в виде максимума поглощения в области 407-410 нм (рис. 1), что находит подтверждение в условиях дифференциальной спектрофотометрии (рис. 2).
Изучение УФ-спектров ГСО рутина показало, что раствор данного стандарта в присутствии алюминия хлорида имеет максимум поглощения при 412 нм, в том числе в дифференциальном варианте (рис. 3 и 4). Флавоноиды (гликозиды кемпферола и изорамнетина), содержащиеся в траве эрвы шерстистой, близки по своим спектральным характеристикам к таковым рутина, в том числе в условиях комплексообразования с А1С13 [10]: максимум поглощения раствора нарциссина (3-О-рутинозид изорамнентина) в условиях дифференциальной спектрофотометрии находится при длине волны 407 нм. Следовательно, рутин, близкий по своим спектральным характеристикам к флавоноидам травы эрвы шерстистой, может быть использован в методике анализа в качестве ГСО.
С использованием разработанной методики проанализирован ряд образцов сырья (табл. 2) и показано, что содержание суммы флавоноидов в траве эрвы шерстистой варьирует в пределах от 0,51 до 1,05%. На наш взгляд, это дает основание оставить в качестве нижнего предела показатель содержания суммы флаво-ноидов не менее 0,50%.
Определение содержания флавоноидов с использованием фармакопейной методики показывает, что в этом случае имеет место некоторое завышение результатов анализа: 1,32% на фоне 1,02% (по разработанной методике). Подтверждением этого мнения служит то обстоятельство, что кривая поглощения раствора извлечения (рис. 5), полученного из сырья, очищенного в соответствии с фармакопейной методикой, практически не отличается от таковой исходного испытуемого раствора (рис. 1).
На наш взгляд, разработанная методика имеет ряд преимуществ по сравнению с фармакопейной методикой: во-первых, она легко воспроизводима, поскольку не требуется очистка от сопутствующих веществ с помощью длительной экстракции, а во-вторых, дифференциальная спектрофотометрия позволяет минимизировать вклад сопутствующих веществ в оптическую плотность испытуемого раствора. Следовательно, внедрение данной методики, отвечающей параметрам валидации, позволит более объективно оценивать качество сырья эрвы шерстистой.
Метрологические характеристики методики количественного определения флавоноидов в траве эрвы шерстистой методом дифференциальной спектрофотометрии представлены в таблице 3.
200 250 300 350 400 450 [nm] 200 250 300 350 400 450 [пт]
Absorbance Absorbance
Рис. 1. УФ-спектры растворов водно-спиртового извлечения из травы эрвы шерстистой: Обозначения: 1 - раствор извлечения из травы эрвы шерстистой; 2 - раствор извлечения из травы эрвы шерстистой с добавлением алюминия хлорида
Рис. 2. УФ-спектр раствора водно-спиртового извлечения из травы эрвы шерстистой с добавлением хлорида алюминия (дифференциальный спектр)
1 1
\\1 \ /
\
/ V \
\ \
\ \
V
200 250 300 350 400 450 [пт]
Absorbance
Рис. 3. УФ-спектр спиртового раствора ГСО рутина. Обозначения: 1 - раствор ГСО рутина; 2 - раствор ГСО рутина с добавлением алюминия хлорида
Рис. 4. УФ-спектр раствора ГСО рутина с добавлением хлорида алюминия (дифференциальный спектр)
200 2 50 3 00 350 00 450 |™
Рис. 5. УФ-спектр раствора водно-спиртового извлечения травы эрвы шерстистой (фармакопейный метод)
Таблица 2. Содержание суммы флавоноидов в различных образцах травы эрвы шерстистой
№ п/п Характеристика образца сырья Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье, %
1 ОАО «Красногорсклексредства», сырье измельченное (пачки) 30 г 0,54+0,02
2 ОАО «Рослекраспром», сырье измельченное (пачки) 50 г 0,52+0,01
3 ЗАО «Фито-Эм», сырье измельченное (пачки) 30 г 0,51+0,02
4 ЗАО «Фирма Здоровье», сырье измельченное (пачки) 50 г 0,52+0,01
5 Самарская область, Воскресенский дачный массив (2007 г.) 1,02+0,03
6 Самарская область, Алексеевский дачный массив (2007 г.) 0,97+0,02
7 Самарская область, Алексеевский дачный массив (2008 г.) 1,05+0,03
Таблица 3. Метрологические характеристики методики количественного определения содержания суммы флавоноидов в траве эрвы шерстистой
f X S P, % t (P,f) AX E, %
10 0,53 0,0103 95 2,26 0,023 ±4,39
Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения суммы флавоноидов в траве эрвы шерстистой с доверительной вероятностью 95% составляет +4,39%.
Таким образом, разработанная методика количественного определения суммы флавоноидов в траве эрвы шерстистой с использованием метода дифференциальной спектрофотометрии позволит объективно оценивать качество данного сырья и препаратов на его основе.
Выводы
1. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в траве эрвы шерстистой с использованием метода дифференциальной спектрофотометрии (аналитическая длина волны 407 нм). На основе изучения спектральных характеристик флавоноидов извлечений из травы эрвы шерстистой обоснована целесообразность использования в методике анализа ГСО рутина.
2. Содержание суммы флавоноидов в образцах эрвы шерстистой варьирует в пределах от 0,51 до 1,05% (в пересчете на рутин). Ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95% составляет +4,39%.
Список литературы
1. Куркин В.А. Фармакогнозия: учебник для фармацевтических вузов (факультетов). 2-е изд. перераб. и доп. Самара, 2007. 1239 с.
2. Куркин В.А. Основы фитотерапии: учеб. пособие для студентов фармацевтических вузов. Самара, 2009. 963 с.
3. ФС 42-3635-98. Эрвы шерстистой трава.
4. Задорожный А.М., Запесочная Г.Г., Первых Л.Н. и др. Изучение травы Aerva lanata. I. О-ацилгликозиды флавоноидов // Химико-фармацевтический журнал. 1986. Т. 20. №7. С. 855-858.
5. Первых Л.Н., Карасартов Б.С., Запесочная Г.Г. Изучение травы Aerva lanata. IV. Гликозиды флавоноидов // Химия природных соединений. 1992. №5. С. 581-583.
6. Запесочная Г.Г., Куркин В.А., Первых Л.Н. Изучение травы Aerva lanata. III. Алкалоиды // Химия природных соединений. 1992. №3. С. 388-394.
7. Zapesochnaya G., Kurkin V., Okhanov V., Miroshnikov A. Canthin-6-one and P-Carboline Alkaloids from Aerva lanata // Planta Medica. 1992. V. 58. N2. Pp. 192-195.
8. Запесочная Г.Г., Куркин В.А., Первых Л.Н., Оханов В.В., Мирошников А.И. К строению новых алкалоидов Aerva lanata // Химия природных соединений. 1991. №6. С. 821-824.
9. Запесочная Г.Г., Куркин В.А., Первых Л.Н. Изучение травы Aerva lanata. II. Ферулоиламиды // Химия природных соединений. 1990. №5. С. 694-695.
10. Mabry T.J., Markham K.R., Thomas M.B. The Systematic Identification of Flavonoids. Berlin; Heidelberg; New York, 1970. 354 с.
Поступило в редакцию 14 января 2010 г.
После переработки 18 февраля 2010 г.
