CC BY
231
УДК 615.015.11.07.322:582.918:577.127.4
ИССЛЕДОВАНИЕ КАЧЕСТВЕННОГО И КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОСТАВА ФЛАВОНОИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ГУСТОГО ЭКСТРАКТА ПЕРВОЦВЕТА ЛЕКАРСТВЕННОГО
© Г.М. Латыпова1, З.Р. Романова1, В.Н. Бубенчикова2 , Г.В. Аюпова1
1 Башкирский государственный медицинский университет, ул. Ленина, 3, Уфа, 450000 (Россия)
2Курский государственный медицинский университет, ул. К. Маркса, 3, Курск,
305041 (Россия) E-mail: [email protected]
Получен густой экстракт травы первоцвета весеннего. Подобраны условия проведения экстрагирования. Исследован качественный состав густого экстракта методами тонкослойной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии. Проведено количественное определение флавоноидов густого экстракта травы первоцвета весеннего спектрофотометрическим методом. Подобраны оптимальные условия разделения и экстракции флавоноидов, разработана методика количественного определения флавоноидов в экстракте травы первоцвета весеннего. Установлено, что содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в исследуемом образце густого экстракта составляет 4,58±0,071%. Разработанная методика может быть использована для стандартизации густого экстракта травы первоцвета весеннего.
Ключевые слова: густой экстракт травы первоцвета весеннего, тонкослойная хроматография, метод ВЭЖХ, стандартизация густого экстракта по содержанию флавоноидов.
Введение
В последние годы все больше внимания уделяется поиску новых лекарственных растений и разработке препаратов из растительного сырья, используемого в народной медицине. Это связано с возможностью их длительного применения, комплексного воздействия на организм и с отсутствием побочных эффектов. Одним из перспективных направлений является изучение антиоксидантной активности лекарственного растительного сырья, которая обусловлена наличием в нем флавоноидов, полифенольных соединений и других групп биологически активных веществ.
В качестве объекта исследования нами взят первоцвет весенний Primula officinalis (сем. Primulaceae) -поливитаминное и пищевое растение [1].
По литературным данным корни указанного растения содержат сапонины, гликозиды примулаверин и примверин, примуловую кислоту, кремниевую кислоту, флавоны, дубильные вещества, витамины С и А, эфирные масла. В листьях присутствует большое количество аскорбиновой кислоты (5,9%), каротиноидов, минеральных веществ [7, 9]. Ранее нами был изучен качественный состав травы первоцвета весеннего [7].
Цель данного исследования - изучение качественного и количественного состава флавоноидных соединений густого экстракта травы первоцвета весеннего.
Экспериментальная часть
Объектом исследований служил густой экстракт, полученный из травы первоцвета весеннего.
Для получения густого экстракта травы первоцвета весеннего применили классический метод экстрагирования - настаивание. Нами были подобраны условия проведения экстрагирования (вид экстрагента, его концентрация, соотношение сырье : экстрагент, степень измельчения сырья, время экстракции) (табл. 1). При этом основным критерием выбора являлось содержание суммы флавоноидов в экстракте в пересчете на рутин.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Таблица 1. Условия получения экстракта травы первоцвета весеннего
Кратность экстрагирования Степень измельчения сырья Вид экстрагента Концентрация экстрагента Соотношение сырье - экстрагент Время экстракции
3 1,0 мм Водный раствор этанола 70% 1 : 10 12 ч
Спиртовые извлечения травы первоцвета весеннего объединяли, помещали в прохладное место (холодильная камера при температуре 8-10 оС) на 24 ч. После оседания балластных веществ вытяжку фильтровали через бумажный беззольный фильтр. В результате получили прозрачное извлечение темно-зеленого цвета с характерным запахом спирта этилового и ароматическим запахом травы первоцвета весеннего. Данную вытяжку сгущали методом отгона спирта этилового на роторном испарителе модели ИР - 1М до состояния густого экстракта с влажностью не более 13%.
Экстракт травы первоцвета весеннего представляет собой густую вязкую массу темно-зеленого цвета с приятным своеобразным запахом.
Далее мы изучали качественный состав флавоноидных соединений полученного густого экстракта. Для качественного анализа использовали метод хроматографии в тонком слое сорбента на пластинках марки СТХ-1А в системах растворителей: н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (5 : 1 : 1), этилацетат -муравьиная кислота - вода (70 : 15 : 15) [2, 4, 5]. Для хроматографирования брали 0,5% раствор густого экстракта в растворе 70%-ного этилового спирта.
На стартовую линию хроматографических пластинок размером 15x10 см наносили по 30 мкл исследуемых растворов и по 10 мкл 1% растворов в 70%-ном этиловом спирте доступных достоверных образцов флавоноидных соединений, пластинки с нанесенными пробами высушивали на воздухе в течение 5 мин. Хроматографирование проводили восходящим способом, после прохождения фронтов элюента 12 см пластинки извлекали и высушивали. Далее пластинки рассматривали в УФ-свете при длине волны 254 нм. В результате этого мы идентифицировали гиперозид и рутин.
В ходе дальнейших исследований флавоноидных соединений был применен метод ВЭЖХ [3].
Около 0,3 г (точная навеска) экстракта травы первоцвета помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 20 мл 70% спирта этилового, колбу помещали в ультразвуковую баню, содержимое перемешивали при температуре 50 °С в течение 15 мин. Объем раствора доводили до метки 70% спиртом этиловым.
Параллельно готовили серию 0,05% растворов стандартных образцов (РСО) фенольных соединений в 70% этиловом спирте.
Определение проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы «GILSON», модель 305 (Франция) с ручным инжектором RHEODYNE-7125 (USA) с последующей компьютерной обработкой результатов исследования, используя программу «МультиХром для «Windows». Детектирование осуществлялось с помощью УФ-детектора GILSON UV-VIS (модель 151). Хроматографическая колонка PLATINUM EPS C 18 100 A, 4,6x250 мм с размером частиц 5 мкм. Подвижная фаза - смесь метанол - вода - концентрированная фосфорная кислота в соотношении 400 : 600 : 5. Скорость подачи элюента - 0,5 мл/мин, рабочая длина волны -254 нм, объем пробы - 20 мкл, температура колонки комнатная, продолжительность анализа 90 мин.
В качестве стандартных растворов применяли 0,05% растворы флавоноидных соединений в этиловом спирте.
Идентификацию разделенных веществ проводили методом внутреннего нормирования пиков по сопоставлению площадей пика и времен удерживания со стандартными растворами (РСО).
В густом экстракте первоцвета лекарственного идентифицировали 6 флавоноидных соединений (табл. 2).
Таблица 2. Компонентный состав флавоноидов и времен удерживания в густом экстракте первоцвета лекарственного
Наименование РСО Время удерживания, мин Количественное соотношение, %
Кверцимеритрин 15,83 7,79
Рутин 23,98 5,29
Гиперозид 25,98 10,13
Витексин 30,04 2,67
Кверцетин 56,93 0,04
Апигенин 69,14 0,10
Количественное определение флавоноидов в густом экстракте проводили спектрофотометрическим методом. Основой метода анализа нами выбрана реакция взаимодействия флавоноидов с хлоридом алюминия в среде 70%-ного этилового спирта [2, 10].
Исследование компонентного состава экстракта показало, что преобладающими флавоноидными соединениями в нем являются рутин, гиперозид, кверцимеритрин, в качестве стандартного образца мы применили рутин-стандарт.
Нами исследованы спектры поглощения густого экстракта с хлоридом алюминия и рабочего стандартного образца рутина (РСО) с хлоридом алюминия по ТУ 64-4-127-96 НПО ВИЛАР. Эти спектры совпадали, а максимум поглощения находился при длине волны 410 нм. Измерения рекомендуем проводить в области максимума поглощения. Данная область спектра достаточно удалена от спектров поглощения сопутствующих фенольных и других органических веществ, содержащихся в экстрактах из сырья. В качестве раствора сравнения мы использовали исходный раствор извлечения без хлорида алюминия, т.е. применяли дифференциальный вариант спектрофотометрии, что позволяет исключить влияние на результаты анализа сопутствующих веществ. При проведении анализа пробы подкисляли уксусной кислотой для перевода флавоноидов и сопутствующих им веществ в недиссоциированную форму с целью улучшения воспроизводимости результатов.
Были также изучены оптимальные условия фотометрической реакции, количество спиртового раствора густого экстракта травы первоцвета весеннего, концентрация и объем алюминия хлорида. Максимальная оптическая плотность достигается при использовании 2 мл раствора густого экстракта травы первоцвета весеннего в 70%-ном этиловом спирте с 2 мл 2%-ного раствора хлорида алюминия в 70%-ном этиловом спирте.
Устойчивое окрашивание спиртового раствора густого экстракта с хлоридом алюминия наступает через 30 мин и сохраняется в течение 1,5 ч, что достаточно для проведения анализа.
На основании проведенных исследований разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в густом экстракте травы первоцвета весеннего.
0,25 г (точная навеска) экстракта травы первоцвета весеннего растворяли в 40 мл 70%-ного этилового спирта в мерной колбе вместимостью 50 мл. После полного растворения экстракта раствор в мерной колбе доводили 70%-ным этиловым спиртом до метки. 2 мл раствора экстракта травы первоцвета помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл. Извлечение фильтровали через бумажный фильтр, первые 10 мл фильтрата отбрасывали. 2 мл фильтрата помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 2 мл 2%-ного раствора хлорида алюминия в 70%-ном этиловом спирте, 0,1 мл 33% раствора уксусной кислоты и объем раствора доводили 70%-ным этиловым спиртом до метки. Через 30 мин измеряли оптическую плотность данного раствора на спектрофотометре при длине волны 410 нм в кварцевой кювете с толщиной слоя 1 см.
В качестве раствора сравнения использовали раствор, содержащий 2 мл раствора густого экстракта травы первоцвета весеннего, 0,1 мл 33%-ного раствора уксусной кислоты и 70%-ного этилового спирта до 25 мл [8].
Параллельно измеряли оптическую плотность РСО рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору.
Содержание суммы флавоноидов (%) в экстракте травы первоцвета вычисляли по формуле
D1 х A0 х V1 х V2 xV6 x 100 x 100
X —-----------------------------,
D0 x A xV3 x V4 xV5 x (100 - W)
где Dj - оптическая плотность испытуемого раствора, D0 - оптическая плотность РСО рутина, А0 - навеска РСО рутина, А - навеска экстракта, V1 - объем раствора экстракта - 50 мл, V2 - объем разведения аликвоты экстракта - 25 мл, V3 - объем аликвоты экстракта - 2 мл, V4 - объем раствора РСО рутина (100 мл), V5 -объем разведения аликвоты раствора РСО рутина (25 мл), V6 - объем аликвоты раствора РСО рутина (1 мл), W - потеря в массе при высушивании в % (12,2%).
Приготовление раствора РСО рутина. 0,05 г (точная навеска) РСО рутина (ТУ 64-4-127-96), высушенного при 130-140°С, растворяли при нагревании на водяной бане в 80 мл 70% этилового спирта в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводили объем раствора тем же растворителем после охлаждения до метки. Срок годности раствора 1 мес.
1 мл РСО рутина помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 2 мл 2%-ного раствора алюминия хлорида в 70%-ном этиловом спирте, 0,1 мл 33%-ного раствора кислоты уксусной и объем раствора доводили 70%-ным этиловым спиртом до метки. Измерения проводили аналогично испытуемому раствору [8].
Результаты исследования обработаны статистически согласно ГФ-Х1 [4]. Ошибка единичного определения с 95% вероятностью не превышает 4,25%. Содержание суммы флавоноидов в густом экстракте составляет 4,58% (табл. 3).
Таблица 3. Метрологическая характеристика методики определения суммы флавоноидов в густом экстракте травы первоцвета весеннего
n f Хср. S2 S P, % t (P,f) xCp.± Ax E, %
10 9 4,58 0,00743 0,08621 95 2,26 4,58±0,071 4,25
Выводы
1. Изучен качественный состав густого экстракта травы первоцвета весеннего методом тонкослойной хроматографии и ВЭЖХ.
2. В густом экстракте первоцвета лекарственного идентифицированы кверцимеритрин, рутин, гиперозид, витексин, кверцетин, апигенин.
3. Подобраны оптимальные условия и разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в густом экстракте первоцвета весеннего спектрофотометрическим методом. Данная методика может быть использована для стандартизации густого экстракта травы первоцвета весеннего по содержанию суммы флавоноидов.
Список литературы
1. Алексеев Е.Б., Габбасов К.К., Горчаковский П. Л., Кучеров Е.В. Определитель высших растений Башкирской АССР. М., 1989. С. 186.
2. Беликов В.В. Методы анализа флавоноидных соединений // Фармация. 1970. №1. С. 68.
3. Высокоэффективная газовая хроматография: Пер. с англ. / Под ред. К. Хайвер. М., 1993.
4. Государственная фармакопея СССР. Вып. 1. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. XI изд., доп. М., 1989. С. 199.
5. Государственная фармакопея СССР. Вып. 2. Общие методы анализа. XI-е изд., доп. М., 1987. 336 с.
6. Латыпова Г.М., Соколов Г.В., Гильмутдинова Л.Т., Романова З.Р., Михайлова А.Н., Габдулин Н.Т. Применение экстракта первоцвета весеннего в восстановительном лечении больных ИБС // Вестник восстановительной медицины. 2007. №2(20). С. 58-60.
7. Латыпова Г.М., Романова З.Р., Бубенчикова В.Н., Катаев В.А., Гильмутдинова Л.Т., Соколов Г.В. Исследование состава фенольных соединений первоцвета весеннего, произрастающего во флоре Башкортостана // Башкирский химический журнал. 2007. Т. 14. №5. С. 34-36.
8. Матющенко Н.В., Степанова Т.А. Стандартизация плодов рябины // Фармация. 2003. №5. С. 16-18.
9. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейства Paeoniaceae-Thymelaeaceae / Отв. ред. П. Д. Соколов. Л., 1986. С. 336.
10. Huck C.W., Huber C.G., Ongania K.H., Bonn G.K. Isolation and characterization of metoxylated flavones in the flowers of Primula veris by liquid сhromatography and mass spectrometry // Journal of chromatography. 2000. V. 870(1-2). №6. Р. 453.
Поступило в редакцию 13 марта 2009 г.
