CC BY
214
УДК 615.322:582.948.25
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЧЕСТВЕННОГО И КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОСТАВА ФЛАВОНОИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ МЕДУНИЦЫ НЕЯСНОЙ
В.С. КАЗАКОВА О.О. НОВИКОВ Д.И. ПИСАРЕВ
В статье приведены результаты качественного состава флавоноидов листьев медуницы неясной методом бумажной хроматографии. С достоверными образцами, идентифицированы рутин и цинарозид. Подобраны оптимальные условия и разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в листьях медуницы неясной спектрофотометрическим методом. Установлено, что содержание суммы флавоноидов составляет 0,33%-0,48%.
Н.Н. ШЕСТОПАЛОВА Д.А. ФАДЕЕВА
Белгородский государственный национальный исследовательский университет
Ключевые слова: флавоноиды, медуница неясная, рутин, цинарозид.
е-maib [email protected]
Введение. Актуальность использования лекарственных средств на основе растительного сырья неизмеримо возросла в последние десятилетия. Лечение растениями и фитопрепаратами прошло испытание временем и в настоящее время получило признание в медицине во всем мире. Существенным преимуществом растений перед синтезированными лекарственными средствами является наличие в них естественного комплекса биологически активных веществ в наиболее доступной и усвояемой форме, а также наиболее благоприятного для организма человека соотношения основных компонентов, свойственных живой природе в целом.
Это и предопределило резкое увеличение потребности в растительном лекарственном сырье, вызвало необходимость более пристального изучения естественных ресурсов, химического состава растительного сырья и рационального использования лекарственных растений в лечебных целях.
Наиболее продуктивным способом расширения номенклатуры лекарственного растительного сырья является исследование с доказательством возможности медицинского применения малоизученных видов растений, к числу которых относится медуница неясная (Pulmonaria obscura L.).
Медуница неясная (Pulmonaria obscura L.) — многолетнее травянистое растение семейства Бурачниковые (Boraginaceae) высотой 8-30 см, с толстым бурым корневищем и многочисленными придаточными корнями. Листья цельнокрайние, заостренные, короткожестковолосистые, иногда с беловатыми пятнами. Цветки на коротких цветоножках собраны в немногоцветковые, часто парные завитки, иногда собранные на верхушке стебля в щиток. Плод — сухой, состоящий из четырех орешков, заключенных в колокольчатую чашечку. Широко распространено в областях Центральной России, является официнальной в ряде стран и используется в качестве отхаркивающего, смягчающего, вяжущего антигеморрагического средств [4, 6].
На территории Центральной России произрастают медуница неясная, медуница узколистная, химический состав которых практически не изучен [5].
Целью настоящей работы явилось обоснование возможности использования листьев медуницы неясной в качестве перспективного источника флавоноидных соединений.
Для реализации поставленной цели необходимо было изучить качественный состав флавоноидов и определить их содержание в выбранном объекте.
Методики исследования. Объектом исследования служили прикорневые листья медуницы неясной (Pulmonaria obscura Dumort.)
На первом этапе исследований нами было проведено изучение качественного состава флавоноидов медуницы неясной. Для выделения суммы флавоноидов измель-
ченное воздушно-сухое сырье листьев медуницы неясной в количестве 50,0 г экстрагировали методом циркуляционной экстракции в аппарате Сокслета до полного истощения сырья. Полученное извлечение сгущали под вакуумом с помощью ротационного испарителя ИР-1, остаток растворяли в 4-кратном количестве воды очищенной и оставляли в холодильнике на 72 часа. Выпавший осадок липофильных веществ, отфильтровывали и полученную сумму обрабатывали в делительной воронке хлороформом. Маточник после экстрагирования хлороформом обрабатывали этилацетатом до обесцвечивания этилацетатного слоя. В дальнейшем для изучения флавоноидного состава использовали этилацетатное извлечение, которое упаривали под вакуумом в ротационном испарителе ИР-1. Полученный остаток растворяли в минимальном количестве спирта этилового 96% и сумму флавоноидов переосаждали хлороформом. Состав флаво-ноидов изучали методом бумажной хроматографии. Хроматографирование проводили на бумаге хроматографической Filtrek БЫ-11 в системах растворителей: 15% раствор кислоты уксусной, н-бутанол — кислота уксусная ледяная — вода (4:1:2), бензол — этилацетат — кислота уксусная ледяная (50:50:1) с достоверными образцами свидетелей флавоноидов. В качестве проявителя использовали пары аммиака и 2% раствор циркония хлорокиси в спирте этиловом 96% (реактив Херхаммера). [1]. Таким образом, было установлено наличие 4 веществ с Rf 0,05, Rf 0,10, 0,21, 0,31 в виде пятен с желтой флуорес-
ценцией, отнесенных к флавоноидным соединениям. С достоверными образцами идентифицировали лютеолин-7-глюкозид или цинарозид и рутин (рис. 1).
А — медуница неясная Б — цинарозид и рутин Система растворителей: сусная
15%
'о кислота
Ук-
Рис. 1. Схема бумажной хроматограммы спирто-водных извлечений из листьев медуницы неясной
Присутствие данных компонентов в составе листьев медуницы неясной подтверждено методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на основании совпадения времени удерживания анализируемых образцов и достоверно известных свидетелей флавоноидов.
В основу количественного определения флавоноидов в сырье в пересчете на лю-теолин-7-гликозид положен метод спектрофотометрического анализа в непосредственном извлечении из сырья, основанный на химическом взаимодействии флавонои-дов с алюминия хлоридом безводным в среде кислоты хлористоводородной разведенной с образованием окрашенных продуктов — хелатных комплексов. При этом максимум поглощения первой полосы смещается на 35-50 нм к видимой области (батохром-ный сдвиг), по сравнению с исходным флавоноидом. При добавлении кислоты хлористоводородной нестабильные комплексы в орто-дигидроксигруппах разрушаются, а
комплексы между карбонильной группой при С4 и гидроксильными группами при С3 и С5 сохраняются [3].
У спиртовых извлечений из исследуемых образцов максимум поглощения при добавлении А1С13+НС1 находился при 400 нм (рис. 2).
- А 1.0 —
0.0 —
0.6 —
0.4 —
0.2 —
0.0 —
_ Длина волны, ни
380 400 420 440
Рис. 2. УФ-спектр комплекса спиртового извлечения из листьев медуницы неясной с 5% спиртовым раствором алюминия хлорида
Аналогичный максимум поглощения отмечен для комплекса ГСО лютеолин-7-гликозида (цинарозида) с А1С13+НС1 [2].
Изучены условия извлечения флавоноидов из сырья, установлено, что оптимальным экстрагентом является спирт этиловый 70%. Соотношение сырья и общего объема экстрагента 1:100, время четырехкратного извлечения на кипящей водяной бане 120 минут.
Точную навеску сырья в количестве 1,0 г, измельченного до размера частиц 1-3 мм, помещали в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, прибавляли 25 мл спирта этилового 70%, колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Затем колбу охлаждали до комнатной температуры и содержимое фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Далее указанным выше способом экстракцию повторяли еще 3 раза тем же экстрагентом. Извлечения фильтровали в ту же мерную колбу. Объем фильтрата доводили до метки 70% спиртом. Полноту извлечения флавоноидов из сырья подтверждали отрицательной цианидиновой пробой.
2,5 мл полученного извлечения помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 5 мл 5% раствора алюминия хлорида в спирте этиловом 96% и 2 капли разведенной кислоты уксусной. Объем раствора доводили спиртом этиловым 96% до метки и оставляли на 45 минут. Оптическую плотность полученного раствора измеряли на спектрофотометре СФ-56 при длине волны 400 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
В качестве раствора сравнения использовали раствор, состоящий из 2,5 мл извлечения, 2 капель разведенной кислоты уксусной, и доводили спиртом этиловым 96% до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.
С целью пересчета содержания суммы флавоноидов на цинарозид использован удельный показатель поглощения, заимствованный из литературных источников. Согласно найденным данным удельный показатель поглощения комплекса раствора ГСО цинарозида с алюминия хлоридом при аналитической длине волны 400 нм составляет 145,0±2,3. На этом основании в формулу расчета включено теоретическое значение Е1%1см = 145.
Расчет полученных результатов вели по формуле:
х = Лх х Ж х Ж2 Е% х т х V ,
где Ах— оптическая плотность исследуемого раствора; Ш, — разведения, мл;
Е — удельный показатель поглощения стандартного раствора цинарозида, равный 145; т — масса навески исследуемого сырья, г; Va — объем аликвоты, мл.
Результаты исследования и обсуждение. Результаты статистической обработки данных 7 параллельных измерений показали, что содержание флавоноидов в листьях медуницы неясной в пересчете на лютеолин-7-глюкозид (цинарозид) составило 0,485±0,016%, ошибка единичного определения при доверительной вероятности 95% находилась в пределах ±3,4% (см. табл.).
Таблица
Результаты количественного определения суммы флавоноидов в листьях медуницы неясной в пересчете на лютеолин-7-гликозид
X (%) X - X. 1 (X - Xt )2 Метрологические характеристики
0,47 0,015 0,000225 X — 0,485% 2( x - x >■ -0,001775
0,49 0,005 0,000025
0,49 -0,005 0,000025 s, -IHi-x)2 - 1 «(« 1) 0,0065 Дх - sx ■ tx - 6 x x 0,016 є = 3,44%
0,51 -0,025 0,000625
0,46 0,025 0,000625
0,50 -0,015 0,000225
0,48 0,005 0,000025
Х= 0,485 £=0,001775
Таким образом, на данном этапе химических исследований листьев медуницы неясной удалось установить наличие двух флавоноидов — лютеолин-7-глюкозида (цинарозида) и рутина методом бумажной хроматографии, что нашло подтверждение в результатах высокоэффективной жидкостной хроматографии. Определено количественное содержание флавоноидов в исследуемом сырье в пересчете на лютеолин-7-глюкозид, которое составило 0,485±0,016%.
Таким образом, на основании полученных результатов можно утверждать о перспективности данного сырья как источника флавоноидов и рекомендовать его для дальнейших химических и фармакологических испытаний.
Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, Государственный контракт № П425 от 12 мая 2010 г., тема проекта: ««Разработка методик выделения и определения полифенольных соединений классов фитоалексинов, каро-тиноидов и антоцианов и технологии создания лекарственных форм на их основе».
Литература
1. Бандюкова, В.А. Тонкослойная хроматография флавоноидов / В.А. Бандюкова, А.А. Шинкаренко // Химия природных соединений. — 1983. — №1. — С.20
2. Беликов, В.В. Реакции комплексообразования в анализе флавоноидов / В.В. Беликов, Т.В. Точкова // Фенольные соединения и их физиологические свойства. — Алма-Ата, 1973. — С. I68-172.
3. Беликов В.В. Методы анализа флавоноидных соединений / В.В. Беликов, М.С.Шрайбер // Фармация. — 1970. — № 1. — С. 68-72.
4. Иллюстрированный определитель растений Средней России / И.А. Губанов, К.В. Ки-силева, В.С. Новиков, В.Н. Тихомиров. — М. : Тов-во науч. изданий КМК, Ин-т технолог. исследований, 2002. — Т.3. — С.104-105.
5. Полуянов, А.В. Сосудистые растения Курской области : учебное пособие/ А.В. Полуянов, Н.А. Прудников. — Курск: КГУ, 2005. — 80 с.
6. British Herbal Pharmacopoeia — Bournemouth, ВПМА, 1983. — 212 p.
QUALITATIVEAND QUANTITATIVE DETERMINATION OF PULMONARIA OBSCURA S FLAVONOID COMPOUNDS
V.S. KAZAKOVA O.O. NOVIKOV D.I. PISAREV N.N. SHESTOPALOVA D.A. FADEEVA
Belgorod National
Research University
e-mail: [email protected]
Qualitative composition of flavonoids of Pulmonaria obscura's leaves was studied by paper chromatography. Rutin and cinarozide were identified there. Optimum conditions and methodology to quan- tify the amount of flavonoids in leaves of Pulmonaria obscura by spec- trophotomric method are selected. It is estimated that the amount of flavonoids is 0,33% - 0,48%.
Key words: flavonoids, Pulmonaria obscura, rutin, cinarozide.
