CC BY
56
УДК 615.072/322:635.781
Е. Н. Серобян (асп.)1, А. А. Маркарян (д.фарм.н., проф., зав.каф.)1, Т. Д. Даргаева (д.фарм.н., проф., гл.н.с.)2, К. А. Пупыкина (д.фарм.н., проф.)3
ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В ДИУРЕТИЧЕСКОМ СБОРЕ
1 Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова,
кафедра фармации 119991, г. Москва, ул. Большая Пироговская, д.2, стр.4; тел.8 (495) 6562585 2Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений,
отдел стандартизации и сертификации 117216, г. Москва, ул. Грина, 7; тел. 8(495) 3827377 3Башкирский государственный медицинский университет, кафедра фармакогнозии 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3; тел. 8(347) 2712285, e-mail:[email protected]
E. N. Serobyan1, A. A. Markaryan1, T. D. Dargaeva2, K. A. Pupykina3
EVALUATION OF THE CONTENT OF PHENOLIC COMPOUNDS CONTAINED IN SPECIES DIURETICA
1 First Moscow State Medical University of I. M. Sechenov
2, Bolshaya Pirogovskaya Str, str. 4, 119991, Moscow; ph. 8(495) 6562585
2All-Russian Research Institute of Medicinal and Aromatic Plants 7, Grina Str., 117216, Moscow; ph. 8 (495) 3827377 3Bashkir State Medical University
3, Lenina Str., 450000, Ufa; ph.8(347) 2724173, e-mail:[email protected]
Идентифицированы фенольные соединения, содержащиеся в диуретическом сборе, а также определение количественного содержания флаво-ноидов методом дифференциальной спектрофо-тометрии. Для качественной оценки содержания фенольных соединений применяли метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). На основании проведенных исследований с использованием растворов стандартных образцов флавоноидов и оксикорич-ных кислот по временам удерживания идентифицировано 17 фенольных соединений. Апробирована методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин методом спектрофотометрии, основанным на взаимодействии флавоноидов со спиртовым раствором хлорида алюминия. Установлено, что содержание суммы флавоноидов в сборе в пересчете на лютеолин-стандарт должно составлять не менее 0.8%.
Ключевые слова: высокоэффективная жидкостная хроматография; диуретический сбор; качественный состав; количественное определение; лютеолин; спектрофотометрия; фенольные соединения; флавоноиды.
In the article information on identification of phenol compounds contained in species diurética and determination of the quantitative contents of flavonoids by the differential spectrophotometry method is reviewed. For qualitative estimation of the contents of phenol compounds was used the method of high-perfomance liquid chromato-graphy. On the base of investigations with use of solution standard sample flavonoids and oxycorics acids at whiles hold are identified 17 phenol compounds. The method of the quantitative determination of the amount flavonoids in recalculation on luteolin method spectrophoto-metry founded on interaction flavonoids with alcohol solution aluminum chloride is approved. The contents of the amount flavonoids in collection in recalculation on luteolin-standard must form not less 0.8%.
Key words: species diuretica; high-perfomance liquid chromatography; spectrophotometry; qualitative composition; phenol compounds; flavonoids; quantitative determination; luteolin.
Дата поступления 12.07.15
Одной из актуальных задач медицины является изыскание новых источников получения препаратов растительного происхождения, применяемых для комплексного лечения хронических заболеваний. Использование лекарственных растений имеет ряд преимуществ перед фармакотерапией, так как их биологически активные вещества легко включаются в различные процессы жизнедеятельности, обладают хорошей биодоступностью и минимальными побочными эффектами. Воспалительные процессы в области мочевыделитель-ной системы отличаются тяжелым течением, склонностью к рецидивам и развитию осложнений. Сочетание традиционных методов лечения с фитотерапией данной группы заболеваний оказывает положительную динамику и повышает эффективность лечения. Фенольные соединения лекарственных растений представлены веществами различных химических групп — это фенилпропаноиды, фенолкарбо-новые и оксикориченые кислоты, флавоноиды и др., которые обладают разносторонними видами фармакологической активности 1. Таким образом, изучение комплекса фенольных соединений, входящих в состав разработанного нами диуретического сбора, является актуальной задачей.
Целью исследования является идентификация фенольных соединений, содержащихся в диуретическом сборе, а также разработка методики их количественного определения.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования служил диуретический сбор, содержащий три вида сырья: цветки бузины, плоды рябины, траву хвоща. Исходный состав лекарственного растительного сырья данного сбора, доля каждого компонента выбраны и предложены с учетом данных по действию каждого компонента композиции на организм. Фенольные соединения из сырья извлекали в процессе экстракции 70%-ным этиловым спиртом при нагревании на водяной бане.
Изучение качественного состава феноль-ных соединений проводили методом хроматографии в тонком слое сорбента (пластинки К1е$е\де\ 60 Б254 размером 20x20 см, в качестве подвижной фазы — смесь растворителей: хлороформ—этилацетат—метанол—5% раствор уксусной кислоты в воде в соотношении 20:20:20:5). В качестве растворов сравнения использовали 0.05% растворы стандартных образцов рутина, кверцетина, лютеолина, лютео-лин-7-гликозида, гиперозида в растворе 70%-
ного этилового спирта. Пластины с нанесенными пробами помещали в камеру и хроматогра-фировали восходящим способом (длина пробега растворителей 10 см). Хроматограмму высушивали и опрыскивали 5% раствором AlCl3 в 95%-ном этиловом спирте, нагревали в сушильном шкафу при температуре 100—105 оС в течение 5 мин. Идентификацию фенольных соединений проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе «Gilson», модель 305 — металлическая колонка 4.66x250 мм и неподвижная фаза Kromasil C18 c размером частиц 5 мкм. В качестве подвижной фазы — метанол—вода—фосфорная кислота концентрированная в соотношении 400:600:5. Анализ проводили при комнатной температуре. Скорость подачи элюента 0.8 мл/мин. Продолжительность анализа 70 мин. Детектирование проводилось с помощью УФ-де-тектора при длине волны 254 нм. По 20 мкл исследуемых растворов и растворов сравнения вводили в хроматограф и хроматографировали. Затем проводили компьютерную обработку результатов исследования с помощью программы Мультихром для Windows. Количественное определение флавоноидов проводили методом спектрофотометрии на спектрофотометре марки Helios, основанном на взаимодействии флавоно-идов со спиртовым раствором хлорида алюминия. Содержание суммы флавоноидов рассчитывали в пересчете на лютеолин, используя в качестве рабочего стандартного образца раствор лю-теолина в 70%-ном этиловом спирте, определение проводили при длине волны 408 нм.
Результаты и их обсуждение
Проведенные исследования спирто-водно-го извлечения из сбора методом ТСХ показали, что на хроматограмме в исследуемом растворе обнаружено 6 зон адсорбции, окрашенных в желто-коричневый цвет с Rf ~ 0.27 (не-идентифицирована); Rf ~ 0.32 (неиденти-фицирована), Rf ~ 0.37 (рутин); Rf ~ 0.44 (ги-перозид); Rf ~ 0.73 (лютеолин); Rf ~ 0.87 (кверцетин). Сравнение значений Rf зон адсорбции в анализируемом растворе с таковыми у свидетелей стандартных образцов феноль-ных соединений позволяют идентифицировать следующие вещества — рутин, гиперозид, лю-теолин и кверцетин.
Для достоверного подтверждения качественного состава фенольного комплекса диуретического сбора применяли метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) 2. Параллельно готовили серию 0.05% растворов
Таблица 1
Результаты идентификации фенольных соединений в сборе диуретическом
О) 1= Время, мин Высота, мВ Площадь, мВ-с Концентрация (внутр. норм.) Соединение
1 3.164 140.90 1883.14 2.39 танин
2 3.434 516.04 13820.69 17.56 кислота галловая
3 4.262 163.63 1906.46 2.42 кислота изоферуловая
4 4.442 180.04 5054.48 6.42 эпигаллокатехи н галлат
5 5.373 343.57 8813.69 11.20 кислота хлорогеновая
6 6.106 154.55 6890.40 8.75 кислота цикориевая
7 7.582 62.51 3152.87 4.01 кислота неохлорогеновая
8 8.586 149.12 6181.82 7.85 дигидрокумарин
9 10.12 30.62 1315.13 1.67 дигидрокверцетин
10 10.95 24.32 2142.16 2.72 не идентифицировано
11 13.1 12.57 647.76 0.82 феруловая кислота
12 14.26 19.92 767.79 0.98 не идентифицировано
13 14.84 20.64 1617.11 2.05 лютеолин
14 16.88 8.20 646.46 0.82 кумарин
15 18.54 7.35 807.84 1.03 гиперозид
16 23.14 187.82 16660.51 21.17 рутин
17 27.85 19.81 2156.99 2.74 не идентифицировано
18 29.63 12.61 1027.39 1.31 коричная кислота
19 32.14 5.83 393.31 0,50 о-метоксикумарин
20 34.86 2.37 108.25 0.14 не идентифицировано
21 36.93 2.42 166.15 0.21 кверцетин
22 39.09 8.02 859.80 1.09 не идентифицировано
23 43.18 14.34 1687.65 2.14 не идентифицировано
сравнения в 70% этиловом спирте: рутина, кверцетина, лютеолина, лютеолин-7-гликози-да, галловой кислоты, кофейной кислоты, хло-рогеновой кислоты, цикориевой кислоты, коричной кислоты, неохлорогеновой, гиперози-да, геспередина, апигенина, феруловой кислоты, эпикатехина, дигидрокверцетина, кемпфе-рола, эскулетина,танина, эпигаллокатехингал-лата. Идентификацию проводили путем сопоставления времен удерживания компонентов смеси и растворов сравнения. Результаты исследования представлены в табл. 1.
Анализируя полученные результаты, можно отметить, что в диуретическом сборе содержатся 17 биологически активных веществ, относящихся к фенольным соединениям.
Количественное определение флавонои-дов проводили методом, основанным на взаимодействии флавоноидов со спиртовым раствором хлорида алюминия и последующем спектрофотометрировании полученного окрашенного комплекса. Для уточнения аналитической длины волны нами были сняты спектры поглощения комплекса спиртового извлечения из сбора и раствора лютеолина СО. Согласно полученным данным комплексы РСО лютеолина и извлечения из сбора с хлоридом алюминия имеют аналогичную кривую и максимум поглощения при длине волны: для лютеолина СО 407±5 нм (рис. 1), для извлечения из сбора — 408±5 нм (рис. 2). Поэтому нами для аналитических целей была выбрана длина волны 408 нм.
Рис. 1. Спектр оптического поглощения комплекса лютеолина СО с хлоридом алюминия
Рис. 2. Спектр оптического поглощения комплекса извлечения из сбора с хлоридом алюминия
Методика определения: около 0.05 г (точная навеска) лютеолина СО растворяли в мерной колбе вместимостью 100 мл в 50 мл 70%-го спирта этилового и доводили тем же спиртом до метки, перемешивали (стандартный раствор). Около 5.0000 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в колбу объемом 200 мл, прибавляли 50 мл 70%-го этилового спирта, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 ч с момента закипания спирто-водной смеси в колбе. Экстракцию повторяли еще раз. После охлаждения смесь фильтровали в мерную колбу объемом 100 мл через бумажный фильтр и объем доводили растворителем до метки (испытуемый раствор). В мерную колбу вместимостью 25 мл помещали 1 мл испытуемого раствора, прибавляли 2 мл 2%-го раствора хлорида алюминия в 95%-ном спирте этиловом и доводили объем тем же спиртом до метки, перемешивали и через 40 мин измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 408 нм в кювете с толщиной слоя жидкости 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали следующий раствор: в мерную колбу вместимостью 100 мл помещали 1 мл испытуемого раствора 0.1 мл уксусной кислоты разведенной и доводили 95%-ным этиловым спиртом до метки (раствор должен быть свежеприготовленным). Параллельно измеряли оптическую плотность раствора лютео-лина СО, приготовленного аналогично испытуемому раствору в мерной колбе вместимостью 25 мл.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин и высушенное вещество в процентах (Х) вычисляли по формуле: X _ D ■ m-100-100-100 _ D0 ■ m0-100 ■ (100 - W) ,
где D — оптическая плотность испытуемого раствора;
D0 — оптическая плотность раствора лютеолина СО;
m - масса навески сбора, г;
m0 - масса лютеолина СО, г;
W - потеря в массе при высушивании, %.
Результаты проведенных исследований представлены в табл. 2.
Таблица 2
Результаты количественного определения суммы флавоноидов в сборе в пересчете на лютеолин
Масса сбора, г Найдено флавоноидов, %
5.0245 0.95
5.0163 0.97
5.0089 0.93
5.0054 0.97
5.0017 0.93
Метрологические характеристики методики количественного определения флавоноидов приведены в табл. 3.
Таблица 3 Метрологические характеристики результатов количественного определения флавоноидов в сборе в пересчете на лютеолин
n f P, % t (P,f) Хср, % S2 S ДХСр Еср, %
5 4 95 2.78 0.95 0.0004 0.02 0.025 2.63
Достоверность предложенной методики определения суммарного содержания флаво-ноидов подтверждена опытами с добавками стандартного образца лютеолина (табл. 4).
Относительная ошибка опытов с добавками находится в пределах случайной ошибки предложенной методики, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки. Анализируя полученные результаты, можно отметить, что содержание суммы флавоноидов в диуретическом сборе в пересчете на лютеолин-стандарт должно составлять не менее 0.8%.
Таким образом, в результате качественной оценки идентификации фенольных соединений в диуретическом сборе установлено, что флаво-ноидов в нем должно быть не менее 0.8%.
Таблица 4
Результаты количественного определения флавоноидов в сборе с добавками лютеолина
Содержание флавоноидов в навеске, мг Добавлено лютеолина, мг Должно быть, мг Найдено лютеолина, мг Ошибка
абсолютная, мг относительная, %
0.55 0.1 0.65 0.645 -0.005 -0.77
0.55 0.2 0.75 0.745 +0.005 -0.67
0.55 0.3 0.85 0.854 +0.004 +0.47
Литература
References
1. 2.
Пронченко Г.Е. Лекарственные растительные средства.- М.: ГЭОТАР-МЕД.- 2002.- 228 с.
Беликов В.В. Применение ВЭЖХ в анализе флавоноидных препаратов // Проблемы стандартизации и контроля качества лек. средств.-1991.- Т.2, Ч.2.- С.14-15.
1.
2.
Pronchenko G.E. Lekarstvennye rastitel'nye sredstva [Medicinal herbal remedies]. Moscow, GEOTAR-MED Publ., 2002, 228 p. Belikov V.V. Primenenie VEZhKH v analize fla-vonoidnykh preparatov. [Application of HPLC analysis of flavonoid preparations]. Problemy standartizatsii i kontrolya kachestva lekarstven-nykh sredstv [Problems to standardizations and checking quality of herbal remedies], 1991, v.2, p.2, pp.14-15.
