Качественный анализ и разработка методики количественного определения флавоноидов в видах монарды, интродуцируемых в Республике Башкортостан Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

3. Природные флавоноиды / Д.Ю. Корулькин [и др.]. - Новосибирск: Академическое изд-во "Гео", 2007. - 232 с.

4. Рыжов, В.М. Изучение подходов вторичной переработки плодоножек лимонника китайского [Электронный ресурс] / В.М. Рыжов, О.Г. Алексеева // Известия Самарского научного центра Российской академии наук - 2013. - № 3-6. URL: http://www.ssc.smr.ru/media/journals/izvestia/2013/2013_3_1933_1936.pdf

5. Тонкослойная хроматография в анализе флавоноидов растительных объектов / А.А. Мальцева [и др.] // Фармация. - 2013. -№ 1. - С.13-16.

УДК 615.322

© Е.В. Красюк, К.А. Пупыкина, 2016

Е.В. Красюк, К.А. Пупыкина КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ И РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В ВИДАХ МОНАРДЫ, ИНТРОДУЦИРУЕМЫХ В РЕСПУБЛИКЕ БАШКОРТОСТАН

ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Уфа

В статье представлены результаты изучения качественного и количественного состава флавоноидов в различных видах монарды, интродуцируемой в Республики Башкортостан.

В результате хроматографического анализа водно-спиртовых растворов травы монарды обнаружены лютеолин, нарин-генин, лютеолин-7-глюкозид, гиперозид, рутин, катехин, галловая и хлорогеновая кислоты. Подобраны оптимальные условия для количественного определения флавоноидов изучаемого растения: концентрация этилового спирта, соотношение сырья и экстрагента, время экстракции, степень измельченности и концентрация комплексообразующей добавки. Наилучшим экстрагентом для монарды трубчатой является спирт этиловый в концентрации 50%, для монарды двойчатой - 40%, для монарды гибридной - 40%, для монарды лимонной - 70%, оптимальное время экстракции 30 минут, степень измель-ченности 1 мм. Установлено, что доминирующим веществом является лютеолин, на который и вели пересчет.

Ключееые слова: монарда трубчатая, монарда двойчатая, монарда гибридная, монарда лимонная, монарда Рассела, лю-теолин, тонкослойная хроматография, дифференциальная спектрофотометрия.

E.V. Krasyuk, K.A. Pupykina QUALITATIVE ANALYSIS AND DEVELOPMENT OF METHODS OF QUANTIFICATION OF FLAVONOIDS IN MONARDA SPECIES INTRODUCED IN THE REPUBLIC OF BASHKORTOSTAN

The article presents the results of the study of qualitative and quantitative composition of flavonoids in various species of Mo-narda, introduced in the Republic of Bashkortostan.

Chromatography of Monarda herb water-alcohol solution revealed the presence of luteolin, naringenin, luteolin-7-glucosid, hyperoside, rutin, catechin, gallic and chlorogenic acids. Optimal conditions for the quantification of flavonoids in the studied plants have been determined: the concentration of the ethyl alcohol, the ratio of raw material and extracting agent, extraction time, the degree of grinding and concentration of complexing additives. The best extractant for Monarda fistulosa is ethyl alcohol in a concentration of 50%, for Monarda didyma - 40%, for Monarda hybrid - 40%, for Monarda citriodora - 70%, the optimum extraction time is 30 minutes, fineness - 1 mm. It was found that the dominant material is luteolin, which was used as equivalent.

Key words: Monarda fistulosa, Monarda didyma, Monarda hybrid, Monarda citriodora, Monarda Russell, luteolin, thin layer chromatography, differential spectrophotometry.

Флавоноиды являются ценными группами биологически активных веществ (БАВ), так как обладают различными видами фармакологической активности (антиоксидантной, капилляроукрепляющей и др.), влияют на периферическое кровообращение, способствуют нормализации липидного состава крови, повышают абсорбцию витамина С в тонком кишечнике [1].

Монарда - перспективное эфиромас-личное растение семейства губоцветных (Lamiaceae), которое содержит разнообразные группы биологически активных веществ: фла-воноиды, антоцианы, каротиноиды, витамины В1, В2, аскорбиновую кислоту, горечи, дубильные вещества, большое количество эфирных масел (около 2,4% из расчета на сухой вес). В эфирном масле монарды идентифици-

ровано около сорока компонентов, основной из них - тимол (50-60%) [2, 3, 4].

Целью работы являются изучение качественного состава и разработка методики количественного определения флавоноидов в различных видах монарды методом дифференциальной спектрофотометрии.

Материал и методы

В качестве объектов исследования использовали образцы сырья интродуцируемых видов монарды: монарда трубчатая (Monarda fistulosa L.), монарда двойчатая (Monarda didyma L.), монарда гибридная (Monarda hybrida hort.), монарда лимонная (Monarda citriodora) и монарда Рассела (Monarda russeliana), выращенные в Ботаническом саду-институте Уфимского научного центра Российской академии наук.

Первоначально нами был изучен качественный состав фенольных соединений методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) с использованием хроматографических пластинок <^огЬШ ПТСХ-П-А-УФ» размером 20x20см.

Для получения извлечения использовали 70% этиловый спирт. В качестве подвижной фазы использовали смесь растворителей: этилацетат - уксусная кислота - вода (5:1:1). В качестве аутентичных веществ для идентификации использовали растворы стандартных образцов лютеолина, рутина, нарингенина, кверцетина, лютеолин-7-гликозида, галловой и хлорогеновой кислот, катехина. Для проявления хроматограмм использовали 5% спир-товый раствор алюминия хлорида, просматривали в видимом и УФ-свете при длинах волн 254 и 365 нм [3].

Количественное определение флавоно-идов проводили методом дифференциальной спектрофотометрии в ультрафиолетовой области излучения на спектрофотометре 8кы-madzu иУ-1800 с подбором оптимальных параметров определения: экстрагент, соотношение сырья и экстрагента, стпепень измельчен-ности сырья, время, кратность экстракции и условия проведения реакции комплексообра-зования. Статистическая обработка данных проводилась в соответствии с требованиями ГФ XI издания.

Результаты и обсуждение

В результате проведения хроматогра-фического анализа водно-спиртовых растворов травы монарды методом ТСХ обнаружено 9 зон адсорбции, из которых 5 имеют желто-зеленое свечение в УФ-свете и соответствуют флавоноидам: с Я/- 0,96 (лютеолин), Я/- 0,80 - 0,83 (нарингенин), Я/- 0,72 - 0,74 (лютео-лин-7-глюкозид), Я/- 0,60 - 0,62 (гиперозид), Я/~ 0,37 - 0,41 (рутин). Зона адсорбции, окрашенная в черный цвет (Я/ -0,91) при сравнении со стандартом идентифицирована как галловая кислота, зона, окрашенная в темно-серый (Я/- 0,94) - как катехин, зона, окрашенная в голубой цвет (Я/ - 0,48) - как хлорогеновая кислота (рис. 1).

В ходе эксперимента при разработке методики количественного определения фла-воноидов в траве монарды был использован метод дифференциальной спектрофотометрии с подбором оптимальных условий проведения. Для выбора преобладающего компонента в составе флавоноидного комплекса, нами были изучены спектры поглощения водно-спиртовых растворов монарды без и с добав-

лением комплексообразующей добавки, установлены положение максимумов поглощения и батохромный сдвиг при добавлении спиртового раствора алюминия хлорида.

Ш«к

4 5

Рис. 1. Хроматограмма спиртовых извлечений из травы монарды в УФ-свете: 1-монарда трубчатая; 2- монарда двойчатая; 3-монарда гибридная; 4-монарда лимонная; 5- монарда Рассела

Анализируя полученные результаты, установили, что комплекс флавоноидов с раствором алюминия хлорида в извлечениях из травы монарды имеет более близкие значения максимума поглощения с максимумом поглощения комплекса лютеолина с алюминием хлорида (^тах 398 - 400 нм) (рис. 2). Таким образом, при разработке методики за аналитическую длину волны приняли 398 нм и количественное содержание суммы флавонои-дов определяли в пересчете на лютеолин.

Рис. 2. УФ-спектр лютеолина (2) и извлечения из травы монарды (1) при добавлении спиртового раствора алюминия хлорида

При подборе оптимальных условий экстракции флавоноидов из различных видов монарды изучались следующие факторы: тип экстрагента, соотношение сырья и экстраген-та, время экстракции и кратность.

При изучении влияния экстрагента на выход флавоноидов был использован спирт этиловый различной концентрации (табл. 1).

Таблица 1

Влияние экстрагента на извлечение флавоноидов из травы монарды_

Концентрация спирта этилового, % Количественное содержание флавоноидов, %

М. трубчатая М. двойчатая М. гибридная М. лимонная М. Рассела

40 1,62 ±0,06 1,97±0,09 1,96±0,04 1,54±0,05 1,60±0,04

50 1,74±0,07 1,93±0,08 1,88±0,02 1,58±0,05 1,62±0,03

70 1,41±0,05 1,82±0,07 1,73±0,08 1,69±0,04 1,67±0,06

80 1,31±0,05 1,85±0,07 1,64±0,06 1,49±0,06 1,51±0,04

90 0,97±0,08 1,45±0,08 1,44±0,08 1,32±0,03 1,49±0,04

Установлено, что оптимальным экстра-гентом для монарды трубчатой является спирт этиловый в концентрации 50%, для монарды двойчатой и гибридной - 40%, для монарды лимонной и Рассела - 70%.

При выборе оптимальной степени из-мельченности использовали сырье, проходящее сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм; 2 мм; 3 мм (табл. 3). Исходя из полученных данных было установлено, что максимальное извлечение флавоноидов из травы монарды

Следующим этапом было определение соотношение сырья и экстрагента (табл. 2). В результате было установлено, что оптимальное извлечение флавоноидов достигается при соотношении сырья и экстрагента 1:30.

Таблица 2

достигается при использовании сырья, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм.

Следующим этапом было изучение времени и кратности экстракции. Результаты исследования представлены в табл. 4 и на рис. 3.

Таблица 3

Влияние степени измельченности сырья на извлечение флавоноидов из травы монарды

Измельченность Количественное содержание, %

сырья, мм М. трубчатая М. двойчатая М. гибридная М. лимонная М. Рассела

1 1,83±0,06 1,80±0,07 1,72±0,08 1,57±0,08 1,45±0,07

2 1,76±0,05 1,64±0,07 1,62±0,07 1,49±0,04 1,37±0,08

3 1,44±0,04 1,60±0,05 1,54±0,02 1,27±0,04 1,34±0,07

одиокрншая зкстрякцця

||н'лк[тп;ан экстракция

^—М.труочатия М,ШЙЧаПШЯ МЛиЫЯа ^—М.гибр идная ^¡^Млимонн ая

Рис. 3. Влияние кратности экстракции на извлечение флавоно-идов из травы монарды

Таким образом, наиболее полное извлечение флавоноидов из травы различных видов

монарды наблюдается при двукратной экстракции, которую целесообразно проводить по 30 минут.

Для установления оптимальных параметров комплексообразования при определении содержания флавоноидов, были изучены концентрация спиртового раствора алюминия хлорида и его количество, добавляемое к извлечению (табл. 5).

Нами также было изучено время реакции комплексообразования и установлено, что реакция развивается в течение 40 минут и комплекс остается стабильным в течение часа.

Метрологические характеристики методики количественного определения флавоно-идов в траве монарды приведены в табл. 6. Установлено, что ошибка опыта не превышает предельно допустимых значений.

Таблица 4

Влияние времени экстракции на извлечение флавоноидов из травы монарды

Время экстракции флавоноидов, мин Количественное содержание, %

М. трубчатая М. двойчатая М. гибридная М. лимонная М. Рассела

15 1,68±0,10 1,63±0,07 1,78±0,04 1,43±0,08 1,75±0,09

30 1,74±0,09 1,97±0,06 1,96±0,06 1,62±0,08 1,80±0,09

45 1,70±0,09 1,86±0,05 1,82±0,04 1,54±0,07 1,79±0,08

60 1,65±0,08 1,85±0,07 1,80±0,06 1,47±0,06 1,69±0,04

Влияние соотношения сырье: экстрагент на извлечение флавоноидов из травы монарды

Соотношение сырье: экстрагент Количественное содержание флавоноидов, %

М. трубчатая М. двойчатая М. гибридная М. лимонная М. Рассела

1:30 1,94±0,06 1,95±0,07 1,88±0,08 1,62±0,08 1,65±0,07

1:50 1,62±0,05 1,46±0,07 1,62±0,07 1,52±0,04 1,67±0,08

1:100 1,38±0,04 1,37±0,05 1,36±0,02 1,27±0,04 1,24±0,07

1:150 1,23±0,07 1,19±0,05 1,28±0,04 1,13±0,07 1,14±0,04

Таблица 6

Таблица 5

Влияние концентрации и количества добавляемого алюминия хлорида на реакцию комплексообразования_

Показатель Количественное содержание флавоноидов, %

М. трубчатая М. двойчатая М. гибридная М. лимонная М. Рассела

Концентрация А1С1з

1% р-р А1С1з 1,57±0,058 1,6з±0,0з2 1,52±0,0з1 1,62±0,056 0,96±0,0з2

2% р-р А1С1з 1,52±0,061 0,97±0,026 1,48±0,028 1,4з±0,051 0,9з±0,0з1

3% р-р А1С1з 1,З6±0,046 0,90±0,022 1,42±0,0з4 1,55±0,047 0,90±0,02з

5%р-р А1С1з 1,з1±0,045 0,75±0,0з5 1,29±0,024 1,42±0,050 0,75±0,0з2

10%р-р А1С1з 1,з1±0,052 0,65±0,0з7 1,26±0,02з 1,44±0,048 0,65±0,029

Количество А1С1з, добавленного в раствор

1 мл 1,59±0,068 1,68±0,042 1,48 ±0,0з 1,54±0,047 1,10±0,0з

2 мл 1,42±0,061 1,2з±0,026 1,24±0,018 1,з7±0,069 0,87±0,042

3мл 1,27±0,058 1,16±0,047 1,17±0,019 1,29±0,02з 0,81±0,0з7

5 мл 1,16±0,0з6 1,1з±0,042 1,14±0,0з5 1,18±0,050 0,75±0,029

Метрологическая характеристика методики количественного определения _суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин в траве монарды_

Исследуемый объект f X s2 х Р,% КР,/) Е £,%

М. трубчатая 5 1,57з 0,0000з8 0,0062 95 2,57 0,016 1,0з

М. двойчатая 5 1,6з1 0,000065 0,0080 95 2,57 0,021 2,26

М. гибридная 5 1,524 0,0001з2 0,0114 95 2,57 0,029 1,9з

М. лимонная 5 1,619 0,000089 0,0094 95 2,57 0,024 1,50

М. Рассела 5 0,905 0,000119 0,0109 95 2,57 0,028 з,09

На основании проведенных исследований предложена следующая методика количественного определения флавоноидов в траве монарды: около 0,5 г (точная навеска) сырья, измельченного до размера частиц 1 мм, помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл и добавляют 30 мл спирта этилового соответствующей концентрации. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на водяной бане в течение 30 мин. Извлечение фильтруют, избегая попадания частиц сырья на фильтр, в мерную колбу вместимостью 50 мл. Затем экстракцию повторяют ещё раз, заливают сырье 20 мл экстраген-та, кипятят 30 минут и фильтруют в ту же мерную колбу, доводят объем извлечения до метки этим же растворителем (раствор А).

1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл 1% раствора хлорида алюминия в 95% этиловом спирте, доводят объем раствора 95% этиловым спиртом до метки и перемешивают (раствор Б). Через 40 мин измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 398 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, содержащий 1 мл исследуемого извлечения, 1 каплю хлористоводородной кислоты, который доводят до общего объема 25 мл 95% этиловым спиртом.

Параллельно измеряют оптическую плотность государственного стандартного образца (ГСО) лютеолина: 1 мл 0,05% спиртового раствора ГСО лютеолина помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл 1% раствора хлорида алюминия в 95% этиловом спирте, доводят объем раствора

95% этиловым спиртом до метки и перемешивают. Измерения проводят аналогично испытуемому раствору.

Содержание суммы флавоноидов (Х) в пересчете на лютеолин в процентах вычисляют по формуле:

100

Х-- I

Б;,* Я! Л'з' V;- (ШОЛГ)

где: D1 - оптическая плотность испытуемого раствора;

D0 - оптическая плотность ГСО лютеолина; а - навеска сырья, г;

V - объем полученного экстракта сбора (50 мл); V2 - объем разведения аликвоты экстракта (25 мл);

V - объем аликвоты экстракта (1 мл); а0 - навеска ГСО лютеолина, г;

У4 - объем раствора стандарта (100 мл);

У5 - объем разведения аликвоты раствора

стандарта (25 мл);

V - объем аликвоты раствора стандарта (1 мл); W - потеря в массе при высушивании сырья.

Выводы

1. Проведен качественный анализ фла-воноидов, на основании которого установлено присутствие в траве монарды флавоноидов: лютеолина, лютеолин-7-гликозида, наринге-нина, рутина, гиперозида; оксикоричных кислот - хлорогеновой кислоты; фенолкарбоно-вых кислот - галловой кислоты - и катехина.

2. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в различных видах монарды методом дифференциальной спектрофотометрии в пересчете на лютеолин (^тах 398 нм).

3. Установлено, что содержание лютеолина в монарде трубчатой составило 1,57±0,02%, монарде двойчатой - 1,63±0,02%,

монарде гибридной - 1,52±0,03%, монарде лимонной - 1,61±0,02%, монарде Рассела -0,905±0,03%.

Сведения об авторах статьи:

Красюк Екатерина Васильевна - аспирант кафедры фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450008, г. Уфа, ул. Ленина, 3. E-mail: [email protected].

Пупыкина Кира Александровна - д.фарм.н, профессор кафедры фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450008, г. Уфа, ул. Ленина, 3. E-mail: [email protected].

ЛИТЕРАТУРА

1. Флавоноиды: биохимия, биофизика, медицина/ под ред. Ю.С. Тараховского. - Пущино: Synchrobook, 2013. - 310 с.

2. Дмитриев, В.Л. Изучение состава эфирных масел эфиромасличных растений Нечерноземной зоны России / В.Л. Дмитриева, Л.Б.Дмитриев // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. - М.: РГАУ-МСХА им.К.А.Тимирязева,2011. -Вып.3. - С.106-119.

3. Красюк, Е.В. Характеристика фенольных соединений видов монарды, инродуцированных в Республике Башкортостан / Е.В.Красюк, К.А. Пупыкина, И.Е. Анищенко // Башкирский химический журнал.-2015.- Т. 22, № 3. - С.79-83.

4. Определитель высших растений Башкирской АССР: сем. Brassicaceae - Asteraceae / АН СССР, Урал. отд-ние, Башк. науч. центр, Ин-т биологии; [Ю. Е. Алексеев и др.]; отв. ред. Е. В. Кучеров, А. А. Мулдашев. - М.: Наука, 1989 - 374 с.

УДК 615.322:615.074 © Коллектив авторов, 2016

Я.П. Лебедев, Р.М. Баширова, Р.И. Ибрагимов, А.Г. Мустафин ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ КУПЫРЯ ЛЕСНОГО (ANTHRISCUS SYLVESTRIS (L.) HOFFM)

ФГБОУ ВО «Башкирский государственный университет», г. Уфа

Купырь лесной (морковник лесной, коровья петрушка) Anthriscus sylvestris (L.) Hoftm, сем. Apiaceae широко распространен на территории Башкортостана и встречается в естественных и антропогенных нитрофильных сообществах.

Фармакологические эффекты этого растения связывают с наличием ингибиторов топоизомеразы - арилтетралиновых лигнанов, содержащихся как в надземных, так и подземных органах.

Нами изучен состав метанольного экстракта корней купыря лесного Anthriscus sylvestris, используемого в народной медицине как противоопухолевое, противовоспалительное, жаропонижающее и противовирусное средство. Экстракт исследовали методом газовой хроматографии на газовом хроматографе Trace 1310 ГХ с масс-селективным детектором Thermo ISQ. В метанольном экстракте корней купыря лесного Anthriscus sylvestris обнаружен ряд противоопухолевых и противовирусных соединений: дезоксиподофиллотоксин (антрисцин), ятеин и фалькаринон. Учитывая легкость введения A. sylvestris в культуру в условиях Южного Урала, целесообразно отрабатывать технологию получения препаративных форм обнаруженных соединений.

Ключевые слова: купырь лесной, антрисцин (деоксиподофиллотоксин), ятеин, ингибитор топоизомеразы, фалькаринон (панаксинон).

Ya.P. Lebedev, R.M. Bashirova, R.I. Ibragimov, A.G. Mustafin ANTITUMOR COMPOUNDS OF COW PARSLEY (ANTHRISCUS SYLVESTRIS (L.) HOFFM)

Anthriscus sylvestris (L.) Hoffm (known also as cow parsley, wild chervil, wild beaked parsley, keck) of Apiaceae family is widely distributed in Bashkortostan region and can be found in natural and anthropogenic nitrophilous communities.

Pharmacological effects of this plant are associated with the presence of topoisomerase inhibitors - aryl tetraline lignans, contained in aerial and subterranean organs.

We have studied the composition of the roots of cow parsley methanol extract, used in folk medicine as anti-cancer, antiinflammatory, antipyretic and anti-viral agent. The extract was examined by gas chromatography using GC Trace 1310 mass selective detector Thermo ISQ. In methanol extract of cow parsley a number of anticancer and antiviral compounds have been found: de-oxypodophyllotoxin, yatein and fakarinon (panaxynone). Taking into account the ease of administration A. sylvestris in culture under conditions of Southern Urals, it is advisable to develop the technology of formulation of the detected compounds.

Key words: Anthriscus sylvestris (L.) Hoffm, wild chervil, deoxypodophyllotoxin, yatein, topoisomerase inhibitor, falcarinon (panaxinone).

Купырь лесной (морковник лесной, коровья петрушка) Anthriscus sylvestris (L.) Hoffm, сем. Apiaceae - травянистое двулетнее растение. В Башкортостане A.sylvestris встречается в естественных и антропогенных нитрофильных сообществах - затененных местах и на опушках в лесопарках, скверах, в поймах рек и ручьев, в рудеральных и полуестественных сообществах мезофильных и нитрофиль-

ных многолетников. Это довольно крупное растение высотой 50-180 см с толстым вертикальным корнем.

Купырь широко применяется в народной медицине многих стран и как пищевое растение [1,2]. Сырые листья добавляют в салаты, отварные или свежие корни используют в качестве ароматизатора. В Сербии эфирное масло из A. sylvestris