CC BY
257
УДК 615.322:582.929.4:547.5'6'8.06(470.630)
ФЕНОЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ ШАЛФЕЯ МУСКАТНОГО (SALVIA SCLAREA L.), КУЛЬТИВИРУЕМОГО В СТАВРОПОЛЬСКОМ КРАЕ
© М.В. Гаврилин, О.И. Попова, Е.А. Губанова
Пятигорская государственная фармацевтическая академия, пр. Калинина, її, 357532, Пятигорск (Россия) e-mail: eagubanova@gmail.com
Изучен качественный состав фенольных соединений в надземной части шалфея мускатного, культивируемого в Ставропольском крае. Методом ВЭЖХ идентифицировано 15 соединений фенольной природы. Дигидрокверцетин, рутин, кумарин, умбеллиферон, галловая, цикориевая и феруловая кислоты в траве шалфея мускатного были обнаружены впервые. Методами прямой спектрофотометрии и ВЭЖХ определено количественное содержание фенолкарбоновых кислот в пересчете на галловую кислоту.
Ключевые слова: шалфей мускатный, фенольные соединения, ВЭЖХ, УФ-спектрофотометрия.
Введение
Шалфей мускатный (Salvia sclarea L.) семейства губоцветные (Lamiaceae) - двулетнее травянистое растение. В народной медицине используют настой из листьев и травы шалфея мускатного в качестве спазмолитического, противовоспалительного, антимикробного и мочегонного средства при почечно-каменной болезни, как полоскание при стоматитах и катарах верхних дыхательных путей [1]. Эфирное масло шалфея мускатного применяется в качестве противовоспалительного, тонизирующего, антибактериального и противогрибкового средства. В Краснодарском крае растение культивируют с целью получения эфирного масла из соцветий. Однако остальная сырьевая масса остается невостребованной. Поэтому обоснование возможности применения всей надземной части шалфея мускатного в медицине считается актуальным, так как будет решена проблема комплексного и рационального использования сырья.
Обзор данных литературы показал, что биологическая активность растений рода Salvia L. во многом обусловлена присутствием фенольных соединений [2]. В ходе исследования на кафедре фармакогнозии ПятГФА установлено количественное содержание флавоноидов в надземной части шалфея мускатного 1,632,03% в пересчете на цинарозид [3], дубильных веществ - 9,14-10,38% в пересчете на танин.
Сведений о количественном содержании фенолкарбоновых кислот в данном растении нами в литературе не обнаружено.
Цель работы - изучение качественного состава фенольных соединений и количественного содержания фенолкарбоновых кислот в надземной части шалфея мускатного.
Экспериментальная часть
Объектом исследования служила надземная часть шалфея мускатного, выращенного на опытных участках Ставропольского научно-исследовательского института сельского хозяйства (сорт «Популяция Ч-79»; СНИИСХ, г. Михайловск). Сырье собирали в 2008 г., во второй декаде июля, в фазу цветения - начала плодоношения, сушили методом воздушно-теневой сушки в хорошо проветриваемых помещениях при температуре 22-24 °С, измельчали и просеивали через сито с диаметром отверстий 2 мм.
Для предварительного анализа качественного состава фенольных соединений применяли метод одномерной хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента в различных системах растворителей. Для хроматографии использовали бумагу марки «Ленинградская С», пластины «Сорбфил» (ПТСХ-П-А-УФ», производитель ЗАО «Сорбполимер», размером 10*10 и 10*15). Для хроматографического анализа из сырья получали извлечение следующим образом: около 1,0 г измельченной травы помещали в коническую колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 10 мл спирта этилового 70% (в случае идентификации галловой кислоты для приготовления извлечения
* Автор, с которым следует вести переписку.
использовали 40% этиловый спирт и воду) и нагревали на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин. После охлаждения извлечение очищали хлороформом от липофильных веществ в делительной воронке, фильтровали через бумажный фильтр, сгущали до получения густого остатка, который растворяли в спирте этиловом 95% и использовали для предварительного обнаружения флавоноидов методом бумажной и тонкослойной хроматографии. В качестве стандартных веществ брали спиртовые растворы рутина, кверцетина, гиперозида, апигенина, лютеолина, лютеолин-7-глюкозида (цинарозида), гесперидина, галловой, феруловой, кофейной, хло-рогеновой и салициловой кислот. Детектирование зон адсорбции флавоноидов и фенолкарбоновых кислот проводили в видимом и УФ-свете до и после обработки хромогенными реактивами - парами аммиака, 5%-ными спиртовыми растворами алюминия хлорида и железа (III) хлорида [4, 5].
Для подтверждения качественного состава фенольных соединений травы шалфея мускатного использовали метод ВЭЖХ.
Метод 1. Анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы «GILSTON», модель 305 (Франция), инжектор ручной, модель RHEODYNE 7125 USA, с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы «Multichrom for Windows». В качестве неподвижной фазы был использован сорбент Kromasil C 18, размер частиц 5 микрон, металлическая колонка 4,6*250 мм. Подвижная фаза - смесь метанол - вода - фосфорная кислота (конц.) в соотношении 40 : 60 : 0,5. Анализ проводили при комнатной температуре в течение 70 мин. Скорость подачи элюента 0,8 мл/мин. Детектирование веществ осуществляли с помощью УФ-детектора «GILSTON» UV/VIS, модель 151, при длине волны 254 нм.
Метод 2. Исследование проводили на жидкостном хроматографе «Стайер» фирмы «Аквилон» (Россия-США-Чехия). Метод - обращенно-фазовая распределительная хроматография.
В качестве неподвижной фазы была использована металлическая колонка Luna C-18 4,6 *150 мм (Phenomenex, США) с содержанием углерода около 16%. Элюирование проводили в градиентном режиме. Элюент А - ацетонитрил, элюент В - раствор 2%-ной муравьиной кислоты. Содержание ацетонитрила увеличивалось от 20 до 60% за 40 мин при расходе подвижной фазы 1 мл/мин. Детектирование осушествляли при 280, 320 и 365 нм.
Около 10,0 г растительного сырья помещали в колбу вместимостью 250 мл, прибавляли 70 мл 70%-ного этилового спирта, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 ч с момента закипания спиртоводной смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили спиртом этиловым 70% до метки (исследуемый раствор).
Параллельно готовили серию 0,05% растворов сравнения в спирте этиловом 70%: рутина, лютеолин-7-глико-зида, гиперозида, гесперидина, кверцетина, лютеолина, апигенина, дигидрокверцетина, кемпферола, галловой, кофейной, хлорогеновой, цикориевой, коричной, феруловой, розмариновой кислоты кумарина, метоксикумарина, умбеллиферона, эскулетина, эпикатехина и танина.
По 20 мкл исследуемого раствора и растворов сравнения вводили в хроматограф и хроматографировали по приведенной выше методике. Качественный анализ проводили посредством регистрации времен удерживания компонентов исследуемого раствора и растворов сравнения.
Так как в надземной части шалфея мускатного присутствуют флавоноиды, поглощающие электромагнитное излучение в близкой фенолкарбоновым кислотам области длин волн, мы провели количественное исследование двумя методами: 1) спектрофотометрический анализ суммы фенолкарбоновых кислот по собственному поглощению в УФ-области (в пересчете на кислоту галловую) и 2) количественное определение кислоты галловой методом ВЭЖХ (метод 1).
При исследовании УФ-спектра поглощения спиртового извлечения из надземной части шалфея мускатного установлено, что при длине волны 276±2 нм наблюдается выраженный максимум. Аналогичный максимум поглощения имеет 0,001% раствор кислоты галловой (рис. 1). Регистрировали спектры на спектрофотометре СФ-2000 в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Таким образом, предложено использовать в качестве аналитической длину волны 276 нм и проводить количественное определение суммы фенолкарбоновых кислот в пересчете на кислоту галловую по методике для стандартизации корневищ иглицы шиповатой [6].
Методика количественного определения суммы фенолкарбоновых кислот прямым спектрофотометрическим методом. Аналитическую пробу травы шалфея мускатного измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 50%-ного этилового спирта, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 1 ч. После охлаждения извлечение фильтруют в мерную колбу вместимостью 100 мл через складчатый бумажный фильтр и объем раствора доводят 50%-ным этиловым спиртом до метки (раствор А).
5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и объем раствора доводят спиртом этиловым 50% до метки, перемешивают (раствор Б).
Оптическую плотность раствора Б измеряют на спектрофотометре при длине волны 276 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравнения спирт этиловый 50%.
Параллельно измеряют оптическую плотность раствора СО галловой кислоты.
Приготовление раствора СО кислоты галловой.
Около 0,05 г (точная навеска) галловой кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 50%-ного этилового спирта и перемешивают до растворения, затем объем доводят тем же растворителем до метки. 2 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и объем доводят тем же растворителем до метки.
Содержание суммы фенолкарбоновых кислот в пересчете на галловую кислоту и абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле
^ _ Б - та - 2-100-100-100-100 _ Б0-100-100 -т -5-(100 -ШУ
где Б - оптическая плотность испытуемого раствора, Бо - оптическая плотность раствора СО галловой кислоты, т - масса навески сырья в граммах, т<, - масса навески СО галловой кислоты в граммах, W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.
Методика количественного определения галловой кислоты методом ВЭЖХ. Около 5,0 г растительного сырья помещают в колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 70 мл 50%-ного этилового спирта, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 1 ч с момента закипания спиртоводной смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят тем же растворителем до метки (исследуемый раствор).
Приготовление раствора СО кислоты галловой. Около 0,01 г (точная навеска) соответствующего стандартного образца помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл 50%-ного этилового спирта и перемешивают до растворения, затем объем раствора доводят тем же растворителем до метки.
По 20 мкл исследуемого раствора и раствора СО кислоты галловой хроматографируют по приведенной выше методике.
Содержание кислоты галловой в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле
х _ £ - та-100-100-100 _ £0 -т -25-(100 - ШУ
где 8 - площадь пика испытуемого раствора, 8о - площадь пика раствора СО кислоты галловой, т - масса навески сырья в граммах, mo - масса навески СО галловой кислоты в граммах, W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.
Обсуждение результатов
Результаты качественного анализа фенольных соединений травы шалфея мускатного методами бумажной и тонкослойной хроматографии обобщены в таблицах 1 и 2.
Галловая кислота была идентифицирована при проведении ТСХ анализа в системе БУВ (4 : 1 : 5). Пятно с К(=0,65-0,67 совпадало с образцом сравнения, в видимом свете его не было видно, в УФ-свете оно имело зеленую окраску, а при обработке парами аммиака - желтую.
Рис. 1. УФ-спектр поглощения 0,001% спиртового раствора галловой кислоты (1) и спиртового извлечения из надземной части шалфея мускатного (2)
Методами бумажной и тонкослойной хроматографии с использованием образцов сравнения в спиртоводных извлечениях травы шалфея мускатного было установлено наличие флавоноидов (рутина, кверцетина и цинарозида) и фенолкарбоновых кислот (галловой, хлорогеновой, кофейной и феруловой).
С помощью ВЭЖХ-анализа по методу 1 в траве шалфея мускатного подтверждено присутствие 15 соединений фенольной природы, которые представлены флавоноидами, фенолокислотами, кумаринами и дубильными веществами (рис. 2, табл. 3).
Анализ фенольных соединений методом ВЭЖХ (метод 1) осушествлялся с помощью УФ-детектора при длине волны 254 нм. Как видно из рисунка хроматограммы, далеко не все флавоноиды и фенолокислоты имеют в своих УФ-спектрах максимумы при этой длине волны. Поэтому для достоверной идентификации таких соединений, как дигидрокверцетин, кумарин, кемпферол, в надземной части шалфея мускатного необходимо было продолжить работу по подбору условий хроматографирования.
Таблица 1. Результаты хроматографического анализа фенольных соединений травы шалфея мускатного (тонкослойная хроматография)
Значение в системах Окраска в УФ-свете
I II III до проявления после обработки КН4ОН после обработки 5%-ным спиртовым раствором А1С13 (ЕеС13) Идентифициро- вано
- 0,92-0,93 0,29-0,30 светло-голубая усиление окраски серо-зеленая кофейная кислота
- - 0,44-0,46 бурая усиление окраски желто-зеленая рутин
- 0,17-0,18 0,47-0,49 фиолетово- голубая фиолетовая коричневая феруловая кислота
0,57-0,58 0,68-0,69 0,64-0,65 коричневая желтая желто-коричневая цинарозид
0,93-0,94 0,31-0,32 - бурая усиление окраски желто-зеленая апигенин
0,96-0,97 - 0,86-0,87 желтая желтая желто-бурая кверцетин
- - 0,59-0,61 голубая усиление окраски сине-фиолетовая не идентифицировано
Примечание. I - этилацетат - кислота муравьиная - вода (10 : 2 : 3); II - хлороформ - метиловый спирт (8 : 2); III - хлороформ - этиловый спирт - вода (14 : 6 : 0,2).
Таблица 2. Результаты хроматографического анализа фенольных соединений травы шалфея мускатного (бумажная хроматография)
Значение в системах Окраска в УФ-свете
БУВ (4 : 1 : 2) 15% СН3СООН 2% СН3СООН до проявления после обработки К^ОН после обработки 5%-ным спиртовым раствором А1С1з (ЕеС1з) Идентифици- ровано
0,39-0,40 - 0,60-0,61 сине-голубая голубая усиление окраски не идентифицировано
0,42-0,43 0,17-0,18 - коричневая желтая желто-коричневая цинарозид
0,57-0,58 0,49-0,50 - желтая усиление окраски желтая не идентифицировано
0,62-0,64 0,68-0,69 0,49-0,51 голубая зеленая усиление окраски хлорогеновая кислота
0,67-0,68 0,55-0,56 - коричневая усиление окраски желто-зеленая рутин
0,73-0,75 - 0,37-0,38 ярко-синяя усиление окраски грязно-фиолетовая не идентифицировано
0,77-0,78 0,11-0,13 коричневая усиление окраски желто-зеленая апигенин
0,80-0,81 0,48-0,50 0,54-0,55 светло-голубая усиление окраски серо-зеленая кофейная кислота
0,83-0,84 0,41-0,42 - коричневая коричневая желто-коричневая кверцетин
0,87-0,88 0,38-0,39 0,30-0,31 фиолетово- голубая фиолетовая коричневая феруловая кислота
0,92-0,94 0,21-0,23 - желтая усиление окраски коричневая не идентифицировано
Для этой цели применили метод обращенно-фазовой хроматографии (метод 2). Детектирование в данном случае осуществляли при различных длинах волн: для идентификации дигидрокверцетина - 280 нм, кемпфе-рола - 365 нм, кумарина - 320 нм. Результаты ВЭЖХ анализа по методу 2 представлены на рисунках 3-5.
Определение количественного содержания фенол-карбоновых кислот в пересчете на галловую кислоту проведено двумя методами, оно составило 2,18±0,06% прямым спектрофотометрическим методом и
0,41±0,03% методом ВЭЖХ. Принципиальным недостатком первого метода являются невысокая избирательность и точность, так как в этой области спектра могут поглощать и другие группы веществ, в частности флавоноиды, что приводит к завышенным данным по содержанию фенолкарбоновых кислот. Поэтому отсутствие систематической ошибки методики спектрофотометрического определения суммы фенолкар-боновых кислот (ФКК) подтверждено в опытах с добавками галловой кислоты непосредственно к навеске сырья перед экстракцией. Полученные результаты приведены в таблице 4.
Таблица 3. Результаты ВЭЖХ анализа фенольных соединений травы шалфея мускатного (сорт «Популяция Ч-79»)
Идентифицировано Время
удерживания, мин
Фенолкарбоновые кислоты
Галловая кислота 3,426
Хлорогеновая кислота 3,530
Кофейная кислота 5,077
Цикориевая кислота 6,026
Феруловая кислота 7,087
Розмариновая кислота 12,37
Флавоноиды
Рутин 8,394
Лютеолин-7-глюкозид (цинарозид) 13,37
Кверцетин 26,60
Дигидрокверцетин 30,24
Кемпферол 56,26
Апигенин 62,03
Дубильные вещества
Танин 3,87
Кумарины
Умбеллиферон 2,82
Кумарин 11,05
Рис. 2. Хроматограмма ВЭЖХ спиртового извлечения из травы шалфея мускатного («Популяция Ч-79», СНИИСХ, 2008)
Рис. 3. Фрагмент хроматограммы спиртового извлечения травы шалфея мускатного при 280 нм (№18 - дигидрокверцетин; 1к=7,7 мин)
Рис. 4. Фрагмент хроматограммы спиртового извлечения травы шалфея мускатного при 320 нм (№35 - кумарин; 1к=30,26 мин)
Рис. 5. Фрагмент хроматограммы спиртового извлечения травы шалфея мускатного при 365 нм (№31 - кемпферол; 1к=19,36 нм)
Таблица 4. Результаты опытов с добавками галловой кислоты в навеску сырья - травы шалфея мускатного
Найдено ФКК (сумма), г Добавлено галловой кислоты, г Должно быть, г Найдено, г Относительная ошибка, %
0,0211 0,01315 0,03425 0,03350 -2,19
0,0218 0,01235 0,03415 0,03478 +1,84
0,0223 0,011б0 0,03390 0,03325 -1,92
0,0228 0,01340 0,03б20 0,03705 +2,35
Полученные данные позволяют сделать вывод о рациональности количественного определения фенол-карбоновых кислот в надземной части шалфея мускатного методом ВЭЖХ. Однако если техническое оснащение лаборатории не позволяет провести ВЭЖХ анализ, определение возможно осуществить и методом прямой спектрофотометрии.
Выводы
Методами бумажной и тонкослойной хроматографии с использованием образцов сравнения в спиртоводных извлечениях травы шалфея мускатного установлено наличие флавоноидов (рутина, кверцетина, апигенина и ци-нарозида) и фенолкарбоновых кислот (галловой, хлорогеновой, кофейной и феруловой).
Методом ВЭЖХ с помощью стандартных веществ в траве шалфея мускатного идентифицировано 15 соединений фенольной природы, из них впервые обнаружены дигидрокверцетин, рутин, кумарин, умбеллифе-рон, галловая, цикориевая и феруловая кислоты.
Проведено количественное определение суммы фенолкарбоновых кислот в пересчете на галловую кислоту двумя методами: прямым спектрофотометрическим и методом ВЭЖХ.
Наши исследования позволили оценить перспективность новой селекционной формы шалфея мускатного как источника фенольных соединений.
Полученные данные могут быть использованы при разработке нормативной документации на новый вид лекарственного растительного сырья «Шалфея мускатного трава».
Список литературы
1. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейства Hippuridaceae - Lobeliaceae. СПб., 1991. С. 72-83.
2. Губанова Е.А., Попова О.И. Фенольные соединения некоторых видов рода Salvia (Lamiaceae) флоры России и их биологическая активность // Растительные ресурсы. 2009. Т. 45, вып. 3. С. 137-160.
3. Губанова Е.А. Количественное определение флавоноидов в траве шалфея мускатного // Фармация из века в век: сб. тр. СПХФА. СПб, 2008. Ч. III. С. 20-24.
4. Бандюкова В.А. Применение цветных реакций для обнаружения флавоноидов путем хроматографирования на бумаге // Растительные ресурсы. 1965. Т. 1, вып. 4. С. 591-597.
5. Бандюкова В.А., Шинкаренко А.А. Тонкослойная хроматография флавоноидов // Химия природных соединений. 1983. №1. С. 20-24.
6. Томашевская О.Ю., Даргаева Т.Д., Сокольская Т.А. Изучение качественного состава и определение содержания фенольных соединений в корневищах иглицы шиповатой (Ruscus aculeatus L.) // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2009. №2. С. 42-44.
Поступило в редакцию З0 октября 2009 г.
После переработки 23 апреля 2010 г.
