CC BY
32
УДК 579.861.2.017(4/5)
SpA-сиквЕнстипировЛниЕ штАммов золотистого стафилококка, циркулирующих в географически
удаленных регионах Евразии
А.Е. Гончаров 12, Л.П. Зуева1, А.Н. Суворов3-2, Л.С. Глазовская4, Е.Б. Брусина4, И.С. Азизов А.В. Лавриненко 5, Т.Н. Суборова6, В.В. Колоджиева 1, А.С. Мохов 1, Д.В. Азаров 1 1 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова,
Санкт-Петербург, Россия
2 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
3 Институт экспериментальной медицины СЗО РАМН, Санкт-Петербург, Россия
4 Кемеровская государственная медицинская академия, Кемерово, Россия 5 Карагандинский государственный медицинский университет, Караганда, Казахстан 6 Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова,Санкт-Петербург, Россия
spa-typng of staphylococcus aureus strains, circulating in different geographically distant regions of eurasia
A.E. Goncharov1■2, L.P. Zueva 1, A.N. Suvorov 3 2, L.S. Glazovskaya4, E.B. Brusina4,1.S. Azizov5, A.V. Lavrinenko5 T.N. Suborova6, V.V. Kolodzhieva 1, A.S. Mohov1, D.V. Azarov1 1 North-West State Medical University named after I.I. Mechnikov, Saint-Petersburg, Russia 2 Saint-Petersburg State University, Saint-Petersburg, Russia 3 Institute of the experimental medicine RAMS, Saint-Petersburg, Russia 4 Kemerovo State medical academy, Kemerovo , Russia 5 Karaganda State Medical Univerity, Karaganda, Kazakhstan 6 Military medical Academy named after S.M. Kirov, Saint-Petersburg, Russia
© Коллектив авторов, 2014
Методом spa-сиквенстипирования изучена генетическая структура штаммов Staphylococcus aureus, циркулирующих в 2008-2013 гг. в различных географических регионах России и Казахстана. Установлено, что доминирующими spa-сиквенстипами являются штаммы, относящиеся к клональному комплексу CC8/239. Обсуждается необходимость организации систематического эпидемиологического надзора за эпидемическими клонами MRSA.
ключевые слова: Staphylococcus aureus, MRSA, spa-сиквенстипирование, географическое распространение
The genetic structure of Staphylococcus aureus, circulating in 2008-2013 in different geographical regions of Russia and Kazakhstan has been studied.
Spa-types belonging to the clonal complex CC8/239 were most predominant. The need for establishing a systematic surveillance of epidemic clones of MRSA has been discussed. Key words: Staphylococcus aureus, MRSA, spa-typing, geographical spread.
введение
Staphylococcus aureus является основным этиологическим фактором развития инфекций, связанных с медицинскими манипуляциями (ИСМП), вызывающим ряд негоспитальных инфекций, таких как пиодермии, синдром токсического шока, пневмонии, остеомиелиты и другие заболевания.
В настоящее время является очевидным, что наибольшую опасность с клинических и эпидемиологических позиций представляет распространение метициллин-резистентных штаммов золотистого стафилококка (MRSA), частота обнаружения которых в отдельных стационарах России достигает 50-60% [1]. Помимо зна-
чительной летальности и частоты осложнений, обусловленных MRSA-инфекциями, с ними связан значительный экономический ущерб. Так, по данным американских исследователей [2], стоимость одного случая MRSA-инфекции в лечебно-профилактическом учреждении превышает 60000 долларов США.
Широкое эпидемическое распространение MRSA как в госпитальной среде, так и в обществе, определяет интерес к генетической структуре популяций этого возбудителя.
Использование метода мультилокусно-го секвенирования-типирования позволило установить принадлежность многочисленных госпитальных штаммов MRSA всего лишь
к 6 филогенетическим линиям (клональным комплексам): CCI, CC5, CC8/239, CC22, CC30, CC45. Наиболее диверсифицированными и многочисленными являются клональные комплексы CC5 и CC8/239, которые содержат различные эпидемические штаммы и клоны, такие как EMRSA-1, -4, -7, -9, -11, Иберийский. В стационарах России выявлено эпидемическое распространение штаммов MRSA, генетически родственных EMRSA-1 (Бразильскому клону) и Иберийскому клону [3].
Одним из наиболее часто использующихся методов молекулярно-генетического типиро-вания, позволяющих с высокой степенью достоверности оценить клональную структуру золотистого стафилококка, является метод секвенирования типирования вариабельного X-сегмента гена поверхностного протеина А (spa-сиквенстипирование). Показано, что данный метод применим и для расследования локальных эпидемических вспышек стафилококковой инфекции и для изучения глобального распространения отдельных эпидемических клонов данного микроорганизма. [4].
В то же время популяционная структура S. aureus, циркулирующих на территории России и государств, входивших в состав бывшего Советского Союза, не может считаться в достаточной степени изученным методом spa-сиквенстипирования.
Цель исследования - проведение оценки генетической структуры локальных популяций золотистого стафилококка, циркулирующих в географически удаленных регионах Евразии методом spa-сиквенстипирования с целью выявления эпидемиологически значимых spa-сиквенстипов, имеющих наибольшую географическую распространенность.
материалы и методы
В исследование включены изоляты, выделенные в 2008-2013 гг. у пациентов десяти лечебно-профилактических учреждениях различного профиля и географической локализации (3 лечебно-профилактических учреждения в г. Санкт-Петербурге, два учреждения в г. Кемерово, по одному стационару в г. Перми и г. Караганде).
Кроме того, исследованная популяция стафилококков включила в себя культуры, выделенные при назальном носительстве в группах практически здоровых взрослых лиц (добровольцев), рекрутированных из числа коренного населения Чукотки (г. Анадырь).
Характеристика изученных культур представлена в таблице.
Видовую идентификацию микроорганизмов и определение чувствительности к антибиотикам осуществляли на микробиологическом анализаторе MicroScan autoSCAN-4 (Siemens, ФРГ). Данные об антибиотикорезистентности интерпретировали согласно требованиям CLSI, в частности, к метициллин-резистентным относили штаммы, устойчивые к концентрациям оксациллина большим, чем 2 мг/л.
Бактериальную ДНК получали методом «горячего лизиса» (при 95°С) клеточной суспензии в виде биомассы 2-3 колоний, выросших на 5% кровяном агаре (объем пробы 100 мкл, время обработки 15 мин) с очисткой центрифугированием.
Амплификацию гена spa проводили с использованием праймеров и условий реакции, предложенных Harmsen, D. [4]. Секвенирование осуществляли в автоматической капиллярной системе MegaBACE 1000 DNA Analysis System (GE Healthcare, США).
Результаты секвенирования гена spa обрабатывали, используя данные web-сайта http:// www.ridom.de/spaserver/.
результаты и обсуждение
Как видно из данных, представленных в таблице, популяция изученных штаммов золотистого стафилококка представлена главным образом изолятами, отнесенными к 15 различным spa-сиквенстипам (t632, t041, t024, t008, t052, t121, t1171, t11805, t030, t932, t2032, t37, t1202, t435 и t502). Ряд spa-сиквенстипов обнаружил тенденцию к широкому географическому распространению. Так, spa-типы t008, t024, t11805, t030 обнаруживались в стационарах более чем одного географического региона. При этом обращает на себя внимание преобладание spa-типов, филогенетически родственных штаммам эпидемического клонального комплекса CC8/239. В частности, spa-тип t008 является одной из наиболее древних клональных линий метициллин-резистентных золотистых стафилококков (MRSA). По данным web-ресурса http://spa.ridom.de [5], штаммы данного генотипа формируют эпидемические вспышки в стационарах Европы, Северной и Южной Америке начиная с 2001 г. В частности, ранее нами при использовании комбинации пульс-электрофореза и spa-сиквенстипирования был установлен факт циркуляции в двух стационарах г. Санкт-Петербурга эпидемического штамма MRSA BT2007, отнесенного к данному spa-сиквенстипу и пульс-электротипу I [6].
h s
t632 0
t041 0
t024 1
t008 0
t052 1
t121 1
t1171 1
t11805 0
t030 1
t932 0
t2032 0
t037 0
t1202 0
t435 0
t502 0
Другие 1
И т о г о : 6
Метициллин-резистентные штаммы Staphylococcus aureus (MRSA)
р
а н
о
и
к 5
а g
стат
с
а
зы ан
bi ЕЗ
л S
4
5 с ар
и ff
а
» 2
rt fa * §
р
а н
о
и ц
^
Ъ К
S 13
ее
с w
- =к
h s
£ S
^ о \о <и ft ^ еи
о
л
о
т
и а
р
а н
о
и
Ой^ . ft н
f^HO
н
rt m
=S
ы
m
о
р
\o
р
е т е
С
M о
£ s ац
U rt
. H
=K
и
*
с е
T
и
-
р р
и
а
и „
« Я Я О
ft 3
^ я
К о
=s
и
*
с е
^
и
-
р р
и
х
о" ^
й ер
О с«
рн
Щ О
ми ец
^ а . н
н
е ц
=К
ы
m
о
о m о
р
е м е
р
а н
о
и ц
а т
i*
Щ и нс
зе ^ ^
м s
О и
m ft
о ^
К &
=К
и
*
с е
№
и
-
р
и
X ft
й £
^ °
ри ец
с Я
. н
[н О
Метициллин-чувствительные штаммы Staphylococcus aureus (MSSA)
к
и
-
- ft
fa >• рр
уи
е т е
С
т*
н
а
к
а
н р
О
т а
л у
rj \0'
5 3 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11
0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2
2 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 10 0 0 0 0 0 0 0 10
0 0 0 12 0 0 0 1 0 2 2 5 0 0 0 0 22
0 0 0 0 0 0 0
5 0 0 0 1 0 0 0 0
6
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 1 3
0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
3 0 1
4
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 4
Spa-сиквенстип t024 является родственным сиквенстипу t008, но отличается от последнего делецией в вариабельной части гена spa, приведшей к отсутствию прямого повтора в одной из позиций. Данный генотип появился в Санкт-Петербурге не позднее 2008 года, когда впервые штамм данного spa-сивенстипа был выявлен у пациента с ВИЧ-инфекцией [6].
Идентифицированные в Караганде и в Москве при вспышках внутрибольничной инфекции штаммы spa-сиквенстипа t030 также обнаруживают филогенетическое родство штаммам клонального комплекса CC8/239. Штаммы данного сиквенстипа являются преобладающими в стационарах Китая [7]. Кроме того, ранее отмечалось, что российские штаммы MRSA данного spa-типа, циркулирующие
на Дальнем Востоке, представляют собой гибридные варианты генетического материала, полученные в результате генетического обмена штаммов клональных комплексов СС8/239 и СС30 [8].
Штаммы других эпидемических клональных комплексов встречались с меньшей частотой. Так, циркуляция штаммов spa-типа Ш41, филогенетически родственного эпидемическому клональ-ному комплексу СС5, были обнаружены только в одном из стационаров г. Санкт-Петербурга.
Кроме того, появление в российских лечебно-профилактических учреждения отдельных spa-сиквенстипов MRSA позволяет идентифицировать необычные эпидемиологические связи между удаленными географическими регионами.
Так, например, spa-сиквенстип t932, циркулировавший в г. Кемерово, ранее обнаруживался в стационарах Ближнего Востока [9], что не исключает возможности завоза данного генотипа MRSA c лицами, совершающими туристические поездки в данный регион.
Быводы
Таким образом, закономерности географического распространения эпидемических клонов Staphylococcus aureus в России и Казахстане отражают особенности географического положения этих стран как своеобразного моста между Европой и Азией. Распространение международных эпидемических клонов MRSA диктует необходимость включения в существующие программы инфекционного контроля дополнительных мероприятий, направленных на недопущение заноса данных микроорганизмов в стационар, и предполагает изменение алгоритма микробиологического обследования пациентов, переводимых в стационар из других учреждений. В настоящее время необходимость эпидемиологического наблюдения за распространением штаммов золотистого стафилококка, относящихся к эпидемическим клональным комплексам, не вызывает сомнения и требует организации систематических, а не эпизодических многоцентровых исследований, а также организации референсных центров по молеку-лярно-генетическому мониторингу за возбудителями ИСМП на региональном и национальном уровнях.
Представленная работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований № 12-04-31195 мол-а и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, соглашение о предоставлении гранта № 8157.
Литература
1. URL:http//www.antibiotic.ru (дата обращения 18.02.2014)
2. Anderson, DJ. Clinical and financial outcomes due to methicillin resistant Staphylococcus aureus surgical site infection: a multi-center matched outcomes study / D.J. Anderson [et al.] // PLoS One. 2009 Dec 15;4(12):e8305. doi: 10.1371/ journal.pone.0008305.
3. Афанасьев, МВ. Молекулярно-генетиче-ская характеристика метициллин-устойчивых штаммов Staphylococcus aureus, выделенных в стационарах г. Москвы / М.В. Афанасьев [и др.] // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. -2010. - № 2. - С. 20-24.
4. Harmsen, D. Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting by using novel software for spa repeat determination and database management / D. Harmsen [et al.] // J Clin Microbiol. - 2003. - № 41. - Р. 5442-5448.
5. URL: http://spa.ridom.de/spa-t008.shtml (дата обращения 18.02.2014)
6. Гончаров, А.Е. Эпидемический штамм ме-тициллин-резистентного Staphylococcus aureus в стационарах Санкт-Петербурга / А.Е. Гончаров [и др.] // Журн. микробиол. - 2010. - № 5. -С. 24-29.
7. He, W. Population structure and characterisation of Staphylococcus aureus from bacteraemia at multiple hospitals in China: association between antimicrobial resistance, toxin genes and genotypes / W. He [et al.] // Int J Antimicrob Agents. 2013 Sep;42(3): 211-9. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2013.04.031. Epub 2013 Jul 18.
8. Yamamoto, T. Comparative Genomics and Drug Resistance of a Geographic Variant of ST239. Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Emerged in Russia / Yamamoto T. [et al.]// PLoS ONE. 2012. 7(1): e29187. doi:10.1371/journal. pone.0029187
9. Sabri, I. Molecular characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates in three different Arab world countries / I. Sabri // Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2013 Sep;3(3):183-7. doi: 10.1556/EuJMI.3.2013.3.5. Epub 2013 Sep 23.
А.Е. Гончаров
Тел.: 8 (812) 544-22-94
e-mail: e-mail:phage1@yandex.ru
