CC BY
70
УДК 616.981.25-036.2:614.211-053.2+576.851.25
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭПИДЕМИОЛОГИЯ ШТАММОВ STAPHYLOCOCCUS AUREUS В ДЕТСКИХ СТАЦИОНАРАХ РФ
A.B. Романов, A.B. Дехнич, М.В. Эйдельштейн
Смоленская государственная медицинская академия, НИИ антимикробной химиотерапии, Россия, 214019, Смоленск, ул. Кирова, 46а
Целью исследования явилось установление молекулярных типов S. aureus, вызывающих нозокомиальные и внебольничные инфекции у детей в различных регионах РФ. В исследование было включено 575 штаммов, выделенных от детей и подростков в ходе многоцентровых микробиологических исследований. Для молекулярного типирования было отобрано 186 изолятов, имеющих уникальный профиль резистентности в пределах одного отделения каждого участвовавшего центра. Для изучения клональной принадлежности штаммов S.aureus были использованы методы MLVA, spa, SCCmec и MLST типирования. На основании данных MLVA метициллин-чувствительные штаммы кластеризовались на 80 типов, которые можно объединить в 10 генетических групп, отличающихся не более чем на 1 VNTR локус, в то время как MRSA расположились в пределах одной обособленной группы, состоящей из 17 MLVA типов. По данным SCCmec типирования было выявлено только 2 типа кассет: SCCmec III и SCCmec I). По данным MLST подавляющее большинство штаммов относились к ST 239 и ST 8. Внебольничные MRSA имели такие же MLVA, spa и SCCmec типы что и внутрибольничные: t008 SCCmec IV, t037 SCCmec III и t030 SCCmec III. Сделано заключение о том, что доминирующими молекулярными типами являются ST8, t008, SCCmec IV и ST239, t030 и t037 SCCmec III на протяжении всего периода наблюдения. Не установлено никаких молекулярно-генетических различий между внутри- и внебольничными MRSA.
Ключевые слова: MRSA, детские стационары, молекулярные методы типирования
MOLECULAR EPIDEMIOLOGY OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS IN RUSSIAN PEDIATRIC HOSPITALS
A. V. Romanov, A. V. Dekhnich, M. V. Edelstein
Smolensk State Medical Academy, Institute of Antimicrobial Chemotherapy, Russia, 214019, Smolensk, Kirov St., 46a
The aim of investigation was to reveal molecular types of nosocomial and community-acquired strains of S. aureus in different regions of Russia. 575 strains, isolated from pediatric patients during multicenter studies were included in the study. For molecular typing 186 strains with unique resistance profile within each ward of each medical institution were selected. The following typing methods were used: MLVA, spa, SCCmec and MLST. According to MLVA, methicillin-susceptible strains were clustered to 80 types, that could be placed into 10 genetic groups that differ in not more than 1 VNTR locus. At the same time the vast majority of MRSA strains were represented by the only genetic group, consisted of 17 MLVA types. Only 2 types of SCCmec were detected (III and IV). According to MLST results the vast majority of strains belong to ST 239 and ST 8. Community-acquired MRSA had the same MLVA, spa and SCCmec types as nosocomial ones: t008 SCCmec IV, t037 SCCmec III and t030 SCCmec III. In our study, independently of the geographic location, place of onset of infection, and time period, the dominating molecular types of MRSA were ST8, t008, SCCmec IV and ST239, t030 and t037 SCCmec III.
Key words: MRSA, pediatric, molecular typing
Золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) является повсеместно распространенным микроорганизмом, который вызывает широкий спектр заболеваний, таких как инфекции кожи и мягких тканей, инфекции костей и суставов, пневмония, сепсис, синдром токсического шока. Вместе с тем широко распространено бессимптомное носительство: 20-30% населения являются колонизированными этим микроорганизмом[1].
Резистентность стафилококка к Р-лактамам обусловлена присутствием mecA гена, который кодирует пенициллин-связывающий белок (ПСБ) 2а (реже упоминается как ПСБ2'). Ген mecA расположен на мобильном генетическом элементе, называемом стафилококковая хромосомная кассета (SCCmec)[2]. Мировое распространение MRSA, с основном, обусловлено диссеминацией нескольких клональных линий со специфической генетикой [3]. Каждая клональная линия имеет свои особенности патогенности и устойчивости к лекарственным препаратам, причем
распространение некоторых из них принимает эпидемический характер [4]. Так как Р-лактамные антибиотики являются наиболее часто применяемыми препаратами для стартовой эмпирической терапии большинства инфекций, то широкое распространение МКБА может значительно лимитировать терапевтические опции.
В развитых странах регулярно проводятся исследования молекулярной эпидемиологии наиболее значимых микроорганизмов. Во многих стационарах молекулярное типирование штаммов осуществляется на рутинной основе. В Российской Федерации в настоящее время данные о молекулярной эпидемиологии золотистого стафилококка ограничиваются единичными исследованиями (табл. 1).
Таблица 1. Краткие данные о проведенных исследованиях по изучению клональности МКБА в России
АВТОРЫ Годы и география исследования Методы исследования РЕЗУЛЬТАТЫ
Дмитренко О.А. [4] 184 изолята за 1976-1990 гг., более 1500 изолятов за 1998-2002. Различные регионы СССР и России Фаготипирование, RFLP coa, SLST coa, SCCmec, spa, амплификация генов sea, seb, sec Доминировали MRSA молекулярных типов t-030, SCCmec III, соа IV и t-037, SCCmec III, coa IV. Высказано предположение, что эпидемический клон со spa типом t008 имеет отличное происхождение от международного ST8-IV, т.к. имеет композитный элемент SCCmec(I+IV)
Vorobieva V., Hanssen A.M., Simonsen G.S., Sundsfjord A., Haldorsen B.C., Bazhukova T., Caugant D.A., Semenova N. [5] 91 изолят за 2004 г. Архангельская область. PFGE, MLST, SCCmec, PVL Из 91 изолята - 16 MRSA (15%), молекулярных типов (ST) 239-III (n=11), ST1097- III (n=1) и ST8-IV (n=3), которые входят в состав клонального комплекса CC8, а также ST426-MRSA-IV/CC395 (n=1) был описан впервые. Все MRSA были PVL отрицательными.
Хохлова О.Е.[6] 9 штаммов, относящихся к пандемическим МЯ8А клонам, Клинические штаммы МЯ8А из России Амплификация 18 генов стафилококковык токсинов, MLST, SCCmec Два клинических штамма из России были отнесены к венгерскому клону, т.к. принадлежали к группе ST239 (CCS) и типу SCCmecIII и продуцировали типичный для этого клона набор токсинов.
Таким образом, данных по молекулярной эпидемиологии S. aureus в РФ достаточно мало. Полностью отсутствуют данные по молекулярным типам стафилококков, вызывающим заболевания у детей. Кроме того, постоянно совершенствуются методы молекулярного типирования. Новые методы позволяют более объективно, быстро и с меньшими затратами назначить молекулярные типы практически всем поступившим изолятам. Очень перспективным выглядит применение метода MLVA (мультилокусный анализ тандемных повторов с переменным числом звеньев) для субвидового типирования стафилококков. В настоящее время в России не проводилось исследований с применением данного метода.
Цель исследования - установить молекулярные типы S. aureus, вызывающих нозокомиальные и внебольничные инфекции у детей в различных регионах РФ.
Методика
В исследование было включено 575 штаммов золотистого стафилококка (187 MRSA и 388 MSSA), выделенных от детей и подростков в ходе многоцентровых микробиологических исследований в 36 стационарах 24 городов РФ в 1997-2008 гг. Анализировался профиль резистентности из 6 антибиотиков: оксациллин, эритромицин, клиндамицин, гентамицин, ципрофлоксацин и ко-тримоксазол. Для молекулярного типирования было отобрано 186 изолятов, имеющие уникальный профиль резистентности в пределах одного отделения, каждого участвовавшего центра (рис. 1).
Рис. 1. Схема отбора изолятов нозокомиальных стафилококков для молекулярноно типирования
Также в исследование были включены 16 внебольничных MRSA, собранные в ходе многоцентрового исследования в 2004-2006 гг. Такое небольшое количество обусловлено низким процентом метициллинорезистентных штаммов (менее 4% из более 600 штаммов)
Для субвидового типирования использовались следующие методы: MLVA, spa типирование (секвенирование гена стафилококкового протеина A), MLST (мультилокусное секвенирование типирование и определение типа стафилококковой хромосомной кассеты (SCCmec типирование).
MLVA типирование штаммов осуществлено по 6 VNTR (Variable Number Tandem Repeats) локусам (SIRU 01, SIRU 05, SIRU 07, SIRU 13, SIRU 15, SIRU 21), согласно методике, предложенной R. Ikawaty et al. [7]. Для увеличения производительности были сформированы 2 мультиплексные ПЦР по 3 локуса в каждом. Из расчета на минимальное перекрестное взаимодействие праймеров SIRU 01, SIRU 07 и SIRU 13 вошли в первый мультиплекс и, соответственно, SIRU 05, SIRU 15 и SIRU 21 во второй мультиплекс. Один из праймеров каждой пары был помечен флуоресцентной меткой. Размер ПЦР продуктов определялся с помощью капиллярного электрофореза высокого разрешения с автоматической флуоресцентной детекцией. Данные MLVA анализировались в виде значений молекулярных масс ампликонов, ввиду встречаемости неполных повторов и изменчивости повторов в случае SIRU 21 [8]. Кластеризация выполнялась с помощью алгоритма минимальных дистанций по дискретным, приведенным к стандартным значениям молекулярных массам ампликонов.
Spa типирование выполнено в соответствии с общепринятыми рекомендациями, опубликованными на сайте www3.ridom.de [9].
SCCmec типирование проводилось по методике Po Liang Lu et al. (2008)[10].
Обработка данных осуществлена с помощью программного пакета BioNumerics v.6.5 (Applied Maths, Бельгия).
Результаты исследования и их обсуждение
На основании данных MLVA метициллин-чувствительные штаммы (n=117), кластеризовались на 80 типов, которые можно объединить в 10 генетических групп, отличающихся не более чем на 1 VNTR локус, в то время как MRSA (n=85) расположились в пределах одной обособленной группы (за исключением 3-х изолятов), состоящей из 17 MLVA типов (рис. 2).
О MSSA • MRSA
Рис. 2. Дендрограмма минимальных дистанций, построенная по данным МЬУА типирования. Один элемент - изоляты с одним МЬУА типом, размер элемента пропорционален количеству изолятов с данным МЬУА типом, короткая сплошная линия соответствует различию в 1 VNTR локус, прерывистая точками- в 2 VNTR локуса, прерывистая черточками - в 3 VNTR локуса, на сером фоне - группы изолятов, отличающиеся не более, чем на один VNTR локус
Spa типирование было выполнено для всех MRSA изолятов, для MSSA имевших одинаковые MLVA профили с MRSA, а также MSSA, имевших MLVA профили, отличающиеся на один VNTR локус от MRSA (рис. 3).
О
---О
О MSSA • MRSA
Рис. 3. Отбор штаммов для spa типирования: на сером фоне - группы штаммов, для которых выполнено spa типирование
Распространенность spa типов представлена в табл. 2.
Таблица 2. Распространенность различных spa типов среди исследованных изолятов
Spa тип 00 о о г— о о о г— <N 9 <N 4 <N о 3 чо со 8 о со <2 8 4 чо о 8 г— о 9 со ю V) <N 3 со чо о <2 V) со г- чо чо t7576
Кол-во MRSA 43 19 8 1 4 2 2 2 1 1 1 1
Кол-во MSSA 1 4 1 2 1 1 1 1 1
По данным 8ССшее типирования было выявлено только 2 типа кассет: 8ССшее III (п=36) и 8ССшее IV (п=49)
Для MLST типирования было отобрано по одному MRSA штамму, из каждого MLVA профиля. По данным MLST все протестированные штаммы, за исключением двух, относились к ST 239 и ST 8, которые оба принадлежат к одному клональному комплексу CC8.B результате кластерного анализа данных MLVA получили типичную картину клональной популяционной структуры, т.е. ряд генетических линий, отличающиеся внутри не более чем на 1 VNTR локус, но имеющие значительные отличия между собой (рис. 2). После добавления к дендрограмме данных spa типирования была обнаружена следующая корреляция между методами: все штаммы одного MLVA профиля всегда принадлежали одному spa типу, но один spa тип мог включать штаммы нескольких MLVA профилей. Родственные spa типы были также генетически сходны по данным MLVA типирования. Это подтверждает преимущество мультилокусного анализа перед однолокусным для изучения локальной эпидемиологии.
По сумме данных всех примененных методов было выявлено две доминирующие клональные линии MRSA, представители которых выявлялись в географически удаленных центрах на территории всей РФ. К одной группе принадлежали изоляты молекулятного типа t008 SCCmec IV (n=43) и сходные с ним (n=2), к другой - t030 SCCmec III (n=19), t037 SCCmec III (n=8) и сходные с ними (n=11). Первые относились к ST 8 по данным MLST, а вторые - к ST 239 (рис. 4).
Рис. 4. Дендрограмма минимальных дистанций, постоенная на основе композитного набора данных (6 УКТИ локусов и тип 8ССшес кассеты) На сером фоне - доминирующие клональные линии золотистого стафилококка в детских стационарах России
В целом это согласуется с данными ранее проведенных исследований (табл. 1). На основании литертурных данных, а также на основании прямого сравнения наших данных с международными базами данных spa server и mlst.net мы можем утверждать, что генетическая линия, имеющая spa типы t030 и t037, SCCmec III типа и относящаяся к ST 239 является бразильско-венгерским клоном (EMRSA-1), а t008 SCCmec IV ST 8 является клоном EMRSA-2/6[11]. Единичные изоляты, имеющие отличающиеся spa и MLVA типы от классических клонов, но, тем не менее, очень близкие к ним, возможно, возникли путем быстрой эволюции VNTR локусов и также являются представителями данных клонов.
При просмотре дендрограммы, построенной на основании только данных MLVA (рис. 2) нельзя не заметить, что есть метициллин-чувствительные изоляты, имеющие одинаковые или близкие (отличие в 1 VNTR локус) MLVA профили с метициллинорезистентными. После проведения spa типирования, было установлено, что они также имеют и одинаковые spa типы. Данные результаты
наглядно показывают мобильность SCCmec и возможно, указывают на наличие метициллиночувствительного предка.
Наибольший интерес вызывает то, что внебольничные MRSA имели такие же MLVA, spa и SCCmec типы что и внутрибольничные: t008 SCCmec IV (n=9), t037 SCCmec III (n=4) и t030 SCCmec III (n=3). Это позволяют предположить, что на территории РФ фактически нет значительного разделения на внутри- и внебольничные штаммы MRSA, а имеет место циркуляция одних и тех же клональных линий между стационарами и внебольничной средой (рис. 5). Для уточнения необходимо исследовать большее количество внебольничных MRSA, в нашем случае в ходе проекта собрано более 600 штаммов внебольничных стафилококков, но частота MRSA оказалась менее 4%.
Рис. 5. Дендрограмма минимальных дистанций, постоенная на основе композитного набора данных (6 УКТИ локусов и тип 8ССшее кассеты). Цветом выделены внутри- и внебольничные МКБА. Они имеют одинаковые МЬУА профили и типы 8ССшее кассет (занимают одни и те же кружки дендрограммы), следовательно являются генетически идентичными
Неоспоримым является факт, что стафилококки, выделяемые на территории РФ, принадлежат к международным эпидемическим клонам. Наиболее эволюционно успешным является клон ST-8, spa тип t008, который распространен во всем мире. Широко распространены как внутрибольничные, так и внебольничные клоны данной генетической линии, встречаются как метициллин-чувствительные, так и метициллинорезистентные штаммы. К этой генетической линии относятся известный внебольничный клон USA-300, который отличается от внутрибольничных продукцией PVL и внутрибольничный, такой как UK EMRSA-2/6. Данный клон широко распространен на территории РФ, начиная с 1997 года и на протяжении всего периода сбора штаммов. Как уже упоминалось, штаммы с близкими MLVA профилями и родственными spa типами (по данным BioNumerics spa typing plugin), по-видимому, тоже являются представителями данного клона, в то время как в некоторых публикациях они рассматриваются как самостоятельные клоны. В нашем исследовании были обнаружены следующие близкородственные варианты это клона t024, t064, t3308 и t118, все они обладают IV типом SCCmec кассеты и принадлежат к ST8. Схожесть этих spa типов показана в табл. 3, по данным MLVA они также отличаются не более, чем на 1 VNTR локус. Так как оба этих анализа основаны на анализе вариабельных повторяющихся повторов, которые быстро эволюционируют, можно предположить, что это тоже варианты клона ST8-t008-SCCmecIV.
Таблица 3. spa типы родственные t008 и последовательность повторов в них
spa тип Последовательность повторов
t008 11-19-12-21-----17-34-24-34-22-25
t3308 11-19-12-21-21-17-34-24-34-22-25
t024 11-----12-21-----17-34-24-34-22-25
t064 11-19-12-05-----17-34-24-34-22-25
t118 11-------------------------------------25
Международный эпидемический клон ST239 SCCmec III в детских стационарах РФ по нашим данным представлен spa типами t037, t030, которые являются основными, и некоторыми близкородственными, такими как t129, t363, t425, t233 и t7576 который был описан впервые.
Таблица 4. spa типы родственные t037 и последовательность повторов в них
spa тип Последовательность повторов
t037 15-12-16-02-25-17-24
t425 15-12-16-02-25-17-25
t363 15-----16-02-25-17-24
t030 15-12-16-02-----24-24
t129 15-12-----------------24
t7576 15-12-16---------34-24
t233 15-12
Данный, клон, который, по-видимому, является бразильско-венгерским, также широко распространен на протяжении всего периода наблюдения. К сожалению, количественных выводов о преобладании того или иного клона, из нашей работы сделать нельзя, т.к. проекты, в ходе которых собирались штаммы, отличались по дизайну и способ отбора штаммов для молекулярного типирования не подходит для статистической обработки. Сводные данные по полученным молекулярным типам МКБА представлены в табл. 5.
Таблица 5. Сводные данные по молекулярным типам МКБА выделенных у детей и подростков в РФ на протяжении периода с 1997 по 2008 гг.
ST spa SCCmec Число изолятов
t008 IV 43
8 t024 IV 2
t118 IV 2
t037 III 19
t030 III 8
t129 III 4
239 t363 III 2
t425 III 1
t7576 III 1
t233 III 1
1 t127 IV 1
154 t667 IV 1
Заключение
В настоящее время продолжают выявляться новые типы 8ССшес кассет, что говорит о продолжающейся эволюции этого элемента резистентности. В этих условиях первостепенное значение приобретает изучение эпидемиологической обстановки и контроль за распространением значимых клонов МИ8А. Методы субвидового типирования в последние десятилетия шагнули далеко вперед и способны быстро получить объективную информацию, которой легко можно обмениваться с помощью современных систем коммуникации, а также создавать базы данных молекулярных типов. В сложившихся условиях крайне желательно мониторировать не только антибиотикорезистентность, но и молекулярные типы возбудителей в каждом стационаре. В
случае невозможности выполнения типирования на месте, можно пользоваться услугами крупных
референтных центров.
Список литературы
1. Bischoff W.E., Edmond M.B. Staphylococcus aureus. A Guide to Infection Control in the Hospital. - 2002. -345 p.
2. Ito T., Katayama Y., Hiramatsu K. Cloning and nucleotide sequence determination of the entire mec DNA of pre-methicillin-resistant Staphylococcus aureus N315 // Antimicrob. Agents Chemother. - 1999. - V.43, N6. -P. 1449-1458.
3. Feil E.J., Enright M.C. Analyses of clonality and the evolution of bacterial pathogens // Curr. Opin. Microbiol. -2004. - V.7, N3. - P. 308-313.
4. Дмитренко O.A. Молекулярно-генетические аспекты эпидемиологии внутрибольничных инфекций, вызванных представителями вида Staphylococcus aureus, устойчивыми к метициллину/оксациллину. Дис... докт. мед.наук. - 2008. - 326 с.
5. Vorobieva V., Bazhukova T., Hanssen A.M. et al. Clinical isolates of Staphylococcus aureus from the Arkhangelsk region, Russia: antimicrobial susceptibility, molecular epidemiology, and distribution of Panton-Valentine leukocidin genes // APMIS. - 2008. - V.116, N10. - P. 877-887.
6. Хохлова O.E., Вей-Чун Хунг, Хигучи В. и др. Выявление венгерского пандемического клона MRSA в России // Клин.микробиол. Антимикробн. химиотерапия. - 2011. - Т.13, №2. - С. 101-200.
7. Ikawaty R., Willems R.J., Box A.T. et al. Novel multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis method for rapid molecular typing of human Staphylococcus aureus // J. Clin. Microbiol. - 2008. - V.46, N9. - P. 31473151.
8. Hardy K.J., Ussery D.W., Oppenheim B.A., Hawkey P.M. Distribution and characterization of staphylococcal interspersed repeat units (SIRUs) and potential use for strain differentiation // Microbiology. - 2004. - V.150, Pt. 12. - P. 4045-4052.
9. DNA Sequencing of the spa Gene (1.1) // http://www.ridom.de/doc/Ridom_spa_sequencing.pdf
10. Lu P.L., Chang J.C., Hsu H.T. et al. One tube multiplex PCR for simple screening of SCCmec I-V types of methicillin-resistant Staphylococcus aureus // J. Chemother. - 2008. - V.20, N6. - P. 690-696.
11. Deurenberg R.H., Stobberingh E.E. The molecular evolution of hospital- and community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus // Curr. Mol. Med. - 2009. - V.9, N2. - P. 100-115.
