CC BY
98
УДК 616.981.25-036.22(4+5)
ВЕДУЩИЕ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫЕ КЛОНЫ ЗОЛОТИСТОГО СТАФИЛОКОККА, ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ В ГЕОГРАФИЧЕСКИ УДАЛЕННЫХ РЕГИОНАХ ЕВРАЗИИ
А.Е. Гончаров1, Л.П. Зуева1, А.Н. Суворов3-2, Л.С. Глазовская4, Е.Б. Брусина4, И.С. Азизов5, А.В. Лавриненко5, Т.Н. Суборова6, О.Н. Софронова7, О.А. Ушкарева7, В.К. Ядрихинская7,
1ГОУ ВПО «Северо-западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова», г. Санкт-Петербург, 2ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»,
3ФГБУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук, г. Санкт-Петербург,
4ГБОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия», 5Карагандинский государственный медицинский университет,
6ФГБ ВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова», г. Санкт-Петербург, 7ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Республике Саха (Якутия)»
Гончаров Артемий Евгеньевич - e-mail: phage1@yandex.ru
С использованием методов Бра-сиквенстипирования изучена генетическая структура штаммов Staphylococcus aureus, циркулирующих в 2008-2013 годах в различных географических регионах России и Казахстана. Подтверждено, что доминирующими Бра-сиквенстипами MRSA являются штаммы, филогенетически родственные штаммам, относящимся к клональным комплексам CC8 и СС239. Обсуждается необходимость совершенствования системы эпидемиологического надзора за эпидемическими клонами стафилококков, включая создание сети референсных лабораторий.
Ключевые слова: Staphylococcus aureus, MRSA, Бра-секвестирование, географическое распространение, эпидемиологический надзор.
The genetic structure of Staphylococcus aureus, circulating in 2008-2013 in different geographical regions of Russia and Kazakhstan by using spa-typing has been studied.
Spa-types related to the clonal complex CC8 and CC239 were most predominant among MRSA strains. The need for improve an epidemiological surveillance for epidemic clones of staphylococci, including the creation of a network of reference laboratories, has been discussed.
Key words: Staphylococcus aureus, MRSA, spa-typing, geographical spread,
epidemiological surveillance.
Введение
Отмечаемая в последние годы глобализация распространения антибиотикорезистентных штаммов возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), позволяет поставить вопрос о необходимости систематического эпидемиологического надзора за ними. Одним из наиболее актуальных возбудителей ИСМП является Staphylococcus aureus, причем наибольшая степень эпидемиологической опасности связана с распространением метициллинрезистентных штаммов (MRSA), частота обнаружения которых в отдельных стационарах России достигает 50-60% [1]. Помимо значительной летальности и частоты осложнений, обусловленных MRSA-инфекциями, с ними связан значительный экономический ущерб. Так, по данным американских исследователей [2] стоимость одного случая MRSA-инфекции в лечебно-профилактическом учреждении превышает 60 000 долларов США.
Широкое эпидемическое распространение MRSA, как в госпитальной среде, так и в обществе, определяет интерес к генетической структуре популяций этого возбудителя.
Использование метода мультилокусного секвенирования-типирования позволило установить принадлежность многочисленных госпитальных штаммов MRSA всего лишь к 6 филогенетическим линиям (клональным комплексам): CC1, CC5, CC8/239, CC22, CC30, CC45. Наиболее диверсифицированными и многочисленными являются клональ-ные комплексы CC5 и CC8/239, которые содержат различные эпидемические штаммы и клоны, такие как EMRSA-1, -4, -7, -9, -11, Иберийский. В стационарах России выявлено эпидемическое распространение штаммов MRSA, генетически родственных EMRSA-1 (Бразильскому клону) и Иберийскому клону [3].
Одним из наиболее часто использующихся методов молекулярно-генетического типирования, позволяющих с высокой степенью достоверности оценить клональную структуру золотистого стафилококка, является метод сек-венирования-типирования вариабельного X-сегмента гена поверхностного протеина А (spa-секвестирование). Показано, что данный метод применим и для расследования локальных эпидемических вспышек стафилококковой инфекции, и для изучения глобального распространения отдельных эпидемических клонов данного микроорганизма [4].
В то же время популяционная структура S. aureus, циркулирующих на территории России и государств, входивших в состав бывшего Советского Союза, не может считаться в достаточной степени изученной методом spa-секвестирования.
Цель исследования состояла в том, чтобы оценить генетическую структуру локальных популяций золотистого стафилококка, циркулирующих в географически удаленных регионах Евразии, методом spa-секвестирования с целью выявления эпидемиологически значимых spa-сиквенстипов, имеющих наибольшую географическую распространенность.
Материал и методы
В исследование включены изоляты, выделенные в 2008-2013 годах у пациентов десяти лечебно-профилактических учреждений различного профиля и
географической локализации (3 лечебно-профилактических учреждения в Санкт-Петербурге, два учреждения в Кемерово, по одному стационару в Перми и Караганде).
Кроме того, исследованная популяция стафилококков включила в себя культуры, выделенные при назальном носительстве в группах практически здоровых взрослых лиц (добровольцев), рекрутированных из числа коренного населения Чукотки (г. Анадырь) и Республики Саха (Якутия).
Характеристика изученных культур представлена в таблице.
Видовую идентификацию микроорганизмов и определение чувствительности к антибиотикам осуществляли на микробиологическом анализаторе MicroScan autoSCAN-4 (Siemens, ФРГ). Данные об антибиотикорезистентности интерпретировали согласно требованиям CLSI, в частности к метициллинрезистентным относили штаммы, устойчивые к концентрациям оксациллина, большим, чем 2 мг/л.
Бактериальную ДНК получали методом «горячего лизиса» (при 95°С) клеточной суспензии в виде биомассы 2-3 колоний, выросших на 5% кровяном агаре (объем пробы 100 мкл, время обработки 15 мин) с очисткой центрифугированием.
Амплификацию гена spa проводили с использованием праймеров и условий реакции, предложенных D. Harmsen [4]. Секвенирование осуществляли в автоматической капиллярной системе MegaBACE 1000 DNA Analysis System (GE Healthcare, США).
Результаты секвенирования гена spa обрабатывали, используя данные web-сайта http://www.ridom.de/ spaserver/.
Результаты и их обсуждение
Как видно из данных, представленных в таблице, популяция изученных штаммов золотистого стафилококка представлена главным образом изолятами, отнесенными к 15 различным spa-сиквенстипам (t632, t041, t024, t008, t052, t121, t1171, t11805, t030, t932, t2032, t37, t1202, t435 и t502). Ряд spa-сиквенстипов обнаружил тенденцию к широкому географическому распространению. Так, spa-типы t008, t024, t11805, t030 обнаруживались в стационарах более чем одного географического региона. При этом обращает на себя внимание преобладание spa-типов, филогенетически родственных штаммам эпидемического клонального комплекса CC8/239. В частности, spa-тип t008 является одной из наиболее древних клональных линий метициллинрезистентных золотистых стафилококков (MRSA). По данным web-ресурса http://spa.ridom.de [5] штаммы данного генотипа формируют эпидемические вспышки в стационарах Европы, Северной и Южной Америки, начиная с 2001 года. В частности, ранее нами при использовании комбинации пульс-электрофореза и spa-сиквенсти-пирования был установлен факт циркуляции в двух стационарах Санкт-Петербурга эпидемического штамма MRSA BT2007, отнесенного к данному spa-сиквенстипу и пульс-электротипу I [6].
Spa-секвестр t024 является родственным секвестру t008, но отличается от последнего делецией в вариабельной части гена spa, приведшей к отсутствию прямого повтора в одной из позиций. Данный генотип появился в
Санкт-Петербурге не позднее 2008 года, когда впервые штамм данного spa-сиквенстипа был выявлен у пациента с ВИЧ-инфекцией [6].
Идентифицированные в Караганде и Москве при вспышках внутрибольничной инфекции штаммы spa-сиквенстипа Ю30 также обнаруживают филогенетическое родство штаммам клонального комплекса СС8/239. Штаммы данного сиквенстипа являются преобладающими в стационарах Китая [7]. Кроме того, ранее отмечалось, что российские штаммы MRSA данного spa-типа, циркулирующие на Дальнем Востоке, представляют собой гибридные варианты генетического материала, полученные в результате генетического обмена штаммов клональных комплексов СС8/239 и СС30 [8].
Штаммы других эпидемических клональных комплексов встречались с меньшей частотой. Так, циркуляция штаммов spa-типа Ю41, филогенетически родственного эпидемическому клональному комплексу СС5, была обнаружена только в одном из стационаров Санкт-Петербурга.
Кроме того, появление в российских лечебно-профилактических учреждения отдельных spa-сиквенстипов MRSA позволяет идентифицировать необычные эпидемиологические связи между удаленными географическими регионами.
Так, например, spa-сиквенстип t932, циркулировавший в Кемерово, ранее обнаруживался в стационарах Ближнего Востока [9], что не исключает возможности завоза данного генотипа MRSA с лицами, совершающими туристические поездки в данный регион.
В отличие от госпитальных штаммов MRSA, демонстрирующих четкую клональную структуру с преобладанием небольшого числа spa-типов, популяция метициллин-чувствительных стафилококков является генетически гете-
рогенной. Обращает на себя внимание кластер из трех случаев стафилококковой инфекции, возникший в амбулаторных условиях и обусловленный MSSA spa-типа 435. Тяжелые случаи инфекций кожи и мягких тканей, обусловленные штаммами этой филогенетической линии, отмечались ранее в педиатрическом стационаре Риги (Латвия) [10].
Выводы
Таким образом, закономерности географического распространения эпидемических клонов Staphylococcus aureus в России и Казахстане отражают особенности географического положения этих стран, как своеобразного моста между Европой и Азией. Распространение международных эпидемических клонов MRSA диктует необходимость включения в существующие программы инфекционного контроля дополнительных мероприятий, направленных на недопущение заноса данных микроорганизмов в стационар, и предполагает изменение алгоритма микробиологического обследования пациентов, переводимых в стационар из других учреждений. В настоящее время необходимость эпидемиологического наблюдения за распространением штаммов золотистого стафилококка, относящихся к эпидемическим клональным комплексам, не вызывает сомнения и требует организации систематических, а не эпизодических многоцентровых исследований, а также организации референсных центров по молекулярно-генетическому мониторингу за возбудителями ИСМП на региональном и национальном уровнях.
Представленная работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований № 12-04-31195 мол-а и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, соглашение о предоставлении гранта № 8157.
ТАБЛИЦА.
Результаты spa-сиквенстипирования коллекции штаммов Staphylococcus aureus, выделенных из различных регионов России и Казахстана
spa-сиквенстип Метициллинрезистентные штаммы Staphylococcus aureus (MRSA) Метициллин-чувствительные штаммы Staphylococcus aureus (MSSA)
Караганда, Казахстан, многопрофильный стационар С.-Петербург, онкологический стационар С.-Петербург, травматологический стационар С.-Петербург, ожоговый стационар Москва, нейрохирургический стационар Кемерово, хирургический стационар Кемерово, ожоговый центр Новокузнецк, хирургический стационар Пермь, хиругический стационар С.-Петербург, амбулаторная хирургия Анадырь, назальное носительство Якутск, назальное носительство
t632 0 5 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0
t041 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
t024 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
t008 0 2 1 5 0 12 0 0 1 0 0 0
t052 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
t121 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
t1171 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
t11805 0 0 0 0 0 1 5 0 1 0 0 0
t030 1 0 0 0 10 0 0 0 0 0 0 0
t932 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0
t2032 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0
t037 0 0 0 0 0 5 1 0 0 0 0 0
t1202 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0
t435 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0
t502 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0
другие 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 2 3
Итого: 6 11 2 0 10 22 6 3 2 4 4 3
ЛИТЕРАТУРА
1. URL:http//www.antibiotic.ru (дата обращения 18.08.2014).
2. Anderson D.J., Kaye K.S., Chen L.F., Schmader K.E. et al. Clinical and financial outcomes due to methicillin resistant Staphylococcus aureus surgical site infection: a multi-center matched outcomes study. PLoS One. 2009. Dec. 15. № 4 (12). Р. 8305. doi: 10.1371/journal.pone.0008305.
3. Афанасьев М.В., Каракашев С.В., Ильина Е.Н., Салем А.С.-А.М., Сидоренко С.В., Говорун В.М. Молекулярно-генетическая характеристика метициллин-устойчивых штаммов Staphylococcus aureus, выделенных в стационарах Москвы. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2010. № 2. С. 20-24.
Afanas'ev M.V, KarakashevS.V., Il'ina E.N., Salem A.S.-A.M, Sidorenko S.V., Govorun V.M. Molekulyarno-geneticheskaya xarakteristika meticillin-ustojchivyx shtammov Staphylococcus aureus, vydelennyx v stacionarax g. Moskvy. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya. 2010. № 2. S. 20-24.
4. Harmsen D., Claus H., Witte W., Roth^nger J. et al. Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting by using novel software for spa repeat determination and database management. J Clin Microbiol. 2003. № 41. Р. 5442-5448.
5.URL: http://spa.ridom.de/spa-t008.shtml (дата обращения 18.02.2014).
6. Гончаров А.Е., Olsson-Liljequist B., Зуева Л.П. и др. Эпидемический штамм
метициллинрезистентного Staphylococcus aureus в стационарах Санкт-Петербурга. Журн. микробиол. 2010. № 5. С. 24-29.
Goncharov A.E., Olsson-Liljequist B, Zueva L.P., i dr. E'pidemicheskij shtamm meticillin-rezistentnogo Staphylococcus aureus vstacionarax Sankt-Peterburga. Zhurn. mikrobiol. 2010. № 5. S. 24-29.
7. He W., Chen H., Zhao C., Zhang F. Population structure and characterisation of Staphylococcus aureus from bacteraemia at multiple hospitals in China: association between antimicrobial resistance, toxin genes and genotypes.Int J Antimicrob Agents. 2013. Sep. № 42 (3). Р. 211-9. doi: 10.1016/j. ijantimicag.2013.04.031. Epub 2013 Jul 18.
8. Yamamoto T., Takano T., Higuchi W., Iwao Y., Singur O. et al. (2012) Comparative Genomics and Drug Resistance of a Geographic Variant of ST239. Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Emerged in Russia. PLoS ONE 7(1). 29187. doi:10.1371/journal.pone.0029187
9. Sabri I., Adwan K., Essawi T.A., Farraj M.A. Molecular characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates in three different Arab world countries. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2013. Sep. № 3 (3). Р. 183-7. doi: 10.1556/ EuJMI.3.2013.3.5. Epub. 2013. Sep. 23.
10. Cupane L., Pugacova N., Berzina D., Cauce V., Gardovska D., Miklasevics E. Patients with Panton-Valentine leukocidin positive Staphylococcus aureus infections run an increased risk of longer hospitalisation. Int J Mol Epidemiol Genet. 2012. № 3 (1). Р. 48-55. Epub. 2012. Feb. 28. [yi_
