CC BY
8УДК 577.216.9
А. М. Шишлова-Соколовская1, Е. П. Кветко1, П. В. Кузмицкая1, О. Ю. Урбанович1, Г. Б. Боровский2
СОЗДАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ NICOTIANA TABACUM С ИНСЕРЦИЕЙ ГЕНА TADHN19.3, КОДИРУЮЩЕГО ДЕГИДРИН
ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: s_anastasia78@mail.ru 2Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук» Российская федерация, 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132 e-mail: borovskii@sifibr.irk.ru
С целью изучения влияния гена TaDHN19.3, кодирующего дегидрин озимой пшеницы, на развитие толерантности к низким температурам нами была создана генетическая векторная конструкция pBI121_TaDHN19/EGFP на основе бинарного вектора pBI121. В данной конструкции ген TaDHN19.3, выделенный из озимой пшеницы (Triticum aestivum) сорта белорусской селекции Капылянка, находится в слитой рамке считывания с геном зеленого флуоресцентного белка EGFP. Используя метод Agrobacterium-опосредованной трансформации листовых дисков, с помощью генетической векторной конструкции pBI121_TaDHN19/EGFP были получены трансгенные растения Nicotiana tabacum, экспрессирующие химерный ген.
Ключевые слова: Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1, ген ndb2, Triticum aestivum, Eserishia coli dh5a, Agrobacterium tumifaciens, ген TaDHN19.3, кодирующий дегидрин озимой пшеницы, ген EGFP, холодовая устойчивость.
Введение
Различные абиотические стрессы, такие как холод, засуха, засоление, затопление, воздействие критических температур, токсические концентрации тяжелых металлов, высокая кислотность или щелочность почв, повышенное содержание озона, дефицит элементов минерального питания и т. д., снижают продуктивность сельскохозяйственных растений в два раза и более, а при высокой интенсивности и достаточно длительном воздействии стресса приводят их к гибели [1, 2]. Для растений, подвергшихся холодовому стрессу, характерны нарушения ферментативных реакций, скорости передвижения субстратов, мембранного транспорта и др. [3]. При температурном воздействии происходит индукция синтеза белков, ассоциированных со стрессом, на фоне замедления или прекращения общего белкового синтеза [4]. Холодовая акклиматизация растений ассоциируется со специфическими генами, экспрессия которых приводит к изме-
нению метаболизма и физиологических функций, затрагивая уровни фитогормонов и анти-оксидантов, осмолитов и защитных белков, в том числе и шаперонов, а также белков с неизвестными пока функциями [5, 6]. Выделяют несколько главных этапов в ответе клеток на стресс: образование сигналов, которые передаются в ядро и взаимодействуют с генами, изменяя их экспрессию; индукция или репрессия синтеза специфических мРНК и их трансляции; образование стрессовых белков [7-11]. Стрессовые белки синтезируются в количестве до 2% от белков, образующихся в нормальных условиях, причем их синтез носит временный характер [12]. Среди таких белков особое место принадлежит дегидринам, экспрессия генов которых и накопление белкового продукта происходит при водном дефиците, засолении, гипотермии, вызывающих нарушение водного баланса [13-15].
Дегидрины относятся к классу LEA-белков (Late embryogenesis abundant) — белков
позднего эмбриогенеза растений, характеризующихся высокой гидрофильностью, термостабильностью. Данные белки обнаружены во всех таксономических группах царства растений [13, 16]. Класс LEA-белков включает 5 разнородных белковых групп, при этом де-гидрины объединяются в самостоятельную II группу или D11 семейства LEA-белков [13, 17]. Локализуются дегидрины главным образом в цитоплазме, ядрах клеток растений, митохондриях, хлоропластах [18, 19]. На основании сравнительного анализа нуклеотидных и соответствующих аминокислотных последовательностей была разработана классификация дегидринов, согласно которой различают 5 классов данных белков: YnSK2, Кп, KnS, SKn, Y2Kn [13, 20]. Принадлежность дегидринов к вышеперечисленным классам определяется наличием консервативных участков, условно обозначенных К-, Y-, S-сегментов [13, 20, 21]. Дегидрины относят к неструктурированным белкам с высокой степенью конформацион-ной лабильности. Сочетание вариабельных сегментов Y, S с консервативным К-сегментом определяет функциональные свойства деги-дринов [6, 15, 22].
Низкая температура является главным стрессовым фактором, индуцирующим экспрессию генов, кодирующих дегидрины. В условиях низких температур происходит нарушение водного баланса, а физико-химические и структурные особенности дегидринов обуславливают их вовлечение в сохранение целостности клеточной структуры и мембран, в защиту биополимеров клетки, предотвращая их денатурацию и последующую коагуляцию в условиях обезвоживания клетки и проявление криопро-текторной, антифризной, антиоксидантной и металлосвязывающей функций [6, 15, 22].
Несмотря на значительное количество работ, посвященных дегидринам, роль отдельных генов этого класса в ответе на стресс остается
не до конца выясненной. Удобной моделью для выяснения роли дегидринов в устойчивости растений к стрессу в настоящее время являются трансгенные растения. Защитная роль дегидринов в растениях показана в ряде работ по созданию трансгенных растений и в исследованиях по устойчивости к засухе, засолению и неблагоприятным температурным воздействиям на различных сортах сельскохозяйственных культур [15, 22]. Цель данной работы — создание трансгенных растений Nicotiana tabacum, несущих в своем геноме вставку гена TaDHN19.3, кодирующего деги-дрин озимой пшеницы, для исследования влияния данного гена на развитие толерантности к низким температурам.
Материалы и методы
Создание векторных конструкций. Источником для клонирования нативного гена TaDHN19.3 размером 375 п. о. послужили растения озимой пшеницы (Triticum aestivum) сорта белорусской селекции Капылянка. Препараты ДНК из зерен пшеницы выделяли с помощью Genomic DNA Purification Kit (Thermo Fisher Scientific, EC) согласно протоколу производителя. Для получения полноразмерного гена TaDHN19.3 с открытой рамкой считывания использовали ПЦР с синтетическими олигонукле-отидами, представленными в таблице 1.
Продукты амплификации выделяли из ага-розного геля с помощью набора реагентов Gene JetTM Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific, EC). Выделенные ампликоны лиги-ровали в плазмиду pTZ57R/T, которой трансформировали штамм E. coli DH5a с помощью Ins TAclone™ PCR Cloning Kit (Thermo Fisher Scientific, EC) согласно рекомендациям производителя. После выращивания на среде LB с антибиотиком ампициллином из трансформантов выделяли плазмидную ДНК с помощью Plasmid Gene JetTM Miniprep Kit (Thermo Fisher
Таблица 1
Последовательности синтетических олигонуклеотидов, разработанных для амплификации
гена TaDHN19.3
Название олигонуклеотида Последовательность 5'-3'
TaDHN19F AGATTTCCCGAGGGACAA
TaDHN19R GAAGTTGGCCATCTTATTAT
Scientific, EC) согласно протоколу производителя. Фрагмент, встроенный в плазмидную ДНК, секвенировали с помощью праймеров к последовательности полилинкера вектора pTZ57R/T M13F (GTAAAACGACGGCCAGT) и M13R (CAGGAAACAGCTATGAC). Для проведения реакции секвенирования по Сэн-гену использовали набор реагнтов Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Анализ полученной нукле-отидной последовательности выполняли с помощью программы Mega6, CLUSTALW и алгоритма BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) [23-25]. Полученный в результате секвенирования полноразмерный ген TaDHN19.3 с открытой рамкой считывания размером 375 п. о. далее использовали для создания генетической конструкции pBI121_TaDHN19/EGFP.
Основой для создания генетической конструкции pBI121_TaDHN19/EGFP служил бинарный вектор pBI121 [26]. Донором гена EGFP служил вектор pEGFP, содержащий ген EGFP размером 720 п. о. Для того чтобы амплифицировать полноразмерные гены зеленого флуоресцентного белка (EGFP), деги-дрина пшеницы (TADHN19.3) с дополнительными сайтами эндонуклеаз рестрикции и ген TaDHN19.3 в одной транскрипционной рамке с геном EGFP без стоп-кодона и с шарниром на 5/- конце были использованы синтетические олигонуклкеотиды, представленные в таблице 2. Подбор олигонуклкеотидов осуществлялся с помощью программы SnapeGene.
Объем смеси для амплификации полноразмерных генов EGFP, TaDHN19.3 и TADHN19/ EGFP с дополнительными сайтами эндону-
клеаз рестрикции для одного образца составлял 50 мкл. В смесь входили следующие реагенты: 1-200 нг ДНК, 5 мкл 10Х буфера Tersus Plus buffer фирмы Евроген, 5мкл 10мМ смеси нуклеотидов (dNTP) (Thermo Fisher Scientific, EC), 5 мкл каждого из праймеров, 1 мкл 50х Tersus-polymerase Mix (Евроген), 19 мкл H2O. Амплификацию проводили в амплификаторе «BioRad» с использованием следующих программ для гена EGFP: денатурация — 94 оС 4 мин; отжиг праймеров — 94 оС 1 мин; 63 оС 45 сек; 72 оС 1 мин, 30 циклов; ренатурация — 72 оС 5 мин; 4 оС ю мин. Для гена TaDHN19.3: денатурация — 94 оС 4 мин; отжиг прайме-ров — 94 оС 1 мин; 60 оС 45 сек; 72 оС 1 мин, 30 циклов; ренатурация — 72 оС 5 мин; 4 оС ю мин. Для химерного гена TaDHN19/EGFP: денатурация — 94 оС 5 мин; отжиг прайме-ров — 94 оС 1 мин; 65 оС 1 мин; 72 оС 1 мин, 35 циклов; ренатурация — 72 оС 7 мин; 4 оС ю мин. Продукт реакции разделяли в 1% ага-розном геле с бромистым этидием в электрическом поле с помощью камеры для горизонтального электрофореза фирмы «BioRad». Фрагмент после электрофореза визуализировали с помощью системы BioRad GelDoc2000.
Синтез химерного гена TaDHN19/EGFP проводили методом лигирования с использованием Т4 лигазы (Thermo Fisher Scientific, EC) по сайту эндонуклеазы рестрикции BamHl, предварительно введенному в полноразмерные гены EGFP, TaDHN19.3 методом ПЦР. Полученный химерный ген TaDHN19/EGFP клонировали в вектор pBI121 по сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикции XbaI и SacI. Для трансформации бактериальных клеток
Таблица 2
Последовательность и температура отжига синтетических олигонуклеотидов, использованных при создании векторной конструкции
Название олигонуклеотида Последовательность 5'-3' Температура отжига, °С
deg-F cccgggtctagaaacaatggagcaccaggggcacggcgcaggcg 78
deg-R ggatccgtgctgtccaggcag 62
egfp-F ggatccccgggtaccggtcgacccacctaggtgagcaagggcgag 74
egfp-R ggtaccgagctcttacttgtacagctcgtc 64
deg/egfp -F cccgggtctagaaacaatggagcaccaggggcacggcgcaggcg 78
deg/egfp -R ggtaccgagctcttacttgtacagctcgtc 64
Eserishia coli штамма DH5a лигационной смесью, содержащей плазмидную ДНК, был выбран метод теплового шока.
Трансформацию Agrobacterium tumifaciens штамма EHA105 осуществляли по одной из общепринятых методик, а именно с помощью трехродительтского скрещивания [26]. Отбор агробактериальных клонов с целевой векторной конструкцией проводили на питательной среде с добавлением селективных агентов канамицина (100 мг/л) и рифампици-на (50 мг/л). Наличие векторной конструкции в агробактериальных колониях подтверждали методом ПЦР со специфичными праймера-ми к гетерологичному гену TaDHN19/EGFP. Рекомбинантные колонии Agrobacterium tumifaciens штамма EHA105, в которых было подтверждено методом ПЦР наличие целевой векторной конструкции, далее использовали в Agrobacterium-опосредованной трансформации листовых дисков Nicotiana tabacum sv. Petit Havana SR1.
Агробактериальная трансформация. В качестве объекта для стабильной интеграции и изучения эффективной работы конструкции pBI121_TaDHN19/EGFP использовалась линия табака Nicotiana tabacumcv. Petit Havana SR1. Для введения гетерологичного гена TaDHN19/EGFP применяли Agrobacterium-опосредованную трансформацию листовых дисков 3-4-недельных растений табака, выращенных в асептических условиях (температура 24 °С, освещенность 4000-5000 люкс при 16/8 (свет/темнота) фотопериоде). Для инициации процессов морфогенеза и отбора первичных трансформантов использовали питательные среды CIM, SIM и T-med с селективным агентом канамицином в концентрации 50 мг/л.
Молекулярно-генетический анализ. Выделение растительной ДНК выполняли с помощью набора Genomic DNA Purification Kit (Thermo Fisher Scientific, EC) по методике изготовителя. Интеграцию гетерологичного гена в растительный геном определяли с помощью ПЦР. Объем смеси для амплификации одного образца составлял 25 мкл, в смесь входили следующие реагенты: 100-200 нг ДНК, 2,5 мкл 10Х буфера с (NH4)2SO4 фирмы (Thermo Fisher Scientific, EC), 2,5 мкл 10мМ смеси нуклео-тидов (dNTP) (Thermo Fisher Scientific, EC),
2 мкл 25мМ MgCL2 (Thermo Fisher Scientific, EC), 2,5 мкл каждого из праймеров, 0,2 мкл 5ед. Taq ДНК-полимеразы (Thermo Fisher Scientific, EC), 10,7 мкл H2O. Для идентификации присутствия гетерологичного гена TaDHN19/EGFP использовали специфические праймеры, представленные в таблице 1. Амплификацию проводили в амплификаторе «BioRad» с использованием следующей программы: денатурация — 94 оС 5 мин; отжиг праймеров — 94 оС 1 мин; 65 оС 1 мин; 72 оС 1 мин, 35 циклов; ренатурация — 72 оС 7 мин; 4 оС œ мин. Продукт реакции разделяли в электрическом поле с помощью камеры для горизонтального электрофореза фирмы «BioRad» в 1% агарозном геле с бромистым этидием. Фрагмент после электрофореза визуализировали с помощью системы BioRad GelDoc2000.
Транскрипционную активность химерного гена TaDHN19/EGFP в трансформантах табака подтверждали с помощью метода ОТ-ПЦР Для этого выделяли тотальную PНК с помощью набора реагентов Gene JET Plant RNA Purification Mini Kit (Thermo Fisher Scientific, EC) по методике изготовителя. Синтез кДНК на матрице PНК осуществлялось с помощью набора реагентов First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, EC) по методике изготовителя. Дальнейший ПЦP-анализ на основе синтезированной кДНК, комплементарной мPНК, проводили в амплификаторе «BioRad» с использованием специфических праймеров и программы, описанных выше. Продукт реакции разделяли в 1% агарозном геле с бромистым этидием в электрическом поле с помощью камеры для горизонтального электрофореза фирмы «BioRad». После электрофореза фрагмент визуализировали с помощью системы GelDoc2000 BioRad.
Результаты и обсуждение
Известно, что экспрессия дегидринов является одним из компонентов системы защиты растений от абиотического стресса. В формировании ответа растения на холодовой стресс принимают участие дегидрины SK3-, Kn- и ^-типов. На первом этапе данной работы было проведено изучение вариабельности нуклеотидных последовательностей гена ТaDHN19.3 по классификации Wang et al. [27], относящегося к типу K-3 у сортов пшеницы,
созданных на разной генетической основе. Интерес к этому локусу обусловлен участием кодируемого им продукта в защите растения от воздействия различных неблагоприятных абиотических факторов. Так, было показано, что экспрессия белков, кодируемых геном ТaDHN19.3, возрастает при дегидратации и охлаждении в корнях и листьях растений пшеницы и только в корнях - при засолении [27].
На основании нуклеотидной последовательности мРНК, кодирующей дегидрин ТaDHN19.3 (номер доступа в GenBank АВ272228), были разработаны синтетические олигонуклеотиды, позволяющие ампли-фицировать полноразмерную открытую рамку считывания гена ТaDHN19.3 (табл. 1). С помощью данных олигонуклеотидов были получены последовательности генов ТaDHN19.3 из 6 сортов яровой и озимой пшеницы. В случае сорта Фантазия было получено 2 аллельных варианта данного гена. Анализ выравниваний нуклеотидных последовательностей открытых рамок считывания, кодирующих дегидрины ТaDHN19.3, показал их высокую консервативность. Степень идентичности колебалась в пределах 98,23-100%. Так, полностью идентичными оказались последовательности, выделенные из сортов Каравай, Капылянка, Сукцесс, один из аллельных вариантов сорта Фантазия, а также последовательность из базы данных GenBank АВ272228, полученная из японского сорта ЗДШоки. Наибольшее число отличий от других гомологичных генов имел один из аллелей, выделенных из пшеницы сорта Фантазия. Сравнение нуклеотидных последовательностей генов ТaDHN19.3, выделенных из геномов пшеницы, созданных на разной генетической основе, показало присутствие точечных мутаций. Все они являлись однонуклеотидными заменами, инсерций и делеций обнаружено не было [28].
Трансляция открытых рамок считывания т silico и анализ последовательностей гипотетических белков показали степень идентичности в пределах 96,43-100%. Больше всего отличий по аминокислотному составу имел один из аллельных вариантов высокоустойчивого к холоду сорта Фантазия (3 аминокислотных замены). По одной аминокислотной замене было выявлено в аллельных вариантах гена ТaDHN19.3, выделенных из сортов Бонпэйн
и Ростань. Примечательно, что оба эти сорта относятся к яровым формам.
Таким образом, различия в нукледотидных последовательностях гена ТaDHN19.3, по всей видимости, не могут объяснить разницу между устойчивостью к низким температурам между высокоустойчивыми озимыми сортами и яровыми. Поэтому с целью исследования функциональной активности гена ТaDHN19.3 и изучения его роли в формировании у растений толерантности к низким температурам на модельном объекте (Nicotiana tabacum) была создана векторная генетическая конструкция pBI121_TaDHN19/EGFP, содержащая ген ТaDHN19.3 в одной транскрипционной рамке с геном зеленого флуоресцентного белка EGFP. Источником для клонирования натив-ного гена ТaDHN19.3 для создания трансгенных растений служил сорт озимой пшеницы белорусской селекции Капылянка. Данный сорт обладает высокой устойчивостью к низким температурам.
С помощью метода ПЦР и синтетических олигонуклеотидов deg-F и deg-R была произведена модификация гена TaDHN19.3, а именно: на 5'-концевой участок были добавлены сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции XmaI, XbaI и консенсусная последовательность Козака, на 3/-концевой участок — сайт узнавания эндонуклеазой рестрикции BamHI, также удален стоп-кодон. Полученный фрагмент амплификации соответствует теоретически ожидаемому — 394 п. о. Подбор и модификацию специфичных олигонуклеотидов к 5'- и 3'-концевым участкам гена ТaDHN19.3 проводили на основе нуклеотидной последовательности. Аналогичным способом был получен модифицированный ген EGFP размером 720 п. о. посредством синтетических олигонуклеотидов gfp-F и gfp-R. На 5-конце-вой участок гена EGFP были добавлены сайт узнавания эндонкулеазой рестрикции BamHI и шарнир из 7 аминокислотных остатков — «рш^1у-Шг^1у-а^-рш-Шг» для гибкой связи доменов гибридного белка, а на 3-концевой участок — сайты узнавания эндонкулеазами рестрикции Бас1, ^п1.
Лигирование полноразмерных генов TaDHN19.3 и EGFP проводили по предварительно введенному методом ПЦР сайту узнавания эндонуклеазой рестрикции BamHI для
получения химерного гена TaDHN19/EGFP размером 1147 п.о. Используя специфические праймеры к 5^концевому участку гена TaDHN19.3 и З^концевому участку гена EGFP из лигационной смеси был амплифициро-ван химерный ген TaDHN19/EGFP размером 1147 п. о. Полученный химерный ген ТаВИЫ19/ EGFP был клонирован в бинарный вектор рВ1121 по сайтам узнавания эндонулеазами рестрикции XbaI и SacI. Схема полученной векторной конструкции представлена на рисунке 1.
Генетическая конструкция pBI121_TaDHN19/ EGFP содержит гетерологичный ген ТаВИЫ19/ EGFP под контролем конститутивного промотора из вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S-pшmoter) и нопалинсинтазого терминатора (М^^егттаШг). Кроме этого, векторная конструкция несет селективный ген NeoR/KanR устойчивости к антибиотику канамицину для отбора растительных трансформантов.
Для создания трансгенных растений табака, несущих в своем геноме ген ТаВИЫ19/ EGFP, был использован метод Agrobacterium-опосредованной трансформации.
Методом трехродительского скрещивания созданная генетическая конструкция была
введена в агробактериальный штамм EHA105. Отбор рекомбинантных штаммов проводили на селективной среде. Инсерция гетерологич-ного гена TaDHN19/EGFP в рекомбинантных клонах Agrobacterium tumifaciens была подтверждена методом ПЦР.
В качестве эксплантов при Agrobacterium-опосредованной трансформации были использованы листовые диски, полученные из листьев 3-4-недельных растений табака, выращенных в подобраных ранее условиях [29].
В результате Agrobacterium-опосредованной трансформации листовых дисков табака конструкцией pBI121_TaDHN 19/EGFP из мор-фогенного каллуса (частота каллусогенеза составила 95%) было получено 28 первичных регенерантов. В процессе культивирования корни образовали 4 регенеранта. Частота регенерации составила 14,28% от количества первичных регенерантов.
Регенеранты, полученные в результате Agrobacterium-опосредованной трансформации с помощью конструкции pBI121_TaDHN19/ EGFP, в дальнейшем подвергались молекуляр-но-генетическому анализу. Сомаклональная изменчивость в культуре in vitro при отборе на
Рис. 1. Схема векторной конструкции pBI121_TaDHN19/EGFP:RB T-DNA repeat LB T-DNA repeat — правый и левый концевые повторы области Т-ДНК; TaDHN19/EGFP — химерный ген, состоящий и гена TaDHN19 дегидрина пшеницы и гена EGFP;NOS-promotor — промотор нопалин-синтазы; KanR — ген аминогликозид фосфотрансферазы для селекции бактерий;NeoR/KanR — ген аминогликозид фос-фотрансферазы из транспозона Tn5 для селекции растительных трансформантов; NOS-terminator —нопалин-синтазный терминатор; CaMV 35S-promoter — конститутивный промотор из вируса мозаики цветной капусты
селективной среде, содержащей антибиотик канамицин, не позволяет считать трансформанты истинными трансгенными растениями [30], поэтому для подтверждения интеграции гете-рологичной вставки был проведен молекуляр-но-генетический анализ. Наличие гетерологич-ной инсерции определяли методом ПЦР в ДНК первичных регенерантов, отобранных на антибиотике канамицине, с использованием синтетических олигонуклеотидов deg/egfp-F и deg/ egfp-R. Амплифицированный фрагмент размером 1147 п. н. свидетельствует о присутствии гетерологичной целевой последовательности в исследуемой растительной ДНК (рис. 2).
Экспрессия химерного гена TaDHN19/EGFP была подтверждена методом ОТ-ПЦР суммарной мРНК трансформантов, так как наличие чужеродного гена в растительном геноме не всегда определяет его функциональную активность и синтез белка в необходимом количестве (рис. 3). Значительное влияние на эффективность экспрессии гена оказывает место интеграции Т-ДНК в растительном геноме. В частности, интеграция гетерологичного гена в область гетерохроматина может привести к за-молканию трансгена, а также в процессе онтогенеза возможно изменение уровня экспрессии трансгена или его полная инактивация [31, 32].
Таким образом, в результате проведенного молекулярно-генетического анализа показано, что в геном Nicotiana tabacum с помощью векторной конструкции pBI121_TaDHN19/EGFP
m 1 2 3 4 k m
Рис. 2. Электрофореграмма ПЦР-продукта, выявленного при амплификации ДНК регенерантов табака со
вставкой химерного гена TaDHN19/EGFP m — маркер молекулярного веса GeneRuler 100 bpDNALadder (Thermo Fisher Scientific); 1-4 — анализируемые трансгенные растения; к. — исходное растение табака
m 1 2 3 4 m kl k2 k3
Рис. 3. Электрофореграмма ПЦР-продукта (1147 п. н.), выявленного при амплификации кДНК регенерантов табака, несущих инсерцию химерного гена TaDHN19/EGFP m — маркер молекулярного веса GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific); 1-4 — анализируемые трансгенные растения; k1 — исходные растения табака; k2 — смесь реагентов синтеза к-ДНК; k3 — смесь ПЦР реагентов
посредством агробактериальной трансформации листовых дисков происходит перенос целевой последовательности, несущей нативный ген TaDHN19.3, кодирующий дегидрин озимой пшеницы, слитый с геном EGFP, и транскрипция целевой вставки.
Трансгенные растения являются удобной моделью для выяснения функции генов, вовлеченных в стрессовый ответ. Так, например, с их помощью показана роль генов DREB-семейства пшеницы и ячменя в ответе на засуху и холодовой стресс [33]. Также введение в геном растений генов, ассоциированных со стрессом, позволяет повысить их устойчивость к абиотическим факторам внешней среды. В частности, увеличение уровня экспрессии гена HvSNAC1, относящегося к транскрипционным факторам, привело к увеличению устойчивости ячменя к дефициту влаги на разных стадиях роста [34]. Экспрессия генов DREB / CBF под промотором HDZI-4 привела к значительному увеличению урожайности зерна трансгенной пшеницы. Экспрессия этих же генов под промоторами HDZI-3 и HDZI-4 повысила устойчивость к засухе и заморозкам трансгенный ячмень и морозоустойчивость трансгенных проростков пшеницы [35]. Сверхэкспрессия гена яблони MdIAA9 в растениях табака значительно увеличила устойчивость к осмотическим стрессам [36].
Заключение
Используя методы молекулярного клонирования, создана векторная генетическая конструкция с геном TaDHN19.3, слитым с геном EGFP, кодирующим зеленый флуоресцентный белок. С помощью данной конструкции посредством Agrobacterium-опосредованной трансформации листовых дисков получены первичные трансгенные растения Nicotiana tabacum, экспрессирующие целевой ген. Полученные трансгенные растения табака, несущие в своем геноме химерный ген TaDHN19/EGFP, являются удобной моделью для изучения роли гена и места локализации белка дегидрина озимой пшеницы в ответе на моделируемые условия абиотического стресса. Дальнейший анализ созданных трансгенных растений позволит оценить влияние различных абиотических факторов на уровень экспрессии деги-дрина озимой пшеницы. Не исключено также влияние измененной транскрипционной активности гена TaDHN19.3 на реализацию программы стресс-сигналлинга и адаптации, а также на возможность повышения устойчивости растений к биотическим и абиотическим стрессам.
Список использованных источников
1. Boyer, J. S. Plant productivity and environment / J. S. Boyer // Science. - 1982. -Vol. 218. - Р. 443-448.
2. Bray, E. A. Responses to abiotic stresses / E. A. Bray, J. Bailey Serres, E. Weretilnyk // Biochemistry and molecular biology of plants. -2000. - P. 1158-1249.
3. Kratsch, H. A. The ultrastructure of chilling stress / H. A. Kratsch, R. R. Wise // Plant Cell Environ. - 2000. - Vol. 23. - P. 337-350.
4. Beck, E. StreßbeiPflanzen / E. Beck, U. Lüttge // Biol. UnsererZeit. - 1990. - Vol. 20. - P. 237-244.
5. Рогожин В. В. Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов / В. В. Рогожин // СПб.: ГИОрД, 2004. - 240 с.
6. Thomashow, M. F. Plant cold acclimation: freezing tolerance genes and regulatory mechanisms / M. F. Thomashow // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. - 1999. - Vol. 50. - P. 571-599.
7. Kosova, K. Role of dehydrins in plant stress response / K. Kosova, I. T. Prasil, P. Vitamvas //
Handbook of Plant and Crop Stress. - 2010. -P. 239-285.
8. Войников, В. К. Физиологический стресс и регуляция активности генома клеток эука-риотов / В. К. Войников, Г. Г. Иванова // Усп. совр. биол. - 1988. - Т. 105, № 1. - С. 3-16.
9. Косаювська, I. В. Новiуявлення про структуру та функцп стресових бшюв / I. В. Косаювська, Н. В. Гудкова // Укр. ботан. журн. - 2002. - Т. 59, № 1. - С. 72-74.
10. Vierling, E. The roles of heat shock proteins in plants / E. Vierling // Ann. Rev. Plant Physiol. and Plant Mol. Biol. - 1991. -V. 42. -P. 579-620.
11. Блехман, Г. И. Синтез белка в условиях-стресса / Г. И. Блехман // Успехи совр. биол. -1988. -Т. 103, № 3. - С. 340-353.
12. Kimpel, J. A. Heat shock in plants / J. A. Kimpel, J. L. Key // Trends in Biochem. Sci. - 1985. - Vol. 10, № 9. - P. 353-357.
13. Стрессовые белки растений / В. К. Вой-ников [и др.] // Иркутск: изд-во Ин-та географии СО РАН, 2004. - 129 с.
14. Close, T. J. Dehydrins: Emergence of a Biochemical Role of a Family of Plant Dehydration Proteins / T. J. Close // Physiol. Plant. - 1996. - Vol. 96. - P. 795-803.
15. Dehydrin Gene in Physcomitrella paterns Is Required for Salt and Osmotic Stress Tolerance / L. Saavedra [et al.] // Plant J. - 2006. - Vol. 45. -P. 237-249.
16. Дегидрины растений: их структура и предполагаемые функции / Ч. Р. Аллагуло-ва [и др.] // Биохимия. - 2003. - Т. 68, № 9. -С. 1157-1165.
17. Close, T. J. View of Plant Dehydrins Using Antibodies Specific to the Carboxy Terminal Peptide / T. J. Close, R. D. Fenton, F. A. Moonan // Plant Mol. Biol. - 1993. - Vol. 23. - P. 279-286.
18. Close, T. J. Response of Plants to Cellular Dehydration during Environmental Stress / T. J. Close, E. Bray // Rockville: American Society of Plant Physiologists. - 1993. -P. 91-103.
19. Accumulation of Dehydrin-Like Proteins in the Mitochondria of Cereals in Response to Cold, Freezing, Drought and ABA Treatment / G. B. Borovskii [et al.] // BMC Plant Biol. -2002. - Vol. 2. - P. 1-7
20. Mueller, J. K. Identification of a Chloroplast Dehydrin in Leaves of Mature Plants /
J. K. Mueller, S. A. Heckathorn, D. Fernando // Int. J. Plant Sci. - 2003. - Vol. 164. - P. 535-542.
21. Close, T. J. Dehydrins: A Commonalty in the Response of Plants to Dehydration and Low Temperature / T. J. Close // Physiol. Plant. -1997. - Vol. 100. - P. 291-296.
22. Choi, D. W. The Barley (Hordeumvulgare L.) Dehydrin Multigene Family: Sequence, Allele Types, Chromosome Assignment, and Expression Characteristics of 11 Dhn Genes of cv. Dicktoo / D. W. Choi, B. Zhu, T. J. Close // Theor. Appl. Genet. - 1999. - Vol. 98. -P. 1234-1247.
23. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0 / K. Tamura [et al.] // Molecular Biology and Evolution. -2013. - Vol. 30, № 12. - P. 2725-2729.
24. Thompson, J. D. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice / J. D. Thompson, D. G. Higgins, T. J. Gibson, // Nucleic Acids Research. - 1994. - Vol. 22, № 22. - P. 4673-4680.
25. Basic local alignment search tool / S. F. Altschul [et al.] // J Mol Biol. - 1990. - Vol. 215. - P. 403-410.
26. Генная инженерия растений / Дж. Дрей-пер [и др.] // М: Мир. - 1991. - 408 с.
27. Classification and expression diversification of wheat dehydrin genes / Y. Wang [et al.] // Plant Sci. - 2014. - Vol. 214. -P. 113-120.
28. Урбанович, О. Ю. Полиморфизм двух генов, кодирующих дегидрины пшеницы / О. Ю. Урбанович, П. В. Кузмицкая, В. Г. Боровский // Факторы экспериментальной эволюции организмов. - 2019. - № 25. -С. 172-177
29. Трансформация Nicotiana tabacum конструкцией, несущей ген ndb2 из Arabidopsis thaliana в антисмысловой ориентации / А. М. Шишлова-Соколовская [и др.] // Сб. науч. тр. «Молекулярная и прикладная генетика». - 2017. - Т. 22. - С. 76-83.
30. Маренкова, Т. В. Мозаичный характер экспрессии трансгенов у растений / Т. В. Ма-ренкова, Д. Б. Логинова, Е. В. Дейнеко // Генетика. - 2012. - Т. 48, № 3. - С. 293-306.
31. Matzke, M. A. Transgene silencing by the host genome defense: implications for the evolution of epigenetic control mechanisms in plants and vertebrates / M. A. Matzke, M. F. Mette, A. J. Matzke // Plant Mol. Biol. -2000. - Vol. 43, № 2/3. - P. 401-415.
32. Дейнеко, Е. В. Изучение экспрессии ге-терологичных и собственных генов у трансгенных растений: на примере Nicotiana tabacum L. : дис. ... д-ра биол. наук : 03.00.15 / Е. В. Дейнеко. - Новосибирск, 2004. - 198 с.
33. Improvement of stress tolerance of wheat and barley by modulation of expression of DREB/CBF factors / S. Morran [et al.] // Plant Biotechnology. - 2011. - Vol. 9. - P. 230-249.
34. Overexpression of the transcription factor HvSNAC1 improves drought tolerance in barley (Hordeum vulgare L.) / A. M. Al Abdallat [et al.] // Mol Breeding. - 2014. - Vol. 33, № 2. -P. 401-414.
35. DREB/CBF expression in wheat and barley using the stress-inducible promoters of HD-Zip I genes: impact on plant development, stress tolerance and yield / Y. Yang // Plant Biotechnology. - 2020. - Vol. 18. - P. 829-844.
36. Overexpression of MdIAA9 confers high tolerance to osmotic stress in transgenic tobacco / D. Huang [et al.] // Peer J. - 2019. doi: 10.7717/ peerj.7935.
A. M. Shishlova-Sokolovskaya1, E. P. Kvetko1, P. V. Kuzmitskaya1, O. Yu. Urbanovich1, G. B. Borovsky2
DEVELOPMENT OF TRANSGENIC NICOTIANA TABACUM PLANTS WITH THE INSERTION OF THE TADHN19.3 GENE ENCODING
WINTER WHEAT DEHYDRIN
:State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27, Akademicheskaya St., 220072 Minsk, the Republic of Belarus e-mail: s_anastasia78@mail.ru 2Federal State Budgetary Institution of Science "Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry of the Siberian Branch of the Russian Academy of
Sciences"
132, Lermontov St., 664033 Irkutsk, the Russian Federation e-mail: borovskii@sifibr.irk.ru
In order to study how the TaDHN19.3 gene encoding winter wheat dehydrin affects the development of low temperature tolerance, we have created the genetic vector construction pBI121_TaDHN19/EGFP based on the binary vector pBI121. In this construction, the TaDHN19.3 gene isolated from winter wheat (Triticum aestivum), variety Kapylyanka of the Belarusian selection, is located in the fused reading frame with the enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene. Using the method of Agrobacterium-mediated transformation of leaf discs, the transgenic Nicotiana tabacum plants expressing a chimeric gene were obtained using the pBI121_TaDHN19/EGFP genetic vector construction.
Keywords: Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1, the ndb2 gene, Triticum aestivum, Eserishia coli dh5a, Agrobacterium tumifaciens, the TaDHN19.3 gene of winter wheat dehydrin, the EGFP gene, cold resistance.
Дата поступления статьи: 14 апреля 2020 г.
