CC BY
7УДК 602.6:633/635:631.524.85
А.М. Шишлова-Соколовская1, О.Ю. Урбанович1, И.В. Федосеева2, Г.Б. Боровский2
ТРАНСФОРМАЦИЯ NICOTIANA TABACUM КОНСТРУКЦИЕЙ, НЕСУЩЕЙ ГЕН NDB2 ИЗ ARABIDOPSIS THALIANA В АНТИСМЫСЛОВОЙ ОРИЕНТАЦИИ
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: s_anastasia78@mail.ru 2Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН Россия, 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132 e-mail: borovskii@sifibr.irk.ru
Методом агробактериальной трансформации листовых дисков линии табака Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1 были получены трансгенные растения поколения Т0 с жизнеспособным семенным потомством. В качестве целевого гена был использован ген «внешней» нефосфорилирующей NADH-дегидрогеназы (ndb2) из Arabidopsis thaliana. Перенос данного гена осуществлялся посредством рекомбинантного штамма Agrobacterium tumefaciens EHA105. В область Т-ДНК штамма Agrobacterium tumefaciens EHA105 методом трехродительского скрещивания была перенесена плазмида pBI121_antiNDB2, несущая ген ndb2 в антисмысловой ориентации, под контролем конститутивного 35S РНК CaMV промотора и нопалин-синтазого терминатора NOS, а также селективный ген nptII под контролем nos-промотора. Методом ОТ-ПЦР была показана транскрипционная активность гена ndb2 в трансгенных растениях поколения Т0.
Ключевые слова: Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1, ген ndb2, полимеразная цепная реакция (ПЦР), обратно-транскрипционная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), АФК (активная форма кислорода).
Введение
Различные абиотические стрессы, такие как холод, засуха, засоление, затопление, воздействие критических температур, токсические концентрации тяжелых металлов, высокая кислотность или щелочность почв, повышенное содержание озона, дефицит элементов минерального питания и т.д., снижают продуктивность сельскохозяйственных растений в два раза и более, а при высокой интенсивности и достаточно долгой продолжительности стресса приводят их к гибели [1, 2].
Для растений в стрессовом состоянии характерна дезинтеграция полирибосом, что приводит к нарушению синтеза полипептидов. Происходит образование «стрессовых гранул», функцией которых предположительно является приостановка синтеза неспецифических белков и защита матричной РНК от повреждения стрессовыми факторами [3].
Сложность селекционной работы по повышению устойчивости к абиотическим стрессам состоит в наличии большого комплекса
генов, контролирующих реакцию растений на абиотические стрессы, многие из этих генов к тому же характеризуются сложной регуляцией [4-7].
Важной особенностью ответной реакции растения на стрессовый фактор является изменение напряженности энергетического обмена. Митохондрии являются одной из главных мишеней окислительного повреждения при стрессе. При энергозапасающем окислении NADH митохондриями функционирует комплекс I дыхательной цепи. В состоянии стресса цитохромный путь дыхания (комплекс I) снижается и возрастает альтернативный путь (комплекс II). В результате такого переключения в клетках растений начинают функционировать альтернативные (второго типа, или КОП) внешние и внутренние NAD(P) Н-дегидрогеназы, которые поставляют восстановительные эквиваленты в дыхательную цепь, минуя комплекс I. При этом происходит увеличение транскриптов и, как следствие, количества зрелого белка альтернативной ок-
сидазы (АО), что в свою очередь приводит к коэкспрессии ретенон-нечувствительных НАД(Ф)Н-дегидрогеназ (НаД(Ф)Н-ДГ II типа) [8-10]. У растений арабидопсиса обнаружены три группы NAD(P)H-дегидрогеназ: ^0А, и [11]. Белки КОВ1-КОВ4 являются внешними и обращены на внешнюю сторону внутренней митохондриальной мембраны, белки КОА1, КОА2, КОС1 обращены на внутреннюю сторону митохондриальной мембраны [12].
Точные физиологические функции белков семейства N011 не выяснены. Считается, что последние вместе с альтернативной оксидазой (АОХ) участвуют в формировании нефосфори-лирующей дыхательной цепи при окислительном стрессе. Предполагается, что роль внешних и внутренних КА0(Р)Н-дегидрогеназ заключается в подавлении генерации АФК [8].
Показано, что в прорастающих семенах гороха сохраняется способность митохондрий к окислению экзогенного КАОН при действии отрицательной температуры, и именно окисление внешнего КАОН главным образом обеспечивает энергетический метаболизм при низких температурах у растений. После действия закаливающей отрицательной температуры на проростки озимой пшеницы была выявлена повышенная способность АОХ к транспорту электронов, что связано с высокой активностью внешней N011. Внешняя КАО(Р) Н-дегидрогеназа в данном случае играет важную роль в поддержании функционального состояния митохондрий в гетеротрофных тканях растений при действии отрицательных температур [13].
Одним из способов изучения физиологических функций белков семейства N011 могут быть методы генетической инженерии. Используя данные методы можно блокировать синтез как всех белков семейства N011, так и каждого в отдельности. Однако при выключении всего комплекса белков семейства N011 невозможно получить жизнеспособное семенное потомство. В работах WaПstшm показано, что удалось получить растения с подавленным синтезом отдельных белков данного семейства [14]. В растениях арабидопсиса с помощью RNAi был уменьшен синтез N0B4, вследствие чего значительно увеличился синтез ^Ы0В2 и А0Х1а, что привело к уменьшению
образования АФК клетками, солеустойчиво-сти, изменениям в скорости развития и фенотипе растений. Кроме того, показано участие «внешней» NADH-дегидрогеназы в развитии морозоустойчивости у проростков озимой пшеницы [14, 15].
Большой интерес представляет белок NDB2. Физиологические функции данного белка окончательно не выяснены. Предполагается, что данный белок участвует в процессах устойчивости растений к окислительному, низкотемпературному и другим абиотическим стрессам. В экспериментах по изменению уровня синтеза белка NDB4 с помощью RNAi было показано значительное увеличение синтеза белков NDB2 и AOXla.
Целью данного исследования является получение генетически модифицированных растений Nicotiana tabacum, экспрессирующих ген «внешней» нефосфорилирующей NADH-дегидрогеназы (ndb2) из Arabidopsis thaliana в антисмысловой ориентации. Предполагается, что ген «внешней» нефосфорилирующей NADH-дегидрогеназы (ndb2) посредством изменения количества АФК влияет на функционирование митохондрий, экспрессию генов, вовлеченных в стрессовый ответ, реализацию программы стресс-сигналлинга и адаптации растений к стрессовым факторам.
Материалы и методы
Растительный материал
В качестве объекта для изучения функции гена ndb2 использовалась линия табака Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1. На основе данной линии были созданы трансгенные растения, несущие в геноме ген ndb2 в обратной ориентации.
Создание векторных конструкций
Источником для клонирования нативного гена ndb2 служили растения Arabidopsis thaliana (экотип Columbia).
Выделение мРНК и синтез кДНК выполняли с помощью наборов GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit и RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, EU).
При создании векторной конструкции использовали методики ПЦР, рестрикции и ли-гирования фрагментов ДНК, выполненные
по стандартным протоколам коммерческих наборов реагентов (Thermo Fisher Scientific, Qiagen) [16, 17]. Соответствие клонированной последовательности гена целевой последовательности гена ndb2 подтверждено с помощью рестрикционного анализа.
Векторная конструкция для трансформации растений, получившая название pBI121_antiN-DB2, создана на основе вектора pBI121 Савчи-ным Д.В. [18, 19]. Предварительно в данный вектор были введены дополнительные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции BamHI и KpnI для клонирования целевого гена в обратной ориентации между конститутивным промотором 35S РНК CaMV и терминатором нопалин-синтазы nos.
Рекомбинантные штаммы с целевой векторной конструкцией pBI121_antiNDB2 получены на основе агробактериального штамма A. tumefaciens EHA105 методом трехроди-тельского скрещивания. Отбор агробакте-риальных клонов с целевой векторной конструкцией проводили на питательной среде с добавлением селективных агентов кана-мицина (100 мг/л) и рифампицина (50 мг/л). Наличие векторной конструкции в агробак-териальных штаммах подтверждали методом ПЦР со специфичными праймерами, комплементарными гену ndb2 в обратной ориентации. Полученные штаммы использованы в экспериментах по агробактериальной трансформации растений.
Агробактериальная трансформация
В качестве объекта для стабильной интеграции и изучения эффективной работы конструкции pBI121_antiNDB2 использовалась линия табака Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1. Введение гена ndb2 осуществлялось посредством агробактериальной трансформации листовых дисков 3-4-недельных растений табака, выращенных в асептических условиях (температура 24 °С, освещенность 4000-5000 люкс при 16/8 (свет/темнота) фотопериоде). В качестве переносчика Т-ДНК использовался агробактериальный штамм Agrobacterium tumefaciens EHA105. Для инициации процессов морфогенеза и отбора первичных трансформантов использовали питательные среды CIM, SIM и T-med с селективным агентом канамицином в концентрации 50 мг/л.
Молекулярно-генетический анализ
Выделение растительной ДНК выполняли с помощью набора Genomic DNA Purification Kit (Thermo Fisher Scientific, EU) по методике изготовителя. Интеграцию чужеродных генов в растительный геном определяли с помощью ПЦР. Объем смеси для амплификации одного образца составлял 25 мкл, в смесь входили следующие реагенты: 100-200нг ДНК, 2,5мкл 10Х буфера с (NH4)2SO4 фирмы (Thermo Fisher Scientific, EU), 2,5мкл 10мМ смеси нуклео-тидов (dNTP) (Thermo Fisher Scientific, EU), 2мкл 25мМ MgCL2 (Thermo Fisher Scientific, EU), 2,5мкл каждого из праймеров, 0,2мкл 5ед. Taq ДНК-полимеразы (Thermo Fisher Scientific, EU), 10,7мкл H2O. Для идентификации присутствия целевого гена ndb2 в антисмысловой ориентации использовали специфические праймеры: antiNDB2-F - GAGCTC GGATCCTCAGATGCTACTGGAATCTCTAC и antiNDB2-R - GAGCTCGGTACCATGAGA AATTTCAGTGTCTTCG. Подбор праймеров осуществлялся с помощью программы NSBI Primer-BLAST.
Амплификацию проводили в амплификато-ре Bio-Rad с использованием следующей программы: 94 °С - 5 мин; 94 °С - 30 с, 51 °С -30 с, 72 °С - 3 мин, 30 циклов; 72 °С - 7 мин; 4 °С - да мин. Продукт реакции разделяли в 1%-ном агарозном геле с бромистым этиди-ем в электрическом поле с помощью камеры для горизонтального электрофореза фирмы Bio-Rad. Фрагмент после электрофореза визуализировали с помощью системы Bio-Rad Gel Doc 2000.
Для доказательства транскрипции гена ndb2 в трансформантах табака был использован метод обратно-транскрипционной ПЦР (ОТ-ПЦР). Для этого выделяли тотальную РНК с помощью набора реагентов GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit (Thermo Fisher Scientific, EU) по методике изготовителя. Синтезирование кДНК на матрице РНК осуществлялось с помощью набора реагентов First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, EU) по методике изготовителя. Дальнейший ПЦР-анализ на основе синтезированной к-ДНК, комплементарной мРНК, проводили в амплификаторе BioRad с использованием программы, описанной выше. Продукт реакции разделяли в 1%-ном агарозном геле с бромистым этидием в элек-
трическом поле с помощью камеры для горизонтального электрофореза фирмы Bio-Rad. Фрагмент после электрофореза визуализировали с помощью системы GelDoc2000 Bio-Rad.
Результаты и обсуждение
Нуклеотидная последовательность гена ndb2 из Arabidopsis thaliana (NM_116741.3, база данных NCBI) и базовый вектор pBI121 были использованы для создания плазмиды pBI121_NDB2, содержащей ген ndb2 в прямой ориентации [19]. Базовый вектор pBI121 является удобной моделью для создания генетических конструкций, так как содержит LB- и RB-концевые повторы области Т-ДНК, по которым происходит интеграция области Т-ДНК в геном растения. На основе плазмиды pBI121_NDB2 была создана генетическая векторная конструкция pBI121_antiNDB2, несущая ген ndb2 в антисмысловой ориентации. Из плазмиды pBI121_NDB2 ген ndb2 был вырезан по сайтам рестрикции BamHI и KpnI. Далее, используя методы молекулярно-генетического клонирования, нуклеотидная последовательность гена ndb2 была интертирована и встроена по сайтам рестрикции описанных выше эндонуклеаз (рис. 1).
Генетическая конструкция pBI121_antiNDB2 содержит гетерологичный ген ndb2 в антисмысловой ориентации под контролем конститутивного 35S РНК CaMV промотора и нопалин-синтазого терминатора NOS, селективный ген nptII под контролем nos-промотора. Ген nptII позволяет проводить отбор устойчивых к кана-мицину первичный трансформантов.
Создание трансгенных растений табака с геном ndb2 в антисмысловой ориентации
Для создания трансгенных растений табака Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SRI, несущих в своем геноме ген ndb2 в обратной ориентации, была использована векторная конструкция pBI121_antiNDB2. На первом этапе на основе агробактериального штамма A. tumefaciens EHA105 были получены реком-бинантные клоны с целевой векторной конструкцией методом трехродительского скрещивания. Отбор агробактериальных клонов, несущих ген ndb2 в обратной ориентации в составе векторной конструкции, проводили на питательной среде LB с добавлением селективных агентов канамицина (100 мг/л) и рифампицина (50 мг/л). Наличие целевой вставки подтверждали методом ПЦР со спе-
NDBII-REVERSE
области Т-ДНК; NOS-pro - промотор нопалин-синтазы; прШ - ген неомицинфосфотрансферазы II типа; NOS-1ег - терминатор нопалин-синтазы; 35S CaMV - 35S РНК CaMV промотор; NDBП-REVERSE - ген «внешней» нефосфорилирующей НАДФ-Н дегидрогеназы в антисмысловой ориентации; ВатН1, КрЛ - сайты узнавания
эндонуклеазами рестрикции
цифичными праймерами (рис. 2). Полученные рекомбинантные штаммы использовали в дальнейшем в экспериментах для агробак-териальной трансформации растений табака.
В результате эксперимента по агробактери-альной трансформации растений табака векторной конструкцией рВП21_апйКОВ2 получено 68 регенерантов, из которых 40 укоренились на среде для ризогенеза с селективным агентом канамицином в концентрации 50 мг/л (рис. 3).
Экспрессия селективного гена прШ не всегда свидетельствует о вставке и транскрипционной активности целевого гена [20]. В нашем случае инициация процессов морфогенеза и ризогенеза у трансформантов на селективной среде, содержащей канамицин, не является достоверным фактом инсерции и транскрипции гена пй.Ъ2 в обратной ориентации. В связи с этим, для подтверждения интеграции и экспрессии целевого гена пйЪ2 был проведен молекулярно-генетический анализ.
Молекулярно-генетический анализ трансгенных растений с геном пйЪ2
Для молекулярно-генетического анализа использовали ДНК первичных трансформантов. Наличие гетерологичной инсерции определяли методом ПЦР с праймерами antiNDB2F и antiNDB2R (рис. 4).
С помощью ПЦР-анализа было отобрано 34 растения табака, в геноме которых подтверждено присутствие целевой вставки.
Полученные результаты демонстрируют эффективность созданной векторной конструкции рВП21_апйКОВ2. Агробактериальная трансформация листовых дисков данной конструкцией приводит к переносу целевой последовательности, несущей ген пйЪ2 в обратной ориентации под контролем промотора 35S РНК СаМУ, в геном растений табака.
Следует отметить, что наличие инсерции чужеродного гена в реципиентный геном не является фактом его транскрипционной активности. На эффективность экспрессии чужеродного гена огромное влияние оказывает место его интеграции в геном растения. Интеграция Т-ДНК в растительный геном происходит по типу негомологичной рекомбинации и не всегда обеспечивает стабильное фенотипическое проявление признака. Такая генетическая нестабильность может быть связана как с делецией
или мутацией введенной ДНК [21, 22], так и с инактивацией трансгена [23]. Механизмы за-молкания трансгена могут быть различными, но основным из них является инактивация экспрессии трансгенов на транскрипционном на посттранскрипционном уровнях [24].
С целью подтверждения экспрессии гете-рологичного гена в растительном геноме проведен ОТ-ПЦР-анализ. В ходе амплификации кДНК с праймерами, соответствующими целевому гену пйЪ2 в антисмысловой ориентации, был выявлен фрагмент, соответствующий позитивному контролю (плазмида рВН21_ап-йКОВ) и теоретически ожидаемому размеру ампликона 1884 п.н. В негативном контроле (кДНК нетрансгенных растений) фрагмент отсутствовал (рис. 5).
m 1234 56789
Рис. 2. Электрофореграмма ПЦР-продукта (1884 п.н.), выявленного при амплификации ДНК агробактериаль-ных рекомбинантных штаммов с векторной конструкцией pBI121_antiNDB2: m - маркер молекулярного веса GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus (Thermo Fisher Scientific, EU); 1-8 - плаз-мидная ДНК рекомбинантных штаммов; 9 - смесь ПЦР-реагентов
Рис. 3. Первичный трансформант табака на селективной среде
пп 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Рис. 4. Электрофореграмма ПЦР-продукта (1884 п.н.), выявленного при амплификации ДНК регенератов табака
со вставкой гена ndb2 в обратной ориентации: m - маркер молекулярного веса GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus (Thermo Fisher Scientific, EU); 1- плазмида pBI121_antiNDB2; 2-11 - анализируемые трансгенные линии; 12 - исходные растения табака; 13 - смесь ПЦР-
реагентов
6 7 8 W 10 11 12 13 14 15 fS 17 18
m pi 19 20
Рис. 5. Электрофореграмма ПЦР-продукта (1884 п.н.), выявленного при амплификации кДНК регенерантов табака, экспрессирующих ген ndb2 в обратной ориентации: m - маркер молекулярного веса GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus (Thermo Fisher Scientific); pl - плазмида pBI121_antiNDB; 1-16 - анализируемые трансгенные линии; 17, 18 - исходные растения табака; 19 - смесь реагентов синтеза кДНК; 20 - смесь ПЦР-реагентов
Присутствие целевого фрагмента подтверждает факт транскрипции чужеродного гена в растительном геноме. Растения поколения Т экспрессирующие ген пй.Ъ2 в антисмысловой ориентации, дали жизнеспособное семенное
потомство. Полученные трансгенные растения будут являться объектом для изучения влияния данного гена на механизмы развития устойчивости растений к абиотическим и биотическим стрессам.
Заключение
Методом агробактериальной трансформации получены трансгенные растения табака, несущие в геноме гетерологичный ген ndb2 из Arabidopsis thaliana (экотип Columbia) в антисмысловой ориентации. С помощью методов ПЦР и ОТ-ПЦР показано, что посредством векторной конструкции pBI121_antiNDB2 осуществляется перенос, инсерция гетерологич-ной вставки и экспрессия целевого гена ndb2 в обратной ориентации в растительном геноме.
Полученные трансгенные растения и их биохимический и молекулярно-генетический анализ позволят пролить свет на реализацию программы стресс-сигналлинга и адаптационные механизмы устойчивости растительного генома к биотическим и абиотическим стрессовым факторам.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов БРФФИ Б16Р-050 и РФФИ №16-54-00070.
Список использованных источников
1. Boyer, J.S. Plant productivity and environment / J.S. Boyer // Science. - 1982. - Vol. 218. -Р. 443-448.
2. Bray, E.A. Responses to abiotic stresses / E.A. Bray, J. Bailey-Serres, E. Weretilnyk; eds. W. Gruissem, B. Buchannan, R. Jones // Biochemistry and molecular biology of plants. -Amer. Soc. Rockville, 2000. - P. 1158-1249.
3. Al Khatib, K. High temperature effects on photosynthetic processes in temperate and tropical cereals / K. Al Khatib, G.M. Paulsen // Crop Sci. Soc. Amer. - 1999. - Vol. 39. - P. 119-125.
4. Kratsch, H.A. The ultrastructure of chilling stress / H.A. Kratsch, R.R. Wise // Plant Cell Environ. - 2000. - Vol. 23. - P. 337-350.
5. Plant cellular and molecular responses to high salinity / P.M. Hasegawa [et al.] // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. - 2000. -Vol. 51. - P. 463-499.
6. Differential expression of two _1_pyrro-line_5_carboxylate synthetase genes controlling proline accumulation during salt stress requires ABA and is regulated by ABA1, ABI1 and AXR2 in Arabidopsis / N. Strizhov [et al.] // Plant J. -1997. - Vol. 12. - Р. 557-569.
7. Thomashow, M.F. Role of cold-responsive genes in plant freezing tolerance / M.F. Thom-
ashow // Plant Physiol. -1998. - Vol. 118. -P. 1-7.
8. Moller, I. M. Plant mitochondria and oxidative stress: electron transport, NADPH turnover, and metabolism of reactive oxygen species / I. Moller // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. - 2001. - Vol. 52. - P. 561-591.
9. Finnegan, P.E. Alternative mitochondri-al electron transport proteins in higher plants / P.E. Finnegan, K.L. Soole, A.L. Umbach // In Plant Mitochondria: From Genome to Function. - Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. - P. 163-230.
10. Svensson, A.S. Light-dependent gene expression for proteins in the respiratory chain of potato leaves / A.S. Svensson, A.G. Rasmusson // Plant J. - 2001. - Vol. 28. - P. 73-82.
11. Light regulation of the Arabidopsis respiratory chain. Multiple discrete photorecep-tor responses contribute to induction of type II NAD(P)H dehydrogenase genes / M.A. Escobar [et al.] // Plant Physiol. - 2004. - Vol. 136 (1). -P. 2710-2721.
12. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants / A.H. Millar [et al.] // Annu. Rev. Plant Biol. - 2011. - Vol. 62. - P. 79104.
13. Митохондриальные энергорассеиваю-щие системы (альтернативная оксидаза, разобщающие белки и «внешняя» NADH-дегидрогеназа) вовлечены в развитие морозоустойчивости проростков озимой пшеницы / О.И. Грабельных [и др.] // Биохимия. - 2014. - Т. 79, № 6. - С. 645-660.
14. Suppression of NDA-type alternative mitochondrial NAD(P)H dehydrogenases in Arabidopsis thaliana modifies growth and metabolism, but not high light stimulation of mi-tochondrial electron transport / S. Wallström [et al.] // Plant & Cell Physiol. - 2014. - Vol. 55. N 5. - P. 881-896.
15. Alterations in the mitochondrial alternative NAD(P)H dehydrogenase NDB4 lead to changes in mitochondrial electron transport chain composition, plant growth and response to oxidative stress / C. Smith [et al.] // Plant Cell Phys. - 2011. - Vol. 52. - P. 1222-1237.
16. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, D.W. Russell. - New York: Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001. -2344 p.
17. Ausubel, F.M. Current protocols in molecular biology / F.M. Ausubel. - New York: Greene Pub. Assoc. and Wiley-Interscience, 2004. - 561 p.
18. Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application in cloning T-DNA insertion from transgenic plants / P.-Y. Chen [et al.] // Mol. Breeding. - 2003. - Vol. 11, N 4. -P. 287-293.
19. Создание трансгенных растений Nicotiana tabacum с геном ndb2 Arabidopsis thaliana для изучения влияния на стресс / Д.В. Савчин [и др.] // Известия: сер. биол. наук. - 2017. -№ 1. - С. 54-61.
20. Маренкова, Т.В. Мозаичный характер экспрессии трансгенов у растений / Т.В. Маренкова, Д.Б. Логинова, Е.В. Дейнеко // Генетика. - 2012. - Т. 48, № 3. - С. 293-306.
21. Kim, Y.S. Frequent occurrence of trans-
gene deletion in transgenic plants / Y.S. Kim, J. Lee, S-H. Jun // Mol.Cells. -1998. - Vol. 8. -P. 705-708.
22. Frequent spontaneous deletions of Ri T-DNA in Agrobacterium rhizogenes transformed potato roots and regenerated plants / C.H. Hanisch ten Cate [et al.] // Plant Mol. Biol. - 1990. - Vol. 14. - P. 735-741.
23. Курочкина, С.Д. Генетическая трансформация растений, процессы рекомбинации и регуляции экспрессии генов у трансгенных растений / С.Д. Курочкина, Н.А. Картель // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1998. - № 4. - С. 3-12.
24. Маренкова, Т.В. Трансгенные растения как модели для изучения эпигенетической регуляции экспрессии генов / Т.В. Маренкова, Е.В. Дейнеко // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2015. - Т. 19., № 5 - С. 545-551.
A.M. Shishlova-Sokolovskaya1, O.Yu. Urbanovich1, I.V. Fedoseyeva2, G.B. Borovsky2
TRANSFORMATION OF NICOTIANA TABACUM BY THE CONSTRUCTION THAT CARRIES NDB2 GENE OF ARABIDOPSIS THALIANA IN THE ANTISESNSE ORIENTATION
institute of Genetics and Cytology, NAS of Belarus Minsk BY-220072, the Republic of Belarus 2Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry Irkutsk, 664033, Russia
Transgenic plants, belonging to Т0 generation with viable seed progeny, were developed by the agrobacterial transformation technique of leaf discs of Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1 tobacco line. A gene of "external" non-phosphorylating NADH-dehydrogenase (ndb2) from Arabidopsis thaliana was used as a target gene. The gene transfer was performed by the recombinant Agrobacterium tumefaciens EHA105 strain. pBI121_antiNDB2 plasmid, carrying ndb2 gene in the antisense orientation controlled by constitutive 35S РНК CaMV promoter and nopalin synthase (NOS) terminator as well as selective nptll gene controlled by NOS-promoter, was transferred in the T-DNA region of Agrobacterium tumefaciens EHA105 strain by the triparental crossing technique. Transcriptional ndb2 gene activity in the transgenic plants of Т0 generation was shown by the RT-PCR method.
Key words: Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1, ndb2 gene, polymerase chain reaction (PCR), polymerase chain reaction with reverse transcription (RT-PCR), reactive oxygen intermediate (RIO).
Дата поступления статьи 13 января 2017 г.
