CC BY
16DOI https://doi.org/10.47612/1999-9127-2022-33-47-57 УДК 577.29
А. М. Шишлова-Соколовская, Е. П. Хмилевская, О. Ю. Урбанович
РАЗРАБОТКА CRISPR/CAS9 СИСТЕМЫ ДЛЯ ГЕНОМНОГО РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНА NTPDS ТАБАКА (NICOTIANA TABACUM)
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: s_anastasia78@mail.ru
CRISPR/Cas9 система является одним из мощнейших инструментов для редактирования геномов растений. В представленном исследовании векторные конструкции, разработанные на основе CRISPR/Cas9 системы, были использованы для редактирования генома Nicotiana tabacum. В качестве мишени выбран ген NtPDS, кодирующий фермент 15-цис-фитоендесатуразу. Нокаут данного гена в растениях приводит к фенотипу альбиносов и карликовости. С помощью биоинформатических платформ in silico было смоделировано 3 векторные конструкции на основе бинарного вектора pRGEB31:pRGEB31 + gRNA5-pds, pRGEB31 + gRNAJp2-pds, pRGEB31 + gRNADeT186-pds, несущие в своем составе систему CRISRP/Cas9 со спейсерами к различным участкам структурных доменов гена NtPDS. Векторные конструкции были собраны, используя методы молекулярного клонирования. Правильность и корректность их сборки подтверждена методом секвенирования по Сэнгеру. Посредством Agrobacterium -опосредованной трансформации листовых дисков данные генетические конструкции были введены в геном модельного объекта N. tabacum cv. Petit Havana SR1. В процессе культивирования листовых дисков табака удалось инициировать процессы каллусогенеза и морфогенеза при использовании каждого из вариантов конструкций, однако максимальная их частота наблюдалась при использовании конструкции pRGEB31 + gRNA5-pds.
Ключевые слова: CRISPR/Cas9 система, гидовая РНК, PAM, pRGEB31, NtPDS, Nicotiana tabacum.
Введение
Геномное редактирование является одним из методов генетической инженерии, с помощью которого возможно включение, удаление или перемещение фрагментов ДНК в геноме организма посредством специфически спроектированных эндонуклеаз [1-3]. В настоящее время система CRISPR/Cas9 (clustered regulatory inter spaced short palindromic repeats — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) является одним из мощнейших, наиболее эффективных, простых и универсальных в использовании инструментов для редактирования геномов растений [4, 5]. CRISPR/Cas9 система состоит из 2 компонентов: гидовой (направляющей) РНК (гидРНК) и эндонуклеазы Cas9. Последовательность гидРНК состоит из константной тракрРНК (70 п. о.) и вариабельной крРНК (17-25 п. о.) части. Константная часть необходима для связывания с нуклеазой Cas9, вариабельная — для специфичного связыва-
ния комплекса гидРНК/Сas9 с последовательностью мишени, подлежащей модификации [6, 7]. Сигналом для специфического связывания белка Cas9 с мишенью служит последовательность РАМ, состоящая из 3 нуклеотидов (5'-NGG-3') и примыкающая к 3'-концевому участку мишени [8]. Нуклеаза Cas9 распознает РАМ и вносит разрывы на ~3-4 нуклеотида ниже данной последовательности. Наличие последовательности РАМ является единственным ограничением при выборе мишени для редактирования генома с помощью СЯЛБРК/ Cas9 системы. Транскрипционная активность комплекса гидРНК/Сas9 в клетке приводит к множеству разнообразных мутаций, таких как делеции, вставки, мутации со сдвигом рамки считывания, что, в свою очередь, вызывает нарушения в нуклеотидной последовательности и, как следствие, потерю функции гена-мишени [9].
Мишенью для редактирования может быть любая последовательность ДНК длиной
17-23 нуклеотидов при условии, что является уникальной для выбранного генома и на 3'-конце имеет последовательность PAM. Для дизайна гидРНК на сегодняшний день создан ряд биоинформатических онлайн ресурсов, позволяющих подобрать не только высокоспецифичные спейсеры, но и выявить вероятные off-target сайты [10-12]. У растений при использовании CRISPR/Cas9 системы, в отличие от других объектов, ошибочные мутации возникают редко или не выявляются совсем, а тщательный подбор гидРНК позволяет существенно снизить риск off-target эффектов [13-15].
Важную роль в редактировании растительного генома играет метод доставки компонентов системы CRISPR/Cas9 [16]. Сегодня широко применяются два основных метода доставки — это биобаллистика и Agrobacterium-опосредованная трансформация. Метод биобаллистики был применен для редактирования генома пшеницы, риса, кукурузы, сои, томата [17-19]. С помощью Agrobacterium-опосредованной трансформации, как способа для доставки компонентов CRISPR/Cas9 системы, были получены нокаут-мутанты как двудольных, так и однодольных [20, 21].
Целью данной работы была разработка векторных конструкций на основе CRISPR/ Cas9 системы для редактирования растительного генома на примере модельного объекта N. tabacum. В качестве мишени выбран ген NtPDS, кодирующий фермент 15-цис-фито-ендесатуразу.
Материалы и методы
В качестве объекта в наших исследованиях
использовалась линия табака Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SRI, предметом исследования являлся ген NtPDS (Gene ID:107816873, updated on 13-Dec-2019) N. tabacum.
Создание векторных конструкций
Векторные конструкции для трансформации растений были созданы на основе бинарного вектора pRGEB31 [22]. При создании векторных конструкций были использованы общепринятые методики выделения и очистки плазмидной ДНК, ферментативного гидролиза, дефосфорилирования рестрицированных фрагментов и лигирования, выполненные с применением коммерческих наборов реагентов Thermo Fisher Scientific по методикам изготовителя. Ферментативное расщепление плазмидной ДНК проводили по двойному сайту эндонуклеазы рестрикции Bsal (Thermo Fisher Scientific). Рестрицированную смесь разделяли посредством электрофореза в 1% агарозном геле с последующим выделением из геля и очисткой фрагмента нужного размера с помощью набора реагентов Gene JET Extraction and DNA Clean up Micro Kit (Thermo Fisher Scientific).
Для дизайна векторных конструкций in silico в нашей работе были использованы следующие программы: Snape Gene Viewer 6.0, Unipro UGENE 41.0, ApE (A plasmid Editor).
Корректность и правильность сборки векторных конструкций подтверждалась методам ПЦР и секвенированием по Сэнгеру с использованием синтетических олигонукле-отидов (синтезированы компанией Праймтех) (табл. 1).
Секвенирование по Сэнгеру было выполнено на генетическом анализаторе Genetic Analyzer 3500 (Applied Biosystems) с помощью
Олигонуклеотиды Последовательность синтетических олигонуклеотидов, 5' ^ 3' Температура отжига, °C
gRNA5-F GGCAGCTGCATGGAAAGATGATGA 55 °C
gRNA5-R AAACTCATCATCTTTCCATGCAGC 54 °C
gRNADeT186-F GGCAAAGGACTTTAATCCTTTAA 56 °C
gRNADeT186-R AAACTTAAAGGATTAAAGTCCTT 54 °C
gRNAJp2-F GGCAGAGAACTAGGGATAAACGAT 56 °C
Таблица 1
Последовательность и температура отжига синтетических олигонуклеотидов, использованных при создании и анализе векторных конструкций
Окончание таблицы 1
Олигонуклеотиды Последовательность синтетических олигонуклеотидов, 5' ^ 3' Температура отжига, °C
gRNAJp2-R AAACATCGTTTATCCCTAGTTCTC 52 °C
U3Cas9-F AAGGAATCTTTAAACATACG 48 °C
U3Cas9-R CTTTTTCTTTTTTGCCTGGC 53 °C
gRNA-F AAGAGTTGTGCAGATGATCC 56 °C
gRNA-R ATCTGGGGACCTGCAGGCAT 56 °C
набора реагентов Brilliant Dye™ Terminator Cycle Sequencing Kit v.2.1 (Nima Gen, EU) по протоколу изготовителя. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей выполняли с помощью программы Snape Gene Viewer 6.0 и базы данных NCBI.
Дизайн и синтез спейсерных последовательностей
Дизайн спейсерных последовательностей к различным протоспейсерам гена-мишени NtPDS был выполнен с использованием следующих онлайн программ: CRISPR direct, CRlSPOR, CCTop. Для клонирования спейсеров в бинарный вектор pRGEB31 к 5'-концевым участкам праймеров были добавлены липкие концы: для прямого праймера — 5'- GGC- 3' (если начинается с А) или 5'- GGCA -3' (если начинается с G/C/T), для обратного праймера — 5'-AAAC-3'. Формирование спейсерных последовательностей проводили по следующему протоколу: смесь из 1 мкл каждого из праймеров в концентрации 100 мкМ, 1 мкл 10 X Buffer for T4 DNA ligase (Thermo Fisher Scientific) и 7 мкл воды miliQ, инкубировали 60 мин при 37 °C, затем 10 мин при 95 °C с последующим охлаждением до 25 °C 1 °C/1 мин. Синтезированные таким способом дуплексы далее были клонированы в вектор pRGEB31 по двойному сайту эндонуклеазы рестрикции BsaI Полученные плазмиды посредством метода теплового шока вводили в компетентные клетки E. Coli (XL1-Blue, DH5a). Конъюгацию плазмид из E. Coli (XL1-Blue, DH5a) в Agrobacterium tumifaciens (EHA105, LBA4404) осуществляли методом трехродительского скрещивания.
Молекулярно-генетический анализ
Для идентификации гена эндонуклеазы Cas9, гидРНК и регуляторных элементов в бинарном векторе pRGEB31 был использован ПЦР анализ с помощью праймеров, разработанных
в программе Snape Gene Viewer 6.0, Unipro UGENE 41.0 (табл. 1).
Объем смеси для амплификации одного образца составлял 25 мкл, в смесь входили следующие реагенты: 100 нг ДНК, 2,5 мкл 10Х буфера с (NH4)2SO4 (Thermo Fisher Scientific), 2,5 мкл 10 мМ смеси нуклеотидов (dNTP) (Thermo Fisher Scientific), 2 мкл 25 мМ MgCL2 (Thermo Fisher Scientific), 2,5 мкл каждого из праймеров, 0,2 мкл 5 ед. Taq ДНК-полимеразы (Праймтех), 10,7 мкл H2O. Амплификацию проводили в амплификаторе BioRad с использованием следующей программы: денатурация — 94 °C 4 мин; затем 35 циклов — 94 °C 30 сек, температура отжига праймеров (согласно табл. 1) — 45 сек, 72 °C — 1 мин; ренатурация — 72 °C 7 мин. Продукт реакции разделяли в 1% агарозном геле с бромистым этидием в электрическом поле с помощью камеры для горизонтального электрофореза фирмы «BioRad». Фрагмент после электрофореза визуализировали с помощью системы BioRad GelDoc2000. Для более достоверного анализа ПЦР продуктов проводили разделение фрагментов ДНК в 6% полиакриламидном геле (ПААГ) с помощью камеры для вертикального электрофореза фирмы «BioRad». Продукты ПЦР разделяли в течение 2 ч при напряжении 280 В c предварительным прогоном геля в течение 1 ч при 100 В. Гель окрашивали раствором бромистого этидия в концентрации 0,5 мг/л 15-20 мин. После окрашивания визуализировали с помощью системы BioRad GelDoc2000.
Agrobacterium-опосредованная трансформация и морфогенез в культуре in vitro
Культивирование ночной культуры A. tumifaciens штаммов EHA105, LBA4404 проводилось в темноте в течение 24 ч при 24 °C в 20 мл жидкой среды LB c добавле-
нием антибиотиков канамицина и рифам-пицина в концентрациях 50 мг/л и 100 мг/л, соответственно. С помощью полученной агробактериальной суспензии проводили инфицирование эксплантов. В качестве экс-плантов использовались листья 3-4-недельных растений табака, выращенных в асептических условиях. Подготовленная агробактериальная суспензия втиралась легкими движениями в среду для кокультивации и предварительно нарезанные растительные экспланты размером 0,3-0,5 х 0,3-0,5 см выкладывались на ага-ризованную среду CIM (0,2 мг/л БАП, 1 мг/л НУК) и кокультивировались в течение 24-48 ч в темноте при t = 25 °C без селекции. Далее экспланты переносились на селективную среду SIM (1 мг/л БАП, 0,1 мг/л НУК) для инициации процессов тканевой дедифферен-циации и каллусогенеза, содержащую антибиотик гигромицин в концентрации 10 мг/л при 24/18 °C, 16/8-часовом фотопериоде при освещенности порядка 2 000-3 000 люкс.
Результаты и их обсуждение
Сегодня эффективным и новейшим методом редактирования растительного генома является система CRISPR/Cas9. Одним из ключевых моментов геномного редактирования является выбор мишени, который непосредственно сопряжен с дизайном гидовой РНК [23-25].
В нашей работе в качестве гена-мишени мы использовали ген NtPDS N. tabacum, кодирующий фермент 15-цис-фитоендесатуразу. 15-цис-фитоендесатураза является ключевым ферментом биосинтеза каротиноидов. Предполагается, что каротиноиды в фотосинтетических системах предотвращают повреждения, вызываемые образованием синглетного кислорода, за счет диссипации избыточной световой энергии, путем дезактивации возбужденных молекул хлорофилла в триплетном состоянии или путем прямого тушения молекул синглет-ного кислорода [26, 27]. Любые изменения в работе данного фермента, а в нашем случае нокаут гена NtPDS, приведут к фенотипу альбинизма и карликовости у растений за счет нарушения биосинтеза хлорофилла, каротиноидов и гиббереллинов [28, 29]. Следовательно, ген NtPDS является удобной мишенью для CRISPR/Cas9-опосредованного нокаута генов у различных видов растений,
так как позволяет обнаружить генетически измененные растения по фенотипу и относительно легко оценить эффективность работы векторных конструкций [30-33].
Последовательности высокоспецифичных направляющих спейсерных РНК для нокаута гена NtPDS были нами разработаны на основе эталонной последовательности генома N. tabacum (NCBIID: 425) и с использованием инструментов анализа генома и гена-мишени CRISPRdirect, CRISPOR, CCTop. Успешное использование данных программ и онлайн ресурсов для подбора гидРНК с высокой степенью специфичности и минимальными off-targert эффектами было показано в ряде зарубежных работ [34, 35]. При использовании выше описанных биоинформатических платформ было выбрано 3 высокоспецифичные гидРНК (20 п. н.) с минимальными off-target эффектами, и для формирования спейсерных дуплексов гидРНК были смоделированы прай-меры с помощью программ SnapeGene Viewer 6.0, Unipro UGENE 41.0, ApE (A plasmid Editor) — gRNA5, gRNAJp 2, gRNADeT186 (табл. 1).
Соответствие выбранных гидРНК различным протоспейсерам мишени и наличие примыкающей к спейсеру последовательности РАМ (5'-NGG-3') было показано in silico: gRNA5 комплементарна протоспейсеру, находящемуся в 5 экзоне гена NtPDS (3 085-3 105 п. о.), gRNAJp2 — в 6 экзоне (3 384-3 402 п. о.), gRNADeT186 — во 2 экзоне (985-1 004 п. о.). В результате с помощью выбранных гидРНК нами было сконструировано 3 векторные конструкции: pRGEB31 + gRNA-pds (gRNA варьирует в зависимости от спейсерной последовательности). Дуплексы гидРНК были синтезированы с помощью синтетических олигонуклеотидов (раздел «Материалы и методы»), после чего по двойному сайту эндонуклеазы рестрикции BsaI были клонированы в бинарный вектор pRGEB31 (рис. 1)
В эукариотических клетках Cas9 экс-прессируется, как правило, со стандартных промоторов, таких как CaMV, а гидРНК, в свою очередь, с U3 или U6 промоторов. В нашем случае мы используем бинарный вектор pRGEB31 для совместной экспрессии гена Cas9 под контролем CaMV 35S промотора и последовательности гидРНК под U3 промотором. Для образования рибонуклеинового
SV4CNLS CsMV3SS promoter gRNA-seaffold
gRNA-targert (388)
CsU3 promoter^
NOS terminator nuclsoplasmin NLS \ Cas9
CaMVpoly|A (signal
KanR
/
HygRCaMV35S promoter
o<
pRGEB31+gRNA-pds
Рис. 1. Схема плазмидыpRGEB31 + gRNA-pds, содержащей gRNA, комплементарую протоспейсеру гена NtPDS: gRNA-targert — спейсер, комплементарный выбранному протоспейсеру мишени; OsU3 promoter — Oryza sativa U3 промотор; gRNA scaffold — константная часть гидРНК; CaMV 35S promoter — конститутивный промотор вируса мозаики цветной капусты; Cas9 — Cas9 (Csnl) эндонуклеаза из Streptococcus pyogenes TypeII CRISPR/Cas system; NOS terminator — нопалинсинтазный терминатор; Nucleoplasmin NLS — двойной сигнал ядерной локализации
комплекса Cas9/гидРНК в нашей конструкции ген Cas9 слит с сигналом клеточной локализации (NLS), т. к. в отличие от гидРНК мРНК Cas9 транслируется в цитозоле, после чего уже белок Cas9 возвращается в ядро. Попав в ядро, белок Cas9 образует рибонуклеиновый комплекс с гидРНК, способный специфично расщеплять ДНК [36, 37].
Полученные векторные конструкции методом теплового шока были введены в компетентные клетки E. coli XL1-Blue, DH5a. Для первичного скрининга трансфор-
мированных колоний E. coli мы использовали ПЦР анализ со специфическими праймерами (табл. 1), амплифицирующими фрагмент размером 555 п. о., содержащий U3 промотор, константную и вариабельную части гидРНК с последующим разделением в 1% агарозном геле (рис. 2).
Из электрофореграммы на рисунке 2 видно, что размер фрагмента соответствует ожидаемому — 555 п. о. и присутствует в отобранных на селективной среде клонах E. coli. Для более достоверного скринига мы использовали разде-
Рис. 2. Электрофореграмма ПЦР-продукта (555 п. н.) первичного скринига колоний E. coli, выявленного посредством праймеров: U3Cas9-F, gRNA-R: 1, 17 — маркер молекулярного веса Gene Ruler 100bpPlus DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific), 1-16 — анализируемые колонии E. Coli, 18 — контроль
ление продуктов амплификации, полученных с помощью праймеров, фланкирующих часть U3 промотора, константную и вариабельную части гидРНК размером 200 п. о., в 6% ПААГ, позволяющем разделять короткие фрагменты, различающиеся в 4 п. о. (рис. 3).
Анализ ПЦР продукта посредством ПААГ показал наличие ожидаемого фрагмента размером 200 п. о. в колониях E. coli после трансформации, что видно на элкетрофоре-грамме, представленной на рисунке 3.
Для стабильной интеграции CRISPR/Cas9 системы в геном N. 1аЬасит нами были использованы агробактериальные штаммы А. tumefaciens ЕНА105, LBA4404. Методом трехродительского скрещивания бинарные векторы, несущие CRISPR/Cas9 систему, были введены в А. tumifaciens штаммы LBA4404, ЕНА105. Селекция агробактериальных колоний осуществлялась на среде, содержащей антибиотики канамицин (50 мг/л) и рифампицин (100 мг/л). Наличие векторной конструкции
Рис. 3. Электрофореграмма ПААГ ПЦР-продукта размером 200 п. о. колоний E. coli, выявленного посредством праймеров: gRNA-F, gRNA-R: m — маркер молекулярного веса Gene Ruler 100bpPlus DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific), 1-19 — анализируемые колонии E. coli, 20 — контроль
в А. tumifaciens было подтверждено методом ПЦР со специфичными праймерами к спейсе-ру и из промотору. Размер ПЦР фрагментов соответствует ожидаемому и составляет 406 п. н. (рис. 4). Амплификация проводилась для каждой сконструированной гидРНК со специфическими праймерами, представленными в таблице 1.
Для определения нуклеотидной последовательности и корректности сборки век-
торных конструкций был выбран метод секвенирования по Сэнгеру. Предварительно нами были амплифицированы продукты размером 555 п. о. и 406 п. н., полученных клонов E. coli и клонов A. tumefaciens, соответственно. Для амплификации данных фрагментов были использованы олигонуклеотиды, представленные в таблице 1. Анализ данных, полученных методом секвенирования по Сэнгеру с помощью программы SnapeGene Viewer 6.0 и базы
Рис. 4. Электрофореграмма ПЦР-продукта (406 п. н.), выявленного при амплификации клонов A. tumefaciens посредством праймеров: U3Cas9-F, gRNA5-R, несущих CRISPR/Cas9 систему: 1,11 — маркер молекулярного веса GeneRuler 1kp Plus DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific), 2-10 — анализируемые колонии A. tumifaciens,
12 — контроль
данных NCBI, показал, что нуклеотидный состав продукта размером 555 п. о. соответствует U3 промотору, тракрРНК и крРНК, продукта 406 п. о. клонов A. tumefaciens, соответствует U3 промотору и гидовойРНК. Общий анализ полученных нуклеотидных последовательностей E. coli и A. tumefaciens показал корректность сборки CRISPR/Cas9 системы в бинарном векторе pRGEB31.
Для доставки CRISPR/Cas9 системы в рас-
тигельный геном и ее стабильной интеграции и экспрессии мы использовали метод Agrobacterium-опосредованной трансформации листовых дисков линии табака Nicotiana tabacum sv. Petit Havana SRI. При выборе эксплантов в культуре in virto важно учитывать первоначальную дедифференциацию тканей исходного экспланта, поскольку от этого зависит дальнейший морфогенетический потенциал генотипа. Было показано, что использование
в качестве эксплантов листьев приводит к значительному образованию стеблевых почек на средах с цитокининами, а гиббереллины оказывают стимулирующее действие исключительно на экспланты листового происхождения [38, 39]. В наших исследованиях используя векторные конструкции для нокаута гена pRGEB31 + gRNA5-pds, pRGEB31 + gRNAJp2-pds,pRGEB31 + gRNADeT186-pds, посредством А. tumefaciens было трансформировано 752
эффективности и специфичности данной конструкции. Более высокая эффективность гидРНК комплементарной последовательности 5 экзона при нокауте гена мишени NtPDS также была показана в работах Gao J et al. [40].
Изменения в работе гена мишени NtPDS можно было визуализировать уже на этапе каллусогенеза: в опытном варианте у каллусов табака наблюдался фенотип химерного альбинизма, в отличии от контрольного
экспланта. Процессы дедиференцировки листвой ткани и каллусогенеза в опытном варианте удалось инициировать с различной частотой (табл. 2).
Из данных, представленных в таблице 2, видно, что максимальная частота каллу-согенеза наблюдалась при использовании векторной конструкции, содержащей гидРНК, комплементарной протоспейсеру 5 экзона, что может свидетельствовать о более высокой
варианта (рис. 5).
Влияние изменений в гене PDS при использовании CRISPR/Cas9 на фенотип и высоту растения было показано также на таких культурах, как Glycine max, Solánum tuberósum, Oryza sativa, Populus davidiana x P bolleana, Cassava,Vitis vinifera, Cucumis melo и банане [41-48].
Заключение
С помощью методов биоинформати-
Таблица 2
Инициация процессов каллусогенеза в листовых дисках табака, трансформированных конструкциями, несущими CRISRP/Cas9 систему
Конструкция Количество эксплантов (шт.) Количество каллусов (шт.) Частота каллусогенеза (%)
pRGEB3l + gRNA5-pds 272 150 55,14
pRGEB3l + gRNAJp2-pds 240 98 40,83
pRGEB3l + gRNA-DeTl86-pds 240 73 30,42
Контроль 250 241 96,40
Рис. 5. Каллусогенез в культуре in vitro N. tabacum: A — опытный вариант при использовании векторной генетической конструкции pRGEB31 + gRNAJp2-pds, B — контрольный вариант
ческого анализа, молекулярно-генетиче-ского клонирования и базы данных NCBI были созданы 3 векторные конструкции: pRGEB31 + gRNA5-pds, pRGEB31 + gRNAJp2-pds, pRGEB31 + gRNADeT186-pds, несущие в своем составе гидРНК к различным кодирующим последовательностям гена NtPDS N. tabacum. Продукт данного гена (15-цис-фи-тоендесатураза) влияет на биосинтез хлорофилла у высших растений. Повреждение гена приводит к фенотипу альбиносов и карликовости. Созданные векторные конструкции несут в своем составе CRISRP/Cas9 систему Streptococcus pyogenes, состоящую из эндонуклеазы Cas9 под 35S промотором и одиночной направляющей (гидовой) РНК под OsU3 промотором. Используя различные био-информатические платформы были выбраны для работы последовательности гидовых РНК с высокой специфичностью (с минимальными off-target эффектами и оптимальным содержанием GC пар — 40-55%) к выбранным протоспейсерным последовательностям гена-мишени NtPDS и с проксимально расположенной последовательностью РАМ (5'-NGG-3'). Используя метод секвенирования по Сэнгеру была подтверждена корректность и правильность сборки созданных векторных конструкций. Методом Agrobacterium-опосре-дованной трансформации листовых дисков векторные конструкции были введены в геном N. tabacum sv. Petit Havana SR1. В результате трансформации был инициирован процесс каллусогенеза и получен морфоргенный каллус, имеющий фенотип химерного альбиноса. Максимальная частота каллусогенеза наблюдалась при использовании конструкции pRGEB31 + gRNA5-pds. Таким образом, впервые в Республике Беларусь созданы эффективные векторные конструкции для редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas9. Методические подходы, разработанные в представленном исследовании, будут использованы в дальнейшем для редактирования геномов сельскохозяйственно-важных растений.
Список использованных источников
1. Multiplex genome engineering using CRIS-PR/Cas systems / L. Cong [et al.] / Science. - 2013. - Vol. 339, № 6 121. - P. 819-823. doi.
org/10.1126/science.1231143.
2. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease / SW. Cho [et al.] //Nat Biotechnol. - 2013. - Vol. 31, № 3. - P. 230-2. doi: 10.1038/nbt.2507.
3. Swartjes, T. Editor's cut: DNA cleavage by CRISPR RNA-guided nucleases Cas9 and Cas12a / T. Swartjes, R. Staals, J. van der Oost //Biochemical Society transactions. - 2020.
- Vol. 48 (1). - P. 207-219. doi.org/10.1042/ BST20190563.
4. Modern trends in plant genome editing: an inclusive review of the CRISPR/Cas9 toolbox / A. Razzaq [et al.] // International journal of molecular sciences. - 2019. - Vol. 20 (16). - 4 045 p. doi.org/10.3390/ijms20164045.
5. Samanta, MKCRISPR/Cas9: an advanced tool for editing plant genomes / MK. Samanta, A. Dey, S. Gayen // Transgenic Res. - 2016.
- Vol. 25 (5). - P. 561-73. doi: 10.1007/s11248-016-9953-5.
6. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA / H. Nishimasu [et al.] // Cell. - 2014. - Vol. 156 (5). - P. 935-49. doi: 10.1016/j.cell.2014.02.001.
7. Protospacer recognition motifs: mixed identities and functional diversity. RNA / SA. Shah [et al.] // Biol. - 2013. - Vol. 10 (5). - P. 891-9. doi: 10.4161/rna.23764.
8. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system / FJM. Mojica [et al.] // Microbiology (Reading). - 2009.
- Vol. 155 (Pt 3). - P. 733-740. doi: 10.1099/ mic.0.023960-0. PMID: 19246744.
9. Latest developed strategies to minimize the off-target effects in CRISPR-Cas-mediated genome editing / M. Naeem [et al.] // Cells. -2020. - Vol. 9 (7). - P. 1 608. doi.org/10.3390/ cells9071608.
10. Zhang, ZR. Effective use of sequence information to predict CRISPR-Cas9 off-target/ ZR. Zhang, ZR. Jiang // ComputStructBiotechnol J. - 2022. - Vol. 19 (20). - P. 650-661. doi: 10.1016/j.csbj.2022.01.006.
11. CRISPR-Cas9 induces large structural variants at on-target and off-target sites in vivo that segregate across generations / I. Hoijer[et al.] // Nat Commun. - 2022. - Vol. 13 (1). - P. 627. doi: 10.1038/s41467-022-28244-5.
12. Whole-genome sequencing reveals rare off-target mutations in CRISPR/Cas9-edited
grapevine / X. Wang [et al.] // Horticulture research. - 2021. - Vol. 8 (1). - 114 p. doi. org/10.1038/s41438-021-00549-4.
13. Strategies to increase on-target and reduce off-target effects of the CRISPR/Cas9 system in plants / Z. Hajiahmadi [et al.] // International journal of molecular sciences. - 2019.
- Vol. 20(15). - P. 3 719. doi.org/10.3390/ ijms20153719.
14. Achieving plant CRISPR targeting that limits off-target effects / JD. Wolt [et al.] //Plant Genome. - 2016. - Vol. 9 (3). - P. 1-8. doi: 10.3835/plantgenome2016.05.0047.
15. CRISPR-Cas9 editing in maize: systematic evaluation of off-target activity and its relevance in crop improvement / J. Young [et al.] // Scientific reports. - 2019. - Vol. 9 (1). - P. 6 729. doi. org/10.1038/s41598-019-43141-6.
16. Доставка CRISPR/Cas-компонентов в клетки высших растений для редактирования их геномов / Б. Р. Кулуев [и др.] // Физиология растений. - 2019. - T. 66, № 5. - С. 339-353.
17. Van Eck, J. Applying gene editing to tailor precise genetic modifications in plants / J. Van Eck // The Journal of biological chemistry. -2020. - Vol. 295, (38). - P. 13 267-13 276. doi. org/10.1074/jbc.REV120.010850.
18. Demonstration of CRISPR/Cas9/sgR-NA-mediated targeted gene modification in Arabi-dopsis, tobacco, sorghum and rice / W. Jiang [et al.] // Nucleic Acids Res. - 2013. - Vol. 41 (20).
- P. e188. doi: 10.1093/nar/gkt780.
19. Cas9-Guide RNA Directed Genome Editing in Soybean / Z. Li [et al.] // Plant Physiol. -2015. - Vol. 169 (2). - P. 960-70. doi: 10.1104/ pp.15.00783.
20. The CRISPR/Cas9 system and its applications in crop genome editing / A. Bao [et al.] // Crit Rev Biotechnol. - 2019. - Vol. 39 (3). - P. 321336. doi: 10.1080/07388551.2018.1554621.
21. P. Wang [et al.] //High efficient multisites genome editing in allotetraploid cotton (Gossyp-ium hirsutum) using CRISPR/Cas9 system. Plant Biotechnol J. - 2018. - Vol. 16 (1). - P. 137-150. doi: 10.1111/pbi.12755.
22. Xie, K. RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system. / Xie K, Yang Y. // Mol Plant. - 2013. - Vol. 6 (6). - P. 1 975-83. doi: 10.1093/mp/sst119.
23. Periwal, V. A comprehensive overview of computational resources to aid in precision
genome editing with engineered nucleases / Periwal, V. // Brief Bioinform. - 2017. - Vol. 18(4).
- P. 698-711. doi: 10.1093/bib/bbw052.
24. Дизайн РНК-гидов для CRISPR/Cas редактирования геномов растений / Геращен-ков, Г. А. [и др.] // Молекулярная биология.
- 2020. - T. 54, № 1. - C. 29-50.
25. Molecular adaptation of photoprotection: triplet states in light-harvesting proteins / A. Gall [et al.] //Biophys J. - 2011. - Vol. 101 (4) -P. 934-42. doi: 10.1016/j.bpj.2011.05.057.
26. Mechanisms underlying carotenoid absorption in oxygenic photosynthetic proteins / M. M. Mendes-Pinto [et al.] // The Journal of biological chemistry. - 2013. - Vol. 288 (26). - P. 18 758-18 765. doi.org/10.1074/jbc. M112.423681.
27. Disruption of phytoene desaturase gene results in albino and dwarf phenotypes in Arabidopsis by impairing chlorophyll, carotenoid, and gibberellin biosynthesis / G. Qin [et al.] // Cell Res. - 2007. - Vol. 17. - P. 471-482. doi. org/10.1038/cr.2007.40.
28. Norris, S. R. Genetic dissection of carotenoid synthesis in arabidopsis defines plastoquinone as an essential component of phytoene desaturation / S. R. Norris, T. R. Barrette, D. DellaPenna // The Plant cell. - 1995. - Vol. 7 (12). - P. 2 139-2 149. doi.org/10.1105/tpc.7.12.2139.
29. CRISPR/Cas9-mediated efficient editing in phytoene desaturase (PDS) demonstrates precise manipulation in banana cv. Rasthali genome / N. Kaur [et al.] // FunctI ntegr Genomics. -2018. - Vol. 18 (1). - P. 89-99. doi: 10.1007/ s10142-017-0577-5.
30. Genome editing in PDS genes of tomatoes by non-selection method and of Nicotiana benthamiana by one single guide RNA to edit two orthologs / H. Komatsu [et al.] // Plant biotechnology. - 2020. - Vol. 37 (2). - P. 213-221. doi.org/10.5511/plantbiotechnology.20.0527b.
31. Efficient genome editing in apple using a CRISPR/Cas9 system / C. Nishitani [et al.] // Nat Sci Rep. - 2016. - Vol. 6. - 31 481 p. doi. org/10.1038/srep31481.
32. CRISPR/Cas9-mediated efficient and heritable targeted mutagenesis in tomato plants in the first and later generations / C. Pan [et al.] // Sci Rep. - 2016. - Vol. 6. - P. 247-265. doi. org/10.1038/srep24765.
33. Efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted
mutagenesis in Populus in the first generation /D. Fan [et al.] // Sci Rep. - 2015. - Vol. 5. - P. 12 217. doi.org/10.1038/srep12217.
34. CCTop: an intuitive, flexible and reliable CRISPR/Cas9 target prediction tool / M. Stemmer [et al.] // PLOS ONE. - 2015. - Vol. 10 (4). -P. e0124633.doi: 10.1371/journal.pone.0124633.
35. Refined sgRNA efficacy prediction improves large- and small-scale CRISPR-Cas9 applications / M. Labuhn [et al.] // Nucleic Acids Research. - 2017. - Vol. 46 (3). - P. 1 375-1 385. doi: 10.1093/nar/gkx1268.
36. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins / S. Kim [et al.] // Genome Res. - 2014. - Vol. 24 (6). - P. 1 012-9. doi: 10.1101/gr.171322.113.
37. Comparison of various nuclear localization signal-fused Cas9 proteins and Cas9 mRNA for genome editing in zebrafish / P. Hu [et al.] // G3 (Bethesda, Md.). - 2018. - Vol. 8 (3). -P. 823-831. doi.org/10.1534/g3.117.300359.
38. Preece, J. E. Problems with explant exudation in micropropagation / J. E. Preece, M. E. Compton // Biotechnology in Agriculture and Forestry. - 1991. - Vol. 17. - P. 168-189.doi. org/10.1007/978-3-642-76415-8_10.
39. Meins, F. The Induction of cytokinin habituation in primary pith explants of tobacco/ F.Meins, J. Lutz // Planta. - 1980. - Vol. 149 (4). - P. 402-407.
40. CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Nicotiana tabacum / J. Gao [et al.] //Plant Mol Biol. - 2015. - Vol. 87 (1-2). - P. 99-110. doi: 10.1007/s11103-014-0263-0.
41. Lu, QSMAn efficient and specific CRIS-PR-Cas9 genome editing system targeting soybean phytoene desaturase genes / QSM Lu,
L. Tian // BMCBiotechnol. - 2022. - Vol. 22 (1).
- P. 7. doi: 10.1186/s12896-022-00737-7.
42. CRISPR/Cas9-mediated efficient editing in phytoene desaturase (PDS) demonstrates precise manipulation in banana cv. Rasthali genome / N. Kaur [et al.] // FunctIntegr Genomics. - 2018.
- Vol. 18. - P. 89-99. doi.org/10.1007/s10142-017-0577-5.
43. Efficient targeted mutagenesis in potato by the CRISPR/Cas9 system / S. Wang [et al.] // Plant Cell Rep. - 2015. - Vol. 34. - P. 1 473-1 476. doi. org/10.1007/s00299-015-1816-7.
44. Comparison of CRISPR-Cas9/Cas12a ribonucleoprotein complexes for genome editing efficiency in the rice phytoenedesaturase (OsPDS) gene / R. Banaka r[et al.] // Rice (N Y). - 2020.
- Vol. 13 (1). - P. 4. doi.org/10.1186/s12284-019-0365-z.
45. CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in grape / I. Nakajima[et al.] // PLOS ONE. -2017. - Vol. 12 (5). - P. e0177966. doi. org/10.1371/journal.pone.0177966.
46. Hooghvorst, I. Efficient knockout of phytoene desaturase gene using CRISPR/Cas9 in melon / I. Hooghvorst, C. López-Cristoffanini, S. Nogués, // Scientific reports. - 2019. -Vol. 9 (1). - 17 077 p. doi.org/10.1038/s41598-019-53710-4.
47. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing of phytoene desaturase in Cassava / J. Odipio [et al.] // Front Plant Sci. - 2017. - Vol. 18 (8). - P. 1 780. doi: 10.3389/fpls.2017.01780.
48. Efficient CRISPR/Cas9-mediated gene editing in an interspecific hybrid poplar with a highly heterozygous genome/ J. Wang [et al.] // Front. Plant Sci.- 2020. - Vol. 7. - 703 p. doi. org/10.3389/fpls.2020.00996.
A. M. Shishlova-Sokolovskaya, E. P. Khmilevskaya, O. Yu. Urbanovich
DEVELOPMENT OF THE CRISPR/CAS9 SYSTEM FOR THE GENOME EDITING OF THE NtPDS GENE OF TOBACCO (NICOTIANA TABACUM)
State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, Republic of Belarus e-mail: s_anastasia78@mail.ru
The CRISPR/Cas9 system is one of the most powerful tools for the editing of plant genomes. In the presented study, the vector constructs developed on the basis of the CRISPR/Cas9 system were used to edit the Nicotiana tabacum genome. The NtPDS gene encoding the 15-cis-phytoene desaturase enzyme was chosen as the target. A knockout of this gene in plants results in the albinism phenotype and dwarfism. Using the in silico bioinformatics platforms, three vector constructs based on the binary pRGEB31 vector were modeled: pRGEB31 + gRNA4-pds, pRGEB31 + gRNAJp2-pds, andpRGEB31 + gRNADeT186-pds, carrying in its composition the CRISRP/Cas9 system with spacers to different parts of the structural domains of the NtPDS gene. Vector constructs were assembled using molecular cloning techniques. The accuracy and correctness of their assembly was confirmed by Sanger sequencing. By means of Agrobacterium-mediated transformation of leaf discs, the genetic constructs were introduced into the genome of the N. tabacum cv. Petit Havana SR1 model object. During the cultivation of tobacco leaf discs, it was possible to initiate callusogenesis and morphogenesis processes using all three constructs, however, the maximum frequency of these processes was observed when using the pRGEB31 + gRNA4-pds construct.
Keywords: system CRISPR/Cas9, g/sgRNA, PAM, pRGEB31, NtPDS, Nicotiana tabacum.
Дата поступления в редакцию: 26 мая 2022 г.
