CC BY
24
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2021, том 56, № 1, с. 20-31
Геномные технологии
УДК 633.853.55:575.1:577.21 doi: 10.15389/agrobiology.2021.1.20rus
СЕКВЕНИРОВАНИЕ ПРОМОТОРОВ ГЕНОВ U6 КЛЕЩЕВИНЫ (Ricinus communis L.) И СОЗДАНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ГЕНОМНОГО РЕДАКТИРОВАНИЯ С ПОМОЩЬЮ СИСТЕМЫ
CRISPR/Cas9*
О.С. АЛЕКСАНДРОВ Г.И. КАРЛОВ
Клещевина — важная сельскохозяйственная культура, которую выращивают во многих странах мира и используют в основном для получения касторового масла, широко применяемого в различных отраслях промышленности. Жмыхи и шроты, которые остаются после отжима масла, богаты белком и перспективны для использования в качестве протеиновых добавок при производстве кормов, однако содержат токсины — белок рицин и алкалоид рицинин. Одним из способов детоксификации клещевины может стать геномное редактирование с помощью системы CRISPR/Cas9. Эта технология заключается в разрезании целевого участка интактной ДНК ферментом Cas9 при содействии короткого направляющего фрагмента РНК. Доставка в клетку редактируемого растения генов, кодирующих Cas9 и направляющую РНК, часто осуществляется с помощью плазмидных векторов. Для эффективного синтеза направляющей РНК в таких векторах обычно используют промоторы генов, кодирующих малые ядерные РНК. При редактировании двудольных растений чаще всего используют промотор U6 гена арабидопсиса, однако эффективность редактирования повышается, если использовать векторные конструкции с промотором редактируемого растения. В настоящей работе впервые проведена амплификация, секвенирование и анализ промоторов гена U6 клещевины. Найденные последовательности были проанализированы и использованы в конструировании CRISPR/Cas9 векторов для дальнейшего редактирования генов рицина. Нашей целью было изучение промоторов гена U6 клещевины с помощью биоинформационных и молекулярно-генетических подходов. В работе использовали растения клещевины (Ricinus communis L.) сортов Занзибар Грин и Гибзонская. ДНК выделяли из молодых листьев. Обработку последовательностей, выравнивание и определение степени гомологии проводили в программе GenDoc (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/index.html). Праймеры для амплификации промоторов гена U6 клещевины подбирали с помощью программы Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). ПЦР проводили на амплификаторе C-100 («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США). Продукты ПЦР разделяли в 1,5 % агарозном геле при 6 В/см в камере для горизонтального электрофореза Sub-Cell GT («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США). Ампликоны очищали с помощью набора GeneJET PCR Purification Kit («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США). Очищенные ампликоны клонировали с помощью вектора pAL2-T («Евроген», Россия) согласно инструкции производителя. При конструировании CRISPR/Cas9 векторов использовали плазмиду pRGE31, эндонуклеазы рестрикции HindIII и SbfI («Сибэнзим», Россия) и необходимые олигонуклеотиды. При вырезании продуктов рестрикции из геля их очищали с помощью набора GeneJET Gel Extraction Kit («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США). Был проведен биоинформационный поиск в базе генетических данных GenBank и обнаружено 12 скаффолдов, содержащих последовательность гена U6 клещевины. Шесть промоторов, включающих неповрежденные регуляторные элементы USE и ТАТА-бокс, были использованы при подборе праймеров для амплификации на матрице ДНК клещевины сортов Занзибар Грин и Гибзонская. Продукты ПЦР, состоящие из единичных фрагментов, были клонированы и секвенированы. Анализ полученных последовательностей ампликонов показал, что про-моторные области полностью совпадали между сортами. Степень идентичности промоторов из разных ампликонов варьировала в пределах 51-77 %. При сравнении этих же промоторов с промоторами гена U6 других растений степень гомологии составляла 42-64 %. Последовательности промоторов, содержащие неповрежденные мотивы USE и ТАТА-бокс, были использованы для конструирования CRISPR/Cas9 векторов, которые могут применяться для эффективного редактирования генов клещевины, участвующих в синтезе рицина и рицинина.
Ключевые слова: клещевина, промотор, U6 гены, секвенирование, геномное редактирование, CRISPR/Cas9, конструирование векторов.
Клещевина (Ricinus communis L.) — это сельскохозяйственное растение семейства Молочайные (Euphorbiaceae), культивируемое во многих странах мира. Возделывается в основном ради семян, из которых получают ценный продукт — касторовое масло, используемое в различных отраслях
* Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, Соглашение от 21 июля 2017 г. № 17-74-10233 по научному проекту: «Адаптация элементов технологии геномного редактирования CRISPR/Cas9 для улучшения генома клещевины обыкновенной (Ricinus communis L.)».
народного хозяйства (1). Касторовое масло практически не высыхает и сохраняет свойства в широком диапазоне рабочих температур, поэтому находит применение в системе смазки машин в пищевой промышленности и двигателей для авиамоделирования, а также служит компонентом пластичных смазок (2). В нем содержатся ценные для химического синтеза вещества — ундециленовая и себациновая кислоты, компоненты эпоксидных и алкидных смол и др. В медицине касторовое масло издавна применяется как эффективное слабительное средство (3, 4).
После извлечения масла из семян клещевины остаются богатые протеином остатки — жмыхи и шроты, перспективные для использования в качестве белковых добавок при производстве кормов. Однако в этих остатках содержатся токсичные вещества — белок рицин и алкалоид рицинин (5). Рицин представляет собой кумулятивный яд, обладающий сильным местным прижигающим действием, что приводит к развитию геморрагического гастроэнтерита. После всасывания рицина в кровеносную систему происходит агглютинация и разрушение эритроцитов, возрастает риск тромбозов, изъязвляются стенки сосудов. Кроме того, рицин негативно воздействует на центральную нервную систему, вызывая судороги, парезы и параличи (6). Токсичность рицинина намного меньше, чем у рицина, но его наличие в кормах также нежелательно. Детоксификацию жмыхов и шротов клещевины проводят чаще всего с помощью жестких термических и химических обработок, что значительно ухудшает качество белка. Снижается его переваримость и усвояемость, происходит гидролиз лизина и других дефицитных аминокислот (5). В связи с этим актуален поиск альтернативных подходов к детоксификации жмыхов и шротов клещевины, которые позволили бы отказаться от традиционных обработок.
Несомненный теоретический и практический интерес представляет получение растений клещевины, в которых не вырабатывались бы рицин и рицинин. Для создания таких растений необходимо осуществить нокаут генов, участвующих в синтезе токсинов. Один из эффективных современных способов нокаутирования генов — технология геномного редактирования с помощью системы CRISPR/Cas9. Ее компонентами служат фермент Cas9 и направляющая, или гидовая, РНК (7). Гены фермента Cas9 и направляющей РНК вводятся в клетку с помощью плазмидных векторов под соответствующими промоторами. Для гена гидовой РНК обычно используют промоторы генов малых ядерных РНК U6 или U3 (8). При геномном редактировании у однодольных, как правило, используют последовательности U3 промоторов риса, в случае двудольных — U6 промоторов арабидопсиса. Однако в ряде работ было показано, что эффективность редактирования возрастает при использовании промоторов редактируемого вида, и их введение в CRISPR/Cas9 векторы стало распространенным трендом (9-13). При изучении промоторов гена U6 у разных видов было установлено, что они содержат два сайта узнавания РНК-полимеразы III — Upstream Sequence Element (USE) и TATA-бокс (11, 13, 14). Сайт USE имеет консенсусную последовательность RTCCCACATCG. На основе этой последовательности и последовательности самого гена U6 арабидопсиса C. Marshallsay с соавт. (14) предложили систему праймеров для амплификации промоторов гена U6. Эти праймеры пригодны для изучения промоторов гена U6 у других видов, геном которых еще не секвенирован.
На сегодняшний день секвенированы геномы ряда представителей семейства Euphorbiaceae (Jatropha curcas, Manihot esculentum, Hevea brasiliensis, Euphorbia esula), в том числе и геном клещевины (15-19). Также секвениро-ваны и изучаются кодирующие рицин последовательности (20-23). Они не
содержат интронов, поэтому с них транслируется большой прекурсор, называемый препрорицин, который содержит сигнальный пептид и цепи рицина A и B, разделенные линкерным пептидом из 12 аминокислот (20). Наиболее подходят в качестве мишеней для редактирования части, кодирующие сигнальный пептид или начало цепи А (23, 24).
В настоящей работе впервые проведена амплификация, секвениро-вание и анализ промоторов гена U6 клещевины. Найденные последовательности проанализированы и использованы в конструировании CRISPR/Cas9 векторов для дальнейшего редактирования генов рицина.
Нашей целью было изучение промоторов гена U6 клещевины с помощью биоинформационных и молекулярно-генетических подходов.
Методика. В работе были использованы растения клещевины сортов Занзибар Грин («Гавриш», Россия) и Гибзонская («Гавриш», Россия).
ДНК выделяли из молодых листьев согласно методике J.J. Doyle с соавт. (25) с некоторыми модификациями (26). Обработку последовательностей, выравнивание и определение степени гомологии проводили в программе GenDoc (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/index.html).
Праймеры для амплификации промоторов гена U6 клещевины подбирали с помощью программы Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Условия ПЦР на амплификаторе C-100 («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США) были следующими: 5 мин при 95 °C; 30 с при 95 °C, 30 с при 50 °C, 1 мин при 72 °C (35 циклов); 10 мин при 72 °C (терминальная элонгация).
Продукты ПЦР разделяли в 1,5 % агарозном геле при 6 В/см в камере для горизонтального электрофореза Sub-Cell GT («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США). Результаты электрофореза визуализировали с помощью системы гель-документирования Gel Doc™ XR+ («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США). Ампликоны очищали с использованием набора GeneJET PCR Purification Kit («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США).
Очищенные ампликоны клонировали с помощью вектора pAL2-T («Евроген», Россия) согласно инструкции производителя.
При конструировании CRISPR/Cas9 векторов использовали плаз-миду pRGE31, эндонуклеазы рестрикции HindIII и SbfI («Сибэнзим», Россия) и необходимые олигонуклеотиды. При вырезании продуктов рестрикции из геля проводили очистку с помощью набора GeneJET Gel Extraction Kit («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США).
Результаты. В базе генетических данных GenBank было обнаружено 12 скаффолдов, содержащих последовательность гена U6 клещевины, — AASG02000063, AASG02000163, AASG02000719, AASG02001323, AASG02002949, AASG02003223, AASG02003842, AASG02006600, AASG02019053, AASG02021200, AASG02020516, AASG02025904. Однако характерные USE и ТАТА элементы были выявлены в промоторной области гена U6 только у шести из этих скаффолдов — AASG02021200, AASG02020516, AASG02006600, AASG02000719, AASG02025904, AASG02002949. Сравнение полученных результатов и результатов поиска промоторов гена U6, имеющих USE и TATA-элементы, в геномах других представителей семейства Euphorbiaceae показало, что их количество может быть разным. В геномах Jatropha curcas и Manihot esculentum (сорт W14) так же, как и у клещевины, имеется 6 таких промоторов, однако у Hevea brasiliensis и Euphorbia esula их больше (соответственно 9 и 23).
Последовательности скаффолдов AASG02021200, AASG02020516, AASG02006600, AASG02000719, AASG02025904, AASG02002949, а также одного скаффолда без USE и TATA-элементов AASG02000063 использовали для подбора праймеров (табл. 1) и последующей амплификации
фрагментов, содержащих up-stream область соответствующих генов U6 (рис. 1). Во всех случаях, кроме AASG02000063, амплифицировались единичные фрагменты ожидаемой длины (ампликоны Rc200, Rc516, Rc600, Rc719, Rc904 и Rc949). Поскольку в случае с AASG02000063 помимо целевого амплифицировались еще два дополнительных фрагмента, этот вариант up-stream области далее не изучался. Единичные фрагменты остальных вариантов были клонированы и секвенированы.
1. Праймеры, подобранные для амплификации промоторной области гена U6 у анализируемых скаффолдов клещевины (Ricinus communis L.)
Праймер Последовательность Скаффолд Ампликон Длина апли-кона, п.н.
RcU6-200f 5 -TGGATAAGAGGAGATTCTTGAATTG-3' AASG02021200 Rc200 392
RcU6-200r 5 -AGGGGCCATGCTAATCTTCT-3 '
RcU6-516f 5 -GTTGGCAGCCTTCAGATTTC-3 ' AASG02020516 Rc516 590
RcU6-516r 5 -AGGGGCCATGCTAATCTTCT-3 '
RcU6-600f 5 -CTCCGAATTATATTTGGGGTTTT-3 AASG02006600 Rc600 280
RcU6-600r 5 -AAAAATTTGGACCATTTCTCG-3 '
RcU6-719f 5 -ACCTGTGAGGTGGCTTTCTG-3 ' AASG02000719 Rc719 346
RcU6-719r 5 -CGGTGTCTGTTTGCCCTAAT-3 '
RcU6-904f 5 -AGCCCATTTTGGGGTGTTAT-3 ' AASG02025904 Rc904 512
RcU6-904r 5 -AGGGGCCATGCTAATCTTCT-3 '
RcU6-949f 5 -TTCTGGGAGGTATGCATCAA-3 ' AASG02002949 Rc949 401
RcU6-949r 5 -AAAAATTTGGACCATTTCTCG-3 '
RcU6-063f 5 -CAACCCGACTCCTTCATCAT-3 ' AASG02000063 Rc063 584
RcU6-063r 5 '-AGGGGCCCTACTTTGATACC-3 '
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов ПЦР-амплификации на матрице ДНК клещевины (Ricinus communis L.) сортов Занзибар Грин (1-7) и Гибзонская (8-14) при использовании праймеров, подобранными для амплификации промоторной области гена U6: 1 и 8 — Rc600f/Rc600r, 2 и 9 — Rc904f/Rc904r, 3 и 10 — Rc949f/Rc949r, 4 и 11 — Rc063f/Rc063r, 5 и 12 — Rc516f/Rc516r, 6 и 13 — Rc200f/Rc200r, 7 и 14 — Rc719f/Rc719r; М — маркер молекулярных масс с шагом 100 п.н. (100 bp DNA Ladder, M-214S, «Jena Biosience GmbH», Германия).
2. Степень гомологии (%) между шестью выбранными промоторами U6 генов клещевины (Ricinus communis L.)
Промотор Rc200ZG Rc516ZG Rc600ZG Rc719ZG Rc904ZG 1 Rc949ZG
Rc200ZG 100 56 53 77 57 50
Rc516ZG 100 63 57 67 62
Rc600ZG 100 54 63 54
Rc719ZG 100 53 51
Rc904ZG 100 59
Rc949ZG 100
Анализ последовательностей ампликонов, полученных у сортов Занзибар Грин (Rc200ZG, Rc516ZG, Rc600ZG, Rc719ZG, Rc904ZG, Rc949ZG) и Гибзонская (Rc200Gib, Rc516Gib, Rc600Gib, Rc719Gib, Rc904Gib, Rc949Gib), показал, что у этих сортов промоторные области полностью совпадали между собой, а также с соответствующими последовательностями в скаффолдах AASG02021200, AASG02020516, AASG02006600, AASG02000719, AASG02025904, AASG02002949. Однако вне промоторных областей, содержащих регулятор-ные элементы, было обнаружено два полиморфных сайта: G/А замена в положении -228 от начала гена U6 у ампликона Rc200Gib и Т/А замена в положении -351 от начала гена U6 у Rc904Gib. Очевидно, что изучаемые промо-торные области достаточно консервативны у сортов одного вида.
3. Нуклеотидные последовательности случайно выбранных промоторов у видов растений из разных семейств, использованные для оценки степени гомологии между ними и шестью промоторами U6 генов клещевины (Ricinus communis L.)
Шифр I Последовательность |GenBank acc. no.| Первый нуклеотид [Последний нуклеотид
abrusl 5' -GCCCCACATCGAACAGTATTATCAAAGCATGACACAATATATAGCAAAAGAAACACGCAGAGAGT-3' XM 027482675 708 644
arachisl 5' -GTACCACATCGAGTAGCATCATATAACTCTGACAATATATATAGCAGAGGGTGCAAAGAAGGCTC-3' XM 025790263 575 5ll
arachis2 5' -GTCCCACATCGCTTAGTATCAGACCACTCTGACAGAATATATATCAAAGGAAACACAAAAGGCTC-3' XR 0038l0923 ll7 l8l
arachis4 5' -GTCTCACATCGCCCGAGTTTTGAGAAACCAATAACTTATATATCAGAGGCGAAGCAAAGGCTC-3' XM 025845620 2l8 28l
bras_oll 5' -GTCCCACATCGCTCAGGTGAAGAGAAGGAGCTGCGTTTATATAGCGATGAAGTCACGAAAGTGATT-3' LR03l877 48l76336 48l7627l
bras_rapl 5' -CTCCCACATCGCTCAGCGAAGCAAAAGAAGCTCCTGTTTATATACTTTCAGAGTCAAGAAGATGATT-3' LR03l575 ll03l39 ll03205
bras_rap2 5' -CTCCCACATCGTTTATCAGAGAAGCAGAAGCCGAGTTTATATAGGGACGGAGTGACGAAGGAGATT-3' LR03l575 ll43l84 ll43ll9
cicerl 5' -GTCCCACATCGAATACATGTATCCCATTTTCCATATTTATATAACGCAGGTTAACCATGCAGTAT-3' CP039335 3048640l 30486452
cicer2 5' -GTCCCACATCGAATACATTTATCCCTTTTTCCGTATTTATATAACGCAGGTTAACCATGGAGTTT-3' CP039335 30494676 30494740
cicer3 5' -GTCCCACACCGAATCATCTATCATTTTTTTCGTCTTTATATAACCCATGTTAATCATTAGGTTT-3' CP039335 305l2524 305l2587
cicer4 5' -GTCCCACATCGTCTAAATATTCGAATATTTAATATTTATATACAATGTTCGAGCAGTATAGTAT-3' CP039333 l83l8744 l83l8807
cicer7 5' -GTCCCACACCGCGTACGCATAACATGTGTTCAGTGTTTATAATACCCTCGCACACATCATCAAC-3' CP039333 3l682334 3l682398
cicer8 5' -GTTCCACATCGTCTACATCTATCATTATTTACGTCTTTATATTCAACCGATGAGCCATAAGGCTT-3' CP039333 39009683 39009747
cichoriuml 5' -CGTCCCATACCGACCAGTAAAGTACTTCCCGTCGCCTTATATAGCGCAGCTCGGCGACTATCATC-3' MK455779 235 299
cichorium2 5' -GTCCCATACCGACCAGTAAAGTACTTCCCGTCGCCTTATATAGCGCAGCTCGGCGACTATCATC-3' MK455779 236 299
cichorium3 5' -TTCCCACATCGCTCTTTGAAGCAACATCGCCATGCTTTATATAGCTTGGCTTCCAAACATATATC-3' MK455773 235 299
cichorium4 5' -TTCCCACATCGATGATTGAAACGATTCCTCGGTGTTTTATATAGCCTGGCTTCCAATCAAATATC-3' MK455776 238 302
cichorium5 5' -CTCCCACATCGATGATCGGAACGGTTGTTTCGTGCTTTATATAGCTCGGGTTCCAACCATTTATC-3' MK455775 238 302
citrullusl 5' -GTCCCACATCGGTAAGTTTTGATTCTAGTTTACGCTTTATATAACTAAGACTGCAGTACAAGGCTT-3' V00L0l000005 2250542 2250477
cynaral 5' -AATCCCACATCGCCTTTAACGATATCCAGTGCTAGCTTTATATGGCGGAGGTCGGCAGCTAAGATC-3' XR 003069239 l 65
goss_raiml 5' -ATCCCATATCGCTAAAGAACTATAACACAGGAGCGTTTATATAAGCGAAAGAAGCAGCAAATGATT-3' CP032562 3l30l66 3l30l0l
goss_raim2 5' -ATCCCACATAGCTAAAGAATTAGGAAAATTTATTGTTTATAAAGGCAAAGGAAGAAACTTATTATT-3' CP032562 3328533 3328468
goss_raim3 5' -ATCCCGCATCGCTAAAGAATTGAAAAAATTTTATTGTTTATATAGGAAAAACAAGCTGACTATGATT-3' CP032562 335l5l8 335l452
goss_raim4 5' -ATCCCGCATCGCTAAAGAATTGAAAAAATTTTATTGTTTATATAGGAAAAACAAGCTGACTATGATT-3' CP032562 335l5l8 335l452
gossipioidesl 5' -ATCCCACATCGCTAAAGAACTAAAATGCCGAAGTATTTATATAAGCGAAAGAAACAGCATTAGTGT-3' CP032252 2333488 2333423
gossipioides2 5' -ATCCCACATTGCTAAAGAATTAACAAATACTATTGTTTATATAGGCAAAAGAAACACCGTAGCAGT-3' CP032252 234l665 234l600
gossipioides3 5' -ATCCCACATCTCTAAAGAATTAAAAAACACTATTGTTTATATGGGCAAAAGAAGCACCGTTGTATT-3' CP032252 2343934 2343869
ipomeal 5' -CTCCCACATCGGGCGATGAAGCAGCTCTCTTCCAGTACACATACTCCGCCATTGAAGAAGAAGAAC-3' CP025668 7620ll2 7620047
ipomea2 5' -CTCCCACATCGGCCAATGAGCCATCTTACTTCCAGTACATATACTCCGCCATGGAAGCTCTTATC-3' XR 004l004l7 33 97
ipomea3 5' -CTCCCACATCGGCTGATGAAACAACTTGCTTCCAGTATACATACTCTATCATGGAAGCACTGAGC-3' XM 03l272l6l l 65
ipomea4 5' -GTCCCACATCGGCCAATGAGCCATCTTACTTCCAGTACATATACTCCGCCATTGGAGCACTTAGC-3' CP025668 7980996 798l060
ipomea5 5' -TTCCCACATCGGGCGATGAAGCAGCTCTCTTCCATTACACATACTCCGCCATTGAGGAAGGAGAAT-3' CP025668 7984209 7984274
lotusl 5' -GTCCCACACCGGATAAACATACAGAAATATGAGTGTTTATAAGCAAATAGTCAGCAATAAGGTTC-3' AP0l0923 704ll 70347
lotus2 5' -GTTCCACATCGGCTATGTTGATTAAGATTTTATAGTTCATATATCACTACAGAACAGCAAGTATT-3' AP0l0923 684l7 68353
teal 5' -GTCCCACATCGAAACTTCGACGTTATAGACATGGAGTTTATAAGAAAGAAGAAAAGAGAAGACGTT-3' XR 003649l02 l50 2l5
tomatol 5' -CTCCCTCATCGCTTACAGAAAAAAGCTATATGCTGTTTATATTGCGAAATCTAACAGTGTAGTTT-3' XM 004230407 25 89
tomato2 5' -CTCCCTCATCGCTTACAGAAAAAAGCTATATGCTGTTTATATTGCGAATCTAACAGTGTAGTTT-3' X5l447 l98 26l
vignal 5' -GTCCCACATCGTCCAAACATGTCACAACTTCCATGTTTAAAAACGCACGCCTACTCGCTGCTGTT-3' CP039354 534966l3 53496677
vigna2 5' -GTCCCACACCGTATACTTTCACTAGAGGTTTAGTGTTTATATAGATACAGACTGCATCCAAGCTT-3' CP039350 33742544 33742608
Похожая ситуация наблюдается и у сортов маниока AM560-2 и KU50. Промоторные области генов U6 из их скаффолдов LTYI01019634 (нук-леотиды 16035-16336) и JPQF01078381 (нуклеотиды 1216-1517), а также LTYI01021841 (нуклеотиды 27091-27392) и JPQF01070438 (нуклеотиды 1655916860) полностью совпадают.
Сравнение секвенированных промоторов генов U6 клещевины между собой показало среднюю гомологию, варьирующую в пределах 51-77 % (табл. 2). Сравнение этих же промоторов со случайно выбранными промоторами генов U6 ряда других случайно выбранных видов растений из разных семейств демонстрировало сходные показатели степени гомологии — 42-64 % (табл. 3, 4).
4. Степень гомологии (%) между шестью выбранными промоторами U6 генов клещевины (Ricinus communis L.) и случайно выбранными промоторами U6 генов других видов растений из разных семейств
Ш ф ___Промотор___
фр Rc200ZG | Rc516ZG | Rc600ZG | Rc719ZG | Rc904ZG | Rc949ZG '
abrus1 48 53 56 46 60 62
arachis1 52 53 57 47 55 49
arachis2 54 57 57 51 56 58
arachis4 54 54 63 52 49 54
bras_ol1 53 54 57 48 52 53
bras_rap1 54 55 57 56 54 52
bras_rap2 45 54 54 46 52 54
cicer1 56 54 53 53 55 52
cicer2 58 52 53 57 55 49
cicer3 59 53 50 54 51 46
cicer4 50 56 59 53 56 55
cicer7 47 64 53 50 50 55
cicer8 51 57 58 54 55 55
cichorium1 42 47 55 45 47 50
cichorium2 43 48 55 46 48 51
cichorium3 55 53 50 52 49 52
cichorium4 49 48 50 51 50 45
cichorium5 55 51 54 55 47 44
citrullus1 57 60 59 58 56 59
cynara1 52 55 63 55 56 51
goss_raim1 48 62 57 51 61 59
goss_raim2 47 58 53 50 58 56
goss_raim3 51 61 50 52 65 63
goss_raim4 50 46 50 52 65 63
gossipioides1 49 55 57 54 62 58
gossipioides2 51 60 54 51 62 61
gossipioides3 52 60 57 52 60 60
ipomea1 42 52 47 46 44 47
ipomea2 48 58 52 44 50 49
ipomea3 46 58 54 43 52 52
ipomea4 50 58 51 48 48 49
ipomea5 45 52 47 43 47 47
lotus1 46 55 58 52 63 59
lotus2 59 59 62 59 56 58
tea1 57 53 56 58 57 58
tomato1 48 47 53 48 53 51
tomato2 48 47 53 47 52 50
vigna1 52 60 57 46 53 52
vigna2 55 66 56 53 61 55
Во многом выявленное сходство обеспечивалось наличием достаточно консервативных USE и ТАТА элементов, в то время как гомология остальных участков была низкой (рис. 2).
Анализ последовательностей USE у изученных промоторов показал, что у клещевины имеется несколько вариантов этого регуляторного элемента: вариант A (GAACCACATCG) из ампликонов AASG02021200ZG и AASG02021200Gib, вариант B (A-CCCACATCG) из ампликонов AASG02020516ZG и AASG02020516Gib, вариант D (AT-CCACATCG) из
ампликонов AASG02000719ZG и AASG02000719Gib. В остальных трех случаях мотивы USE (С, Е и F, см. рис. 2) соответствовали консенсусной последовательности RTCCCACATCG арабидопсиса.
Рис. 2. Выравнивание вариантов промоторов гена U6 клещевины (Ricinus communis L.): А —
промотор из ампликонов AASG02021200ZG и AASG02021200Gib, B — из ампликонов AASG02020516ZG и AASG02020516Gib, С — из ампликонов AASG02006600ZG и AASG02006600Gib, D — из ампликонов AASG02000719ZG и AASG02000719Gib, Е — из ампликонов AASG02025904ZG и AASG02025904Gib, F — из ампликонов AASG02002949ZG и AASG02002949Gib. Красным цветом выделены варианты USE, которые совпадают с консенсусной последовательностью RTCCCACATCG арабидопсиса. Зеленым цветом выделена часть гена U6, которая амплифи-цируется с праймера Oligo3 (14).
На основании найденных промоторов генов U6 клещевины были созданы векторные конструкции для проведения CRISPR/Cas9 редактирования гена рицина.
При конструировании CRISPR/Cas9 векторов использовали плаз-миду pRGE31, содержащую ген Cas9 под CaMV 35S промотором, а также конструкцию для синтеза гидовой РНК: U3 промотор риса (OsU3), мотив из двух разнонаправленных сайтов эндонуклеазы рестрикции Bso31I (для встраивания сайта-мишени после гидролиза плазмиды этим ферментом, 2xBso31I) и последовательность, кодирующую часть гидовой РНК, которая взаимодействует с белком Cas9 (gRNAgene).
В первую очередь вели поиск сайтов для эндонуклеаз рестрикции в исходной плазмиде pRGE31 с таким расчетом, чтобы один сайт находился перед началом промотора U3, а второй — после него. В то же время оба сайта должны были отсутствовать внутри конструкции, которой предстояло лигироваться с pRGE31. В итоге были выбраны сайты HindIII и SbfI. Поскольку участок между ними полностью вмещал в себя конструкцию OsU3-2xBso31I-gRNAgene, то необходимо было синтезировать последовательность вставки, включающую 2xBso31I-gRNAgene под соответствующим промотором клещевины.
5. Олигонуклеотиды, использованные при создании и тестировании CRISPR/Cas9 векторов с промоторами гена U6 клещевины (Ricinus communis L.)
Праймер
Последовательность праймера
Олигонуклеотиды для синтеза двуцепочечных конструкций Ксиб(п)-2хВ8о311-§КХА§епе
5'-аллсслслтсалттсаттатластттттлаллттстттлтлталлттлаааслллсластааттаааалалссалаатстсааттттлаластлалллтлас-з'
5'-ллссслслтсатстлаттлсаслтллстттлалатттлтлллсасстлслласлласлсслтастаалалссалаатстсааттттлаластлалллтлас-з'
5'-атссслслтсатстааттлсаталалстллталтссттлтлтаслллсааалаасласлталтастаалалссалаатстсааттттлаластлалллтлас-з'
5'-ллтсслслтсааттлтттатсаатстттлаллатстттлтлталлттлаааслллслалслссаттаалалссалаатстсааттттлаластлалллтлас-з'
5'-лтссслслтсатттлаттлслтллллтлттлалстттлтллаллллтслластласттсталлатаалалссалаатстсааттттлаластлалллтлас-з'
5'-лтссслслтсалсллааллтлслллтттллллсаатттлтллатлллслллллсалслтастлстаалалссалаатстсааттттлаластлалллтлас-з'
5'-ллллслллллласлссалстсаатасслстттттсллатталтллсаалстлассттлттттллсттастлтттстластстллллс-з'
Олигонуклеотиды для введения в Ксиб(п)-2хВ8оз11-§КХл5епе сайтов рестрикции
5'-лластталлсслслтсалттс-з'
forward-A forward-B forward-C forward-D forward-E forward-F reverse
HindIII-A HindIII-B HindIII-C HindIII-D HindIII-E HindIII-F SbfI-reverse
35Spr-F Amp-R pBR322ori-F
5'-AAGCTTAACCCACATCGTCTA-3' 5'-AAGCTTGTCCCACATCGTCTG-3' 5'-AAGCTTAATCCACATCGGTTA-3' 5'-AAGCTTATCCCACATCGTTTA-3' 5'-AAGCTTATCCCACATCGACAA-3' 5'-CCTGCAGGAAAACAAAAAAGCAC-3'
5'-CTATCCTTCGCAAGACCCTTC-3' 5'-ATAATACCGCGCCACATAGC-3' 5'-GGGAAACGCCTGGTATCTTT-3'
Олигонуклеотиды для проверки векторов
Для этого были синтезированы 6 олигонуклеотидов (forward-n), содержащих RcU6(n)-2xBso31I-(20bp)gRNAgene, где n — соответствующий вариант промотора U6 клещевины, (20bp)gRNAgene — первые 20 нуклеоти-дов, кодирующие начало части гидовой РНК, которая взаимодействует с белком Cas9 (табл. 5). Кроме того, был синтезирован олигонуклеотид, обратный gRNAgene (reverse). После одного цикла ПЦР (5 мин при 95 °C, 30 с при 50 °C, 10 мин при 72 °C) для каждого из олигонуклеотидов forward c олигонуклеотидом reverse были получены двуцепочечные последовательности RcU6(n)-2xBso31I-gRNAgene. Такой подход был выбран как более экономичный по сравнению с полным синтезом прямых и обратных конструкций RcU6(n)-2xBso31I-gRNAgene. К тому же он позволял осуществлять экономичный синтез конструкций с любым другим промотором при замене только прямого олигонуклеотида.
Введение в последовательность вставки сайтов рестрикции HindIII и SbfI осуществляли с помощью ПЦР. Амплификацию проводили с прайме-рами, подобранными на бордеры конструкций RcU6(n)-2xBso31I-gRNAgene и имеющими соответствующие сайты рестрикции в 5'-области (см. табл. 5). Продукты ПЦР очищали, клонировали в АТ-векторе pAL2-T и секвени-ровали для проверки на отсутствие ошибок синтеза. После обработки плазмиды pRGE31 и плазмид pAL2-T c конструкциями RcU6(n)-2xBso31I-gRNAgene эднонуклеазами рестрикции HindIII и SbfI продукты разделяли с помощью электрофореза и вырезали целевые фрагменты. Очищенные фрагменты лигировали и использовали для трансформации компетентных клеток Escherichia coli. Отбор клонов проводили методом ПЦР с праймерами, подобранными на бордеры конструкций RcU6(n)-2xBso31I-gRNAgene. Выделенные из отобранных клонов плазмиды тестировали с помощью эн-донуклеаз рестрикции HindIII (линеризует целевую плазмиду) и Bso31I (не расщепляет целевую плазмиду), после чего секвенировали с использованием праймеров на вставку (SbfI-reverse) и на ключевые регионы — ген Cas9 (35Spr-F), ген устойчивости к ампициллину (Amp-R), ori (pBR322ori-F) (см. табл. 5).
В дальнейших экспериментах созданные векторные конструкции будут сравниваться по эффективности между собой и с векторами, содержащими промотор гена U6 арабидопсиса. Проведение таких экспериментов целесообразно, поскольку на картофеле, например, было показано увеличение выхода мутантных форм при замене промотора для гена направляющей РНК с AtU6 (U6 промотор Arabidopsis thaliana, GenBank accession no. X52527.1) на StU6 (U6 промотор Solanum tuberosum, GenBank accession no. Z17290.1) в 2 раза (9).
К таким же выводам пришли L. Long с соавт. (11) в работе по оптимизации технологии CRISPR/Cas9 геномного редактирования хлопка. Экспрессия гидовой РНК при включении в векторную конструкцию CRISPR/Cas9 эндогенного промотора хлопка GhU6.3 (U6 промотор Gossypium hirsutum) вместо промотора AtU6-29 (U6 промотор Arabidopsis thaliana) увеличивалась в 6-7 раз. В результате эффективность внесения мутаций системой CRISPR/Cas9 повышалась в 4-6 раз (11). В свою очередь, X. Sun с соавт. (10) получили схожие результаты при сравнении эндогенных и экзогенных промоторов в кассетах CRISPR/Cas9 для редактирования генома сои. Установлено, что степень экспрессии гидовой РНК под эндогенным промотором GmU6 (U6 промотор Glycine max) была в 2 раза выше, чем под экзогенным промотором AtU6-26 (U6 промотор Arabidopsis thaliana). Эффективность редактирования генов в первом случае варьировала в пределах 14,7-20,2 %, во втором — 3,2-9,7 % (10). Приведенные результаты,
полученные при редактировании у неродственных видов растений из разных семейств, наглядно демонстрируют преимущества использования эндогенных промоторов в векторах CRISPR/Cas9. Однако важны сравнения не только эндогенных промоторов с экзогенными, но и эндогенных промоторов друг с другом. В нашей работе были найдены различные промоторы U6 клещевины, которые имеют необходимые для нормального функционирования регуляторные элементы USE и ТАТА, и целесообразно будет провести их сравнение между собой в экспериментах по редактированию у клещевины, так как ранее отмечалось, что не все эндогенные промоторы одинаково эффективны в управлении экспрессией генов (27-30).
Таким образом, в геноме клещевины имеется шесть промоторов генов U6 с регуляторными элементами USE и ТАТА. Секвенирование найденных промоторов у сортов Занзибар Грин и Гибзонская показало их высокую консервативность. Между собой эти промоторы имеют средний уровень гомологии, как и с промоторами других видов. В найденных промоторах были обнаружены USE-элементы, которые как соответствуют (у трех промоторов), так и не соответствуют (у трех других промоторов) консенсусной последовательности USE-элемента арабидопсиса. Сконструированные на основе найденных промоторов U6 клещевины CRISPR/Cas9 станут ценными инструментами для дальнейших экспериментов по геномному редактированию генома этого вида и определению эффективности различных промоторов для синтеза направляющей РНК.
ЛИТЕРАТУРА
1. Мошкин В.А. Клещевина. М., 1980.
2. Азнаурьян М.П., Елошвили Н.Г., Назаров Н.В., Якубович H.H., Мещеряков C.B., Гир-син Ю.А. Использование отходов масложирового производства для приготовления пластичных смазок. Известия вузов, Пищевая технология, 1993, 1-2(212-213): 87-89.
3. Naughton F.C. Production, chemistry and commercial applications of various chemicals from castor oil. Journal of the American Oil Chemists' Society, 1974, 51(3): 65-71 (doi: 10.1007/BF00000015).
4. Шульпекова Ю.О. Запор и методы его лечения. Приложение РМЖ «Болезни органов пищеварения», 2006, 8(2): 90-96.
5. Anandan S., Kumar G.K.A., Ghosh J., Ramachandra K.S. Effect of different physical and chemical treatments on detoxification of ricin in castor cake. Animal Feed Science and Technology, 2005, 120(1-2): 159-168 (doi: 10.1016/j.anifeedsci.2004.10.002).
6. Гусынин И.А. Токсикология ядовитых растений. М., 1962.
7. Ishino Y., Krupovic M., Forterre P. History of CRISPR-Cas from encounter with a mysterious repeated sequence to genome editing technology. Journal of Bacteriology, 2018, 200(7): e00580-17 (doi: 10.1128/JB.00580-17).
8. Злобин Н.Е., Терновой В.В., Гребенкина Н.А., Таранов В.В. Сделать сложное проще: современный инструментарий для редактирования генома растений. Вавиловский журнал генетики и селекции, 2017, 21(1): 104-111 (doi: 10.18699/VJ17.228).
9. Andersson M., Turesson H., Nicolia A., Falt A.S., Samuelsson M., Hofvander P. Efficient targeted multiallelic mutagenesis in tetraploid potato (Solanum tuberosum) by transient CRISPR-Cas9 expression in protoplasts. Plant Cell Reports, 2017, 36(1): 117-128 (doi: 10.1007/s00299-016-2062-3).
10. Sun X., Hu Z., Chen R., Jiang Q., Song G., Zhang H., Xi Y. Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system. Scientific Reports, 2015, 5: 10342 (doi: 10.1038/srep10342).
11. Long L., Guo D.D., Gao W., Yang W.W., Hou L.P., Ma X.N., Miao Y.C., Botella J.R., Song C.P. Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing in cotton by improved sgRNA expression. Plant Methods, 2018, 14: 85 (doi: 10.1186/s13007-018-0353-0).
12. Yan P.U., Chao L.I.U., JiYang L.I., TaShi А., Yan H.U., XiaoDong L.I.U. Different SlU6 promoters cloning and establishment of CRISPR/Cas9 mediated gene editing system in tomato. Scientia Agricultura Sinica, 51(2): 315-326.
13. Bernard G., Gagneul D., Dos Santos H.A., Etienne A., Hilbert J.-L., Rambaud C. Efficient genome editing using CRISPR/Cas9 technology in chicory. International Journal of Molecular Sciences, 2019, 20(5): 1155 (doi: 10.3390/ijms20051155).
14. Marshallsay C., Kiss T., Filipowicz W. Amplification of plant U3 and U6 snRNA gene sequences
using primers specific for an upstream promoter element and conserved intragenic regions. Nucleic Acids Research, l990, l8(l2): 3459-3466 (doi: l0.l093/nar/l8.l2.3459).
15. Chan A.P., Crabtree J., Zhao Q., Lorenzi H., Orvis J., Puiu D., Melake-Berhan A., Jones K.M., Redman J., Chen G., Cahoon E.B., Gedil M., Stanke M., Haas B.J., Wortman J.R., Fraser-Liggett C.M., Ravel J., Rabinowicz P.D. Draft genome sequence of the oilseed species Ricinus communis. Nature Biotechnology, 20l0, 28: 95l-956 (doi: l0.l038/nbt.l674).
16. Horvath D.P., Patel S., Dogramaci M., Chao W.S., Anderson J.V., Foley M.E., Scheffler B., Lazo G., Dorn K., Yan C., Childers A., Schatz M., Marcus S. Gene space and transcriptome assemblies of leafy spurge (Euphorbia esula) identify promoter sequences, repetitive elements, high-quality markers, and a full-length chloroplast genome. Weed Science, 20l8, 66(3): 355-367 (doi: l0.l0l7/wsc.20l8.2).
17. Rahman A.Y., Usharraj A.O., Misra B.B., Thottathil G.P., Jayasekaran K., Feng Y., Hou S., Ong S.Y., Ng F.L., Lee L.S., Tan H.S., Sakaff M.K., Teh B.S., Khoo B.F., Badai S.S., Aziz N.A., Yuryev A., Knudsen B., Dionne-Laporte A., Mchunu N.P., Yu Q., Langston B.J., Freitas T.A., Young A.G., Chen R., Wang L., Najimudin N., Saito J.A., Alam M. Draft genome sequence of the rubber tree Hevea brasiliensis. BMC Genomics, 20l3, l4: 75 (doi: l0.ll86/l47l-2l64-l4-75).
18. Wang W., Feng B., Xiao J., Xia Z., Zhou X., Li P., Zhang W., Wang Y., Meller B.L., Zhang P., Luo M.C., Xiao G., Liu J., Yang J., Chen S., Rabinowicz P.D., Chen X., Zhang H.B., Ce-ballos H., Lou Q., Zou M., Carvalho L.J., Zeng C., Xia J., Sun S., Fu Y., Wang H., Lu C., Ruan M., Zhou S., Wu Z., Liu H., Kannangara R.M., Jergensen K., Neale R.L., Bonde M., Heinz N., Zhu W., Wang S., Zhang Y., Pan K., Wen M., Ma P.A., Li Z., Hu M., Liao W., Hu W., Zhang S., Pei J., Guo A., Guo J., Zhang J., Zhang Z., Ye J., Ou W., Ma Y., Liu X., Tallon L.J., Galens K., Ott S., Huang J., Xue J., An F., Yao Q., Lu X., Fregene M., Lopez-Lavalle L.A., Wu J., You F.M., Chen M., Hu S., Wu G., Zhong S., Ling P., Chen Y., Wang Q., Liu G., Liu B., Li K., Peng M. Cassava genome from a wild ancestor to cultivated varieties. Nature Communications, 20l4, 5: 5ll0 (doi: l0.l038/ncomms6ll0).
19. Wu P., Zhou C., Cheng S., Wu Z., Lu W., Han J., Chen Y., Chen Y., Ni P., Wang Y., Xu X., Huang Y., Song C., Wang Z., Shi N., Zhang X., Fang X., Yang Q., Jiang H., Chen Y., Li M., Wang Y., Chen F., Wang J., Wu G. Integrated genome sequence and linkage map of physic nut (Jatropha curcas L.), a biodiesel plant. Plant Journal, 20l5, 8l(5): 8l0-82l (doi: l0.ll ll/tpj. l276l).
20. Halling K.C., Halling A.C., Murray E.E., Ladin B.F., Houston L.L., Weaver R.F. Genomic cloning and characterization of a ricin gene from Ricinus communis. Nucleic Acids Research, l985, l3(22): 80l9-8033 (doi: l0.l093/nar/l3.22.80l9).
21. Tregear J.W., Roberts L.M. The lectin gene family of Ricinus communis: cloning of a functional ricin gene and three lectin pseudogenes. Plant Molecular Biology, l992, l8(3): 5l5-525 (doi: l0.l007/BF00040667).
22. Ladin B.F., Murray E.E., Halling A.C., Halling K.C., Tilakaratne N., Long G.L., Houston L.L., Weaver R.F. Characterization of a cDNA encoding ricin E, a hybrid ricin-Ricinus communis agglutinin gene from the castor plant Ricinus communis. Plant Molecular Biology, l987, 9(3): 287295 (doi: l0.l007/BF00l66464).
23. Alexandrov O. Study of the upstream ricin gene sequences in different castor (Ricinus communis) varieties as a preliminary step in CRISPR/Cas9 editing. Research on Crops, 2020, 2l(2): 344-348 (doi: l0.3l830/2348-7542.2020.058).
24. Александров О.С. Биоинформатический анализ гена рицина Ricinus communis L. и поиск участков-мишеней для его редактирования с помощью технологии CRISPR/Cas9. Актуальная биотехнология, 20l8, 3(26): l6l-l62.
25. Doyle J.J., Doyle J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, l990, l2(l): l3-l5.
26. Razumova O.V., Alexandrov O.S., Divashuk M.G., Sukhorada T.I., Karlov G.I. Molecular cytogenetic analysis of monoecious hemp (Cannabis sativa L.) cultivars reveals its karyotype variations and sex chromosomes constitution. Protoplasma, 20l6, 253(3): 895-90l (doi: 10.1007/s00709-0l5-085l-0).
27. Wang M.B., Helliwell C.A., Wu L.M., Waterhouse P.M., Peacock W.J., Dennis E.S. Hairpin RNAs derived from RNA polymerase II and polymerase III promoter-directed transgenes are processed differently in plants. RNA, 2008, 14(5): 903-913 (doi: l0.l26l/rna.760908).
28. Mikami M., Toki S., Endo M. Comparison of CRISPR/Cas9 expression constructs for efficient targeted mutagenesis in rice. Plant Molecular Biology, 2015, 88(6): 561-572 (doi: 10.1007/s11103-015-0342-x).
29. Domitrovich A.M., Kunkel G.R. Multiple, dispersed human U6 small nuclear RNA genes with varied transcriptional efficiencies. Nucleic Acids Research, 2003, 3l(9): 2344-2352 (doi: l0.l093/nar/gkg33l).
30. Wang P., Zhang J., Sun L., Ma Y., Xu J., Liang S., Deng J., Tan J., Zhang Q., Tu L., Daniell H., Jin S., Zhang X. High efficient multisites genome editing in allotetraploid cotton (Gossypium hirsutum) using CRISPR/Cas9 system. Plant Biotechnology Journal, 2018, 16(1): 137-150 (doi: l0.llll/pbi.l2755).
ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной Поступила в редакцию
биотехнологии, 13 июля 2020 года
127550 Россия, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42, e-mail: [email protected] Н, [email protected]
Sel'skokhozyaistvennaya biologiya [Agricultural Biology], 2021, V. 56, № 1, pp. 20-31
SEQUENCING OF THE U6 PROMOTERS IN CASTOR BEANS AND VECTOR CONSTRUCTION FOR CRISPR/Cas9 GENOMIC EDITING ON THEIR BASIS
O.S. Alexandrov Н, G.I. Karlov
All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechnology, 42, ul. Timiryazevskaya, Moscow, 127550 Russia, e-mail
[email protected] (Н corresponding author), [email protected]
ORCID:
Alexandrov O.S. orcid.org/0000-0002-7146-4094 Karlov G.I. orcid.org/0000-0002-9016-103X
The authors declare no conflict of interests
Acknowledgements:
Supported by the Russian Science Foundation, Agreement No. 17-74-10233 dated July 21, 2017 on the scientific project "Adaptation of the CRISPR/Cas9 genomic editing technology elements to improve a castor bean (Ricinus communis L.) genome"
Received July 13, 2020 doi: 10.15389/agrobiology.2021.1.20eng
Abstract
Castor bean is an important crop in many countries. It is mainly used to obtain the castor oil, which is widely applied in various industries. The rich protein cakes and meals are remains after the oil is pressed. They are promising for use as protein additives in the fodder production. However, it is limited due to the presence of toxins. These are ricin protein and ricinine alkaloid. One of such methods can be genomic editing using the CRISPR/Cas9 system. The technology consists in cutting the target region of the intact DNA by the Cas9 enzyme with the assistance of a short guide RNA fragment. The delivery of the Cas9 and guide RNA genes into the cell of the edited plant is often carried out by plasmid vectors. For efficient synthesis of the guide RNA in such vectors, the promoters of small nuclear RNA genes are usually used. In dicotyledonous plants editing, the promoter of the Arabidopsis U6 gene is most often used. In this work, the amplification, sequencing and analysis of the castor bean U6 promoters were carried out at the first time. The obtained sequences were analyzed and used in the construction of CRISPR/Cas9 vectors for the ricin gene editing. Our aim was to study castor bean U6 promoters with help by bioinformatics and molecular genetic approaches. Zanzibar Green and Gibzonskaya varieties of castor bean plants were used in this work. DNA was isolated from young leaves. The preparation of sequences, alignments and homology level calculation were carried out by GenDoc program (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/index.html). Primers for amplification of castor bean U6 promoters were designed by Primer3 program (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). PCR was performed using a C-100 PCR machine (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). PCR products were separated in 1.5 % agarose gel at 6 B/cm in the Sub-Cell GT electrophoresis camera (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). The amplicons were purified with the GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Fisher Scientific, Inc., USA). The purified amplicons were cloned into the pAL2-T vector (Evrogen, Russia) according to protocol of manufacturer. In the CRISPR/Cas9 vector construction, the pRGE31, HindIII and SbfI restriction enzymes (Sibenzyme, Russia) and nucleotides were used. Purification of the digested products was carried out with the GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific, Inc., USA). Bioinformatic search were conducted in the GenBank base, and 12 scaffolds with the castor bean U6 gene were found. Six promoters with intact USE and TATA-box elements of regulation were used in the primer design for amplification with cv. Zanzibar Green and cv. Gibzonskaya DNA matrices. One fragment PCR products were cloned and sequenced. The analysis of the obtained amplicon sequences reveled that promoter regions of two studied varieties were similar. The level of promoter identity from different amplicons ranged within 51-77 %. In comparison of these promoters with ones from other plants, the level of homology was 42-64 %. The promoter sequences with intact USE and TATA-box motifs were used in construction of the CRISPR/Cas9 vectors which can be used for efficient editing of the castor bean genes involved in the ricin and ricinine synthesis.
Keywords: castor beans, promoter, U6 gene, sequencing, genome editing, CRISPR/Cas9, vector construction.
