CC BY
21УДК 575.113:577.633
О.В. Дубровная, И.И. Лялько, А.В. Бавол, С.С. Воронова, А.Н. Гончарук
анализ мейоза у трансгенных растений пшеницы,
полученных методом agrobacterium-опосредованной
трансформации в культуре IN VITRO и IN PLANTA
Институт физиологии растений и генетики Национальной академии наук Украины 03022, Украина, г. Киев, ул. Васильковская, 31/17; e-mail: [email protected]
Исследовано прохождение мейоза у генетически модифицированных растений пшеницы сорта Зимоярка, полученных при Аgrobacterium-опосредованной трансформации в культуре in vitro и методом in planta. Выявлено, что трансгенные формы характеризируются большей частотой нарушений мейоза по сравнению с не-трансгенными растениями. В результате сравнительного анализа течения мейоза установлено, что у трансгенных линий, полученных при использованиии штамма AGLO с векторной конструкцией pBi2E, процент клеток с нарушениями на стадии метафазы 1 был значительно ниже, а мейотический индекс соответственно выше, чем у линий, полученных при использовании штамма AGLO с векторной конструкцией pBi-ОАТ. Показано, что наибольшее количество клеток с нарушениями - у трансгенных растений линий с пониженной фертиль-ностью пыльцы и низкой семенной продуктивностью.
Ключевые слова: Triticum aestivum L., Agrobacterium-опосредованная трансформация, мейоз.
Введение
В последние десятилетия наблюдается широкое использование различных подходов для создания генетически модифицированных растений пшеницы, одним из которых является Agrobacteium-опосредованная трансформация. Данный метод позволяет вводить в геном реципиента ограниченное число копий генов и обеспечивает передачу относительно больших генетических конструкций с минимальными перестройками в кодирующих последовательностях переносимых генов [1, 2].
Основные способы получения генетически модифицированных растений при использовании метода Agrobacterium-опосредованной трансформации основаны на переносе Т-ДНК в культивируемые in vitro клетки с последующей регенерацией трансформированных побегов [3]. Однако при Agrobacteium-опосредованной трансформации в культуре in vitro могут возникать генетические и эпигенетические изменения генома [4, 5]. Установлено, что встраивание Т-ДНК может приводить к появлению всего спектра мутаций, описанных классической генетикой, - от точечных мутаций до значительных хромосомных перестроек, таких, как транслокации, инверсии, дупликации, и даже к изменению
уровня плоидности [6-8]. Кроме того, стрессы, связанные с различными аспектами трансформации растений, такие, как использование антибиотиков и инфекция Agrobacterium, также могут вызвать генетические и / или эпигенетические изменения в геноме [9]. В связи с этим, была начата разработка других подходов, позволяющих избежать культивирования in vitro и возможной сомаклональной изменчивости, в частности, метод in planta [10]. Этот метод успешно используется у различных злаковых культур, в том числе и пшеницы [11, 12].
Известно, что при трансгенезе инсерция Т-ДНК в функционально значимые области генома может негативно влиять на мейоз и фертильность пыльцы, а также на репродуктивные функции растений-трансформантов [13-17]. Описаны мутации, происходящие на различных стадиях микро- и макроспороге-неза, а также гаметогенеза [18]. Нарушения нормального течения мейоза у растений проявляются в изменениях синапсиса, замене первого мейотического деления на митоти-ческое, преждевременном цитокинезе, изменении конденсации хроматина, слипании и фрагментации хромосом, неспособности хромосом к конъюгации, в образовании различного количества унивалентов, неодновре-
менном и неравномерном расхождении хромосом к полюсам, формировании диад и тетрад с микроядрами, появлению полиад [16-19]. Наблюдаются также аномалии мейоза, связанные с аппаратом веретена деления [13]. В зависимости от встраивания Т-ДНК, инсерции могут стать причиной эмбриолетальности, мужской стерильности, а также часто приводят к снижению семенной продуктивности и стерильности растений [20]. В связи с этим, целью нашей работы был сравнительный анализ протекания мейоза у генетически модифицированных растений пшеницы, полученных методом Agrobacterium-опосредованной трансформации как клеток каллусных культур in vitro [21], так и методом in planta [22, 23].
Материалы и методы
В исследованиях использовали растения мягкой пшеницы сорта Зимоярка (оригинатор - Институт физиологии растений и генетики НАН Украины). Agrobacterium-опосредованную трансформацию проводили с использованием штамма AGLO и двух векторных конструкций, одна из которых несет ген синтеза, а другая - катаболизма пролина [21-23]. Векторная конструкция pBi2E содержит двухцепочечный РНК-супрессор гена пролиндегидрогеназы (pdh) и ген nptlI - неомицинфосфотрансфера-зы II E. coli. Другая конструкция содержит бинарный вектор pBi-ОАТ с целевым геном ор-нитинаминотрансферазы Medicago truncatula, а также селективный ген неомицинфосфо-трансферазы II (nptll) E. coli. Обе конструкции любезно предоставлены д.б.н. А.В. Кочетовым (Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск). Трансгенный статус регенерантов подтверждали методом ПЦР.
Материалом исследований служили трансгенные линии пшеницы сорта Зимоярка, полученные при Agrobacterium-опосредованной трансформации in planta: Зимоярка 32р, 74р, 86р - с использованием векторной конструкции pBi2E, линии Зимоярка 93р, 126р, 134р - с использованием векторной конструкции pBi-ОАТ. Трансгенные линии Зимоярка 1, 11, 43, 59 получены методом Agrobacterium-опосредованной трансформации в культуре in vitro с использованием векторной конструкции pBi2E, тогда как линии Зимоярка 154, 161, 169, 175 получены с использованием векторной конструкции
pBi-ОАТ. Все исследуемые растения в поколении Т0 имели нормальный хромосомный набор (2n = 6х = 42) и были фертильными.
Цитологический анализ мейоза проводили на материнских клетках пыльцы (МКП) на временных давленых препаратах пыльников, окрашенных 2%-ным ацетокармином, приготовленных по общепринятой методике [24]. Для каждого варианта брали по 3-4 колоса, еще не вышедших из трубки. Анализировали все пыльники, МКП которых находились на стадиях профазы 1 (П1), метафазы 1 и 2 (М1, М2), анафазы 1 и 2 (А1, А2) и формирования тетрад. В диакинезе и метафазе 1 изучали по 15-20 четких метафазных пластинок на препарат, а на стадиях ана/телофаз - не меньше 50 клеток на колос. На последней стадии мейоза анализировали по 150-200 тетрад на одно растение, определяли мейотический индекс (количество МКП без нарушений на данной стадии), который является четким показателем как нормального прохождения мейоза, так и окончательным показателем уровня цитологической стабильности генотипов [25, 26]. В качестве контроля использовали растения исходного сорта Зимоярка (К1) и нетрансгенные растения Rj того же сорта, полученные в культуре in vitro (К2). Препараты анализировали с помощью микроскопа Amplival (Zeiss) с увеличением 15 х 40 и 15 х 100. Фертильность пыльцы определяли по стандартной методике [24].
Результаты и обсуждение
Цитологический анализ микроспорогенеза у контрольных растений сорта Зимоярка показал, что мейоз проходил практически без нарушений. Хромосомные ассоциации в мета-фазе мейоза 1 (М1) представлены, в основном, закрытыми бивалентами (21зп). У нетранс-генных растений Rj только в единичных клетках отмечены открытые биваленты (20Зп+1пО; 19пЗ+2пО). Все биваленты были расположены на экваторе микроспороцитов, а их центромеры ориентированы к полюсам веретена деления. Клеток с унивалентами у растений сорта не наблюдали, а у нетрансгенных растений Rj отмечена лишь одна клетка с унивалентами (20ПЗ + 21), что соответствует нормальному течению мейоза. На стадиях ана-телофаз обоих мейотических делений только в отдельных клетках отмечали присутствие еди-
ничных фрагментов, частота которых у сорта составляла 0,5%, а у нетрансгенных растений Rj была на уровне 1,7%, что в 3 раза выше по сравнению с растениями сорта, однако не превышает нормы для цитологически стабильных форм. Формирование нормальных тетрад происходило в гнездах пыльников синхронно, количество клеток с микроядрами не превышало 1,5%. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что мейоз у контрольных растений происходит без нарушений и они являются цитологически стабильными.
При изучении характера микроспорогенеза у трансгенных растений пшеницы, полученных как методом in vitro, так и методом in planta, наблюдали, в основном, однотипные отклонения от нормы. Установлено, что у всех линий формировались бивалентные ассоциации хромосом, представленные в основном закрытыми бивалентами (2111), что свидетельствует о высокой интенсивности конъюгации гомологичных хромосом. Практически у всех проанализированных растений встречалось от 1-го до 3-х открытых бивалентов: 2011З+11О
или 19пЗ+2пО (рис., б), появление которых свидетельствует о десинапсисе (ослаблении конъюгации), однако показано, что он не имеет негативного влияния на прохождение мейоза [25]. Мультивалентные ассоциации хромосом в наших исследованиях не обнаружены.
Основным типом нарушений на стадии М1 является асинапсис (отсутствие конъюгации) между гомологичными хромосомами, на что указывает наличие унивалентных хромосом. Асинапсис приводит к аномалиям мейоза на последующих стадиях [8]. Отсутствие конъюгации и образование разного количества унивалентов объясняется мутациями в генах, контролирующих синапсис [26]. В наших исследованиях наблюдались в основном микроспороциты с двумя унивалентами (2011 + 21), только у линий Зимоярка 169 и 126р отмечены единичные клетки с четырьмя (рис., г) и тремя унивалентами (1911+41, 2011+31) соответственно. Наличие трех унивалентов свидетельствует о присутствии в данном кариотипе анеуплоидных клеток. Считается, что одной из причин возникновения таких клеток может быть цитомиксис [13].
»
1
& *
% Щ * *
- t' Г, 1 'ijj 1 , % fi * \ »f Л Ш %Г ^Г*
ЛГ Л в */ № 4 ♦к % 4 4» О •*
Рисунок. Нарушения мейоза в клетках генетически модифицированных растений пшеницы: а - анафаза 1 с выбросом хромосомы; б - открытые биваленты; в - метафаза 2 с выбросом хромосом; г - наличие 4-х унивалентов; д - анафаза 2 с асинхронным делением; е - множественные нарушения в анафазе 1 (мост, выброс хромосом и отстающая хромосома); ж - тетрада с отсутствующей микроспорой; и - тетрада с микроядром; к - тетрада с двумя отсутствующими микроспорами; л - триада; м - пентада; н - клампинг хромосом
б
а
в
г
к
л
м
н
Как правило, унивалентные хромосомы располагались за пределами метафазной пластинки и не принимали участия в ее формировании. Такие хромосомы оставались в цитоплазме (рис., а), а на стадии телофазы образовывали микроядра. Другим нарушением на стадиях метафазы 1 и 2 было наличие клеток с выбросом хромосом (рис., в). В мейоцитах, которые имеют униваленты, в основном происходит случайное расхождение хромосом в анафазе 1, что в дальнейшем может приводить к образованию неполноценных гамет. Количество клеток с унивалента-ми составляло от 3,8 до 22,4% у линий, полученных при Agrobacterium-опосредованной трансформации in planta и от 6,7 до 20,4% у линий, полученных при трансформации in vitro.
Нарушения, наблюдавшиеся на стадии А1, представлены отставшими хромосомами, фрагментами, мостами, выбросом хромосом (табл. 1). Количество таких клеток колебалось в пределах от 2,0 до 17,4% у линий, полученных при Agrobacterium-опосредованной трансформации in vitro, и в пределах от 4,8 до 18,7% у линий, полученных при трансформации in planta. Однако следует отметить, что среди исследуемых линий нами обнаружена одна (Зимоярка 126р) со значительными системными нарушениями мейоза, которая характеризовалась высоким уровнем аномалий мейоза (18,7%). При цитологическом исследовании в поле зрения микроскопа часто выявляли клетки с множественными нарушениями (рис., е), а также наблюдали (одновременно) сразу несколько клеток с нарушениями.
Таблица 1
Нарушения мейоза, отмеченные на стадиях А1 и А2
Генотип Количество изученных клеток, шт. Всего нарушений, % Отстающие хромосомы, % Фрагменты, % Мосты, % Выброс хромосом, % Асинхронные деления, %
Agrobacterium-опосредованная трансформация in vitro
Контроль 1 370 0,5±0,3 - - 0,5±0,4 - -
Контроль 2 350 1,7±0,7 - 1,7±0,7 - - -
Векторная конструкция pBi2E
Зимоярка 1 250 2,0±0,8 - 1,2±0,7 - - 0,8±0,4
Зимоярка 11 260 6,5±1,7 - 4,6±1,5 1,9±0,8 - -
Зимоярка 43 290 7,2±1,8 1,0±0,4 3,1±1,4 1,4±0,7 - 1,7±0,6
Зимоярка 59 300 17,4±2,3 2,3±0,8 9,7±1,9 3,7±1,4 1,7±0,7 -
Векторная конструкция pBi-ОАТ
Зимоярка 154 240 3,7±1,4 - 2,9±0,8 0,8±0,3 - -
Зимоярка 161 250 11,6±2,1 2,4±0,8 5,6±1,2 3,2±0,9 0,4±0,2 -
Зимоярка 169 250 9,2±1,9 - 3,6±0,9 2,8±0,8 1,6±0,8 1,2±0,7
Зимоярка 175 230 10,4±2,0 0,4±0,2 4,4±0,9 2,2±0,8 - 3,4±0,8
Agrobacterium-опосредованная трансформация in planta
Контроль 370 0,5±0,3 - - 0,5±0,4 - -
Векторная конструкция pBi2E
Зимоярка 32р 260 4,8±1,3 0,6±0,5 1,7±0,8 0,9±0,6 - 1,6±0,8
Зимоярка 74р 300 9,7±1,7 1,6±0,7 3,6±1,1 2,6±1,9 - 1,9±0,8
Зимоярка 86р 310 11,6±1,8 2,6±0,9 3,5±1,0 2,9±0,9 1,9±0,8 0,7±0,5
Векторная конструкция pBi-ОАТ
Зимоярка 93р 230 6,8±1,7 - 2,9±1,1 1,4±0,8 2,5±1,0 -
Зимоярка 126р 290 18,7±2,3 6,1±1,4 2,6±0,9 2,3±0,9 3,8±1,1 3,9±1,1
Зимоярка 134р 280 13,2±2,0 2,8±0,5 4,3±1,2 3,7±1,1 2,4±0,9 -
Из фрагментов и/или целых отставших хромосом, которые не отходили вместе с другими к полюсам и оставались в цитоплазме, в тетрадах на стадии Т2 образовывались микроядра (рис., и). Основными нарушениями на стадии А2 также были отставание или выброс хромосом. Кроме того, на стадиях ана-телофазы отмечали клетки с асинхронным делением, когда в одной клетке проходила поздняя анафаза / ранняя телофаза, в то время как во второй - ме-тафаза (рис., д). Частота таких клеток у линий была различной и варьировала в пределах от 0,7 до 3,9%. (табл. 1).
На стадии Т1 происходит формирование диад. Показано, что к этому времени отставшие хромосомы и фрагменты, которые оставались в цитоплазме и не отходили к полюсам, могут
элиминироваться, включаться в одно из тело-фазных ядер или образовывать микроядра [27]. Одним из характерных нарушений на этой стадии были асимметричные деления, в результате которых к полюсам отходило разное количество хромосом. Тетрады с микроядрами отмечались с различной частотой у всех проанализированных линий (табл. 2). Наибольшее количество таких клеток (28,1%) отмечено у линии Зимоярка 175, наименьшее (0,7%) - у линии Зимоярка 1. Кроме того, у отдельных линий (Зимоярка 161 и 169) наблюдали тетрады, в которых одна или две микроспоры отсутствовали (рис., ж, к). Количество таких клеток не превышало 2%. Появление в тетрадах безъядерных микроспор некоторые исследователи объясняют наличием в М1 или М2
Таблица 2
Анализ стадии тетрад и мейотический индекс
Генотип Стадия тетрад Мейотический индекс, %
Количество изученных клеток, шт. Из них
Норма С микроядрами, % Отсутствуют микроспоры, %
Agrobacterium-опосредованная трансформация in vitro
Контроль 1 563 561 0,3±0,2 - 99,6±0,2
Контроль 2 593 586 1,2±0,4 - 98,8±0,5
Векторная конструкция рВйЕ
Зимоярка 1 579 572 0,7±0,4 0,2±0,2 99,1±0,4
Зимоярка 11 498 455 7,6±1,2 1,0±0,4 91,4±1,3
Зимоярка 43 501 393 19,8±1,8 1,8±0,6 78,4 ±1,8
Зимоярка 59 495 376 21,2±1,8 2,8±0,7 75,9±1,9
Векторная конструкция рВьОАТ
Зимоярка 154 505 459 8,3±1,2 0,8±0,4 90,9±1,3
Зимоярка 161 496 337 30,2±2,1 1,8±0,6 67,9±4,4
Зимоярка 169 537 387 26,1±1,9 1,9±0,6 72,1±1,9
Зимоярка 175 598 418 28,1±1,8 2,0±0,6 69,9±1,9
Agrobacterium-опосредованная трансформация in planta
Контроль 563 561 0,3±0,2 - 99,6±0,2
Векторная конструкция рВйЕ
Зимоярка 32р 500 471 5,8±1,0 - 94,2±1,0
Зимоярка 74р 550 409 17,2±1,6 8,4±1,2 74,4±1,9
Зимоярка 86р 610 498 14,1±1,4 4,3±0,8 81,6±1,6
Векторная конструкция рВьОАТ
Зимоярка 93р 550 503 8,6±1,2 - 91,4±1,2
Зимоярка 126р 560 332 25,5±2,1 15,2±1,5 59,3±2,1
Зимоярка 134р 560 399 24,8±1,8 3,9±0,8 71,2±1,9
автономного веретена, а также отсутствием ки-нетохорных фибрилл или аномальным преждевременным цитокинезом в профазе 2 [26].
В конечном итоге это может приводить к снижению фертильности или полной стерильности пыльцы. В ходе исследования отмечали и другие аномалии - триады (рис., л), пентады (рис., м), а иногда полиады.
Исследование показателей мейотического индекса у трансгенных растений, полученных путем Agrobacterium-опосредованной трансформации in vitro, показало, что три из проанализированных линий имеют высокий индекс - 90-99% (линии Зимоярка 1, 11, 154); две - сниженный - 75-78% (линии Зимоярка 43, 59) и три - низкий - 68-72% (линии Зимоярка 161, 169, 175).
Подобная картина наблюдалась и при Agrobacterium-опосредованной трансформации in planta: две линии - Зимоярка 32р и 93р -с высоким мейотическим индексом (94,2 и 91,4%, соответственно); одна - Зимоярка 86р -с пониженным - 81,6%, и три - с низким 59,3, 71,2 и 74,4% (соответственно линии Зимоярка 126р, 134р, 74р) (табл. 2).
Высокий мейотический индекс присущ цитологически стабильным формам с нормальным течением мейоза, формированием тетрад без нарушений и обусловливает в дальнейшем образование жизнеспособной пыльцы. По годам воспроизведения трансгенные растения этих линий по продолжительности фенологических стадий роста практически не отличались от контрольных растений сорта Зимоярка. Это свидетельствует в пользу стабилизации функционирования генома в целом у потомков первичных трансформантов уже в следующем поколении. Сниженный мейотический индекс характерен для стабильных форм, которые имеют определенное количество нарушений в метафазе. Низкий мейотический индекс свидетельствует о повышенном уровне нарушений на стадиях М1-А2 и является показателем нестабильности таких материалов.
Следует отметить, что кроме описанных нарушений у линий Зимоярка 86р и Зимоярка 126р наблюдали отдельные пыльники, в клетках которых происходил клампинг (слипание) хромосом (рис., н). В первой метафазе мейо-за суперконденсированные хромосомы были тесно сближены, образуя «комки», в которых
практически невозможно различить отдельные хромосомы. В анафазе хромосомы «растягивались» и к полюсам отходило разное количество хроматина. Цитологическое проявление этой мутации практически не отличалось от описанного Соснихиной у ржи [28]. Микроспоры, образующиеся в конце мейоза, имеют неравное количество хроматина, различаются по размеру ядер и могут быть стерильными. Частота таких клеток была на уровне 2%.
Нами также проводилось определение фер-тильности пыльцы у исследуемых линий. На цитологических препаратах фертильная пыльца окрашивалась ярким карминно-красным цветом и имела зернистую цитоплазму с четко сформированными двумя спермиями и вегетативным ядром. Стерильные пыльцевые зерна почти не окрашивались кармином. Результаты анализа фертильности пыльцы подтверждают, что линии с низким мейотическим индексом характеризуются пониженной фертильностью пыльцы.
Показано, что интеграция Т-ДНК в геном растений при А^гоЬас^гшт-опосредованной трансформации не является сайт-специфичной и носит случайный характер, что приводит к различного рода мутациям и хромосомным перестройкам генома растений, которые могут сказываться на репродуктивной способности растений-трансформантов [6, 7, 14, 15]. Встраивание в геном трансформантов пшеницы генетических конструкций с использованием Аgrobacterium-опосредованной трансформации также неспецифично и может приводить к различным структурным изменениям хромосом. Эти изменения незначительно отражаются на морфологии растений, но в разной степени нарушают ход мейоза, что приводит к различной динамике снижения завязывания семян. Следует отметить, что у некоторых линий процент клеток с нарушениями в разы превышает контрольные. Кроме того, линии с низким мейоти-ческим индексом характеризуются пониженной фертильностью пыльцы и, как следствие, низкой завязываемостью семян. У линий Зимоярка 74р, 86р, 126р, 134р она составляла 30-40% от контроля (растения сорта Зимоярка, завязывание семян которых принимали за 100%). Это может быть связано либо с прямым действием агробактерии на растительные клетки, либо с опосредованным влиянием, поскольку ино-
куляционная среда богата углеводами, биологически активными соединениями и может стимулировать рост сапрофитной микрофлоры, которая негативно влияет на процесс опыления и развитие завязи. В то же время у линий Зимо-ярка 32р и 93р завязываемость семян составляла 90% от контроля.
Заключение
Таким образом, анализ хода мейоза у генетически модифицированных растений пшеницы показал, что трансгенные формы характеризуются большей частотой нарушений мейоза по сравнению с нетрансгенными. Нами не выявлено существенных отличий протекания мейоза у генетически модифицированных растений пшеницы, полученных как в культуре in vitro, так и методом in planta. Проанализированные линии различаются по уровню цитологической стабильности: среди трансгенных растений, полученных различными способами Аgrobacterium-опосредовaнной трансформации появляются как генетически стабильные, так и генетически нестабильны формы, которые имеют значительные нарушения мейоза. Показано, что процент клеток с нарушениями мейоза был наибольшим у трансгенных растений из линий, которые характеризуются низкой семенной продуктивностью. Наши результаты показывают, что уровень цитологической стабильности у линий, полученных при использовании штамма AGLO с векторной конструкцией pBi2E, выше по сравнению с линиями, трансформированными штаммом AGLO с векторной конструкцией pBi-ОАТ. Возможно, это связано с неспецифическим встраиванием генетической конструкции в геном пшеницы, что может в разной степени нарушать ход мейоза, и является основной причиной неодинаковой воспроизводимости трансгенных линий.
Список использованных источников
1. Bhalla, P.L. Wheat transformation-an update of recent progress / P.L. Bhalla, H.H. Ot-tenhof, M.B. Singh // Euphytica. - 2006. -Vol. 149. - P. 353-366.
2. Transgenic plant regeneration from wheat (Triticum aestivum L) mediated by Agrobacte-rium tumefaciens / G. Xia [et al.] // Acta Physiol. Sin. - 1999. - Vol. 25. - P. 22-28.
3. Mahalakshmi, A. Agrobacterium-mediated gene delivery in various tissues and genotypes of wheat (Triticum aestivum L) / A. Mahalakshmi, P. Khurana // J. Plant Biochem. Biotechnol. -1995. - Vol. 4. N 2. - P. 55-59.
4. Genomic changes in transgenic rice (Ory-za sativa L.) plants produced by infecting calli with Agrobacterium tumefaciens / M. Labra [et al.] // Plant Cell Reports. - 2001. - Vol. 20. -P. 325-330.
5. Somaclonal variation in transgenic plants / F. Sala [et al.] // Acta Horticulture. - 2000. -Vol. 530. - P. 411-419.
6. Laufs, P. A chromosomal paracentrric inversion associated with T-DNA integration in Arabidopsis / P. Laufs, D. Autran, J. Traas // Plant J. - 1999. - T. 18, N 2. - P. 131-139.
7. Дейнеко, Е.В. Т-ДНК-индуцированные мутации у трансгенных растений /
E.В. Дейнеко, А.А. Загорская, В.К. Шумный // Генетика. - 2007. - Т. 43, № 1. - С. 5-17.
8. Tax, F. T-DNA-associated duplication/ translocations in Arabidopsis. Implications for mutant analysis and functional genomics /
F. Tax, D. Vernon // Plant Physiology. - 2001. -Vol. 126, N 4. - P. 1527-1538.
9. Antibiotic-induced DNA methylation changes in calluses of Arabidopsis thaliana / M. Bardini [et al.] // Plant Cell Tissue and Organ Culture. - 2003. - Vol. 72. - P. 157-162.
10. Чумаков, М.И. Технологии агробактери-альной трансформации растений in planta / М.И. Чумаков, Е.М. Моисеева // Биотехнология. - 2012. - № 1. - С. 8-20.
11. Development of simple and efficient in planta transformation method for wheat (Triticum aestivum L.) using Agrobacterium tumefaciens / P. Supartana [et al.] // Journal of Bioscience and Bioengineering. - 2006. -Vol. 102. - № 3. - P. 162-170.
12. Transgenic wheat progeny resistant to powdery mildew generated by Agrobacterium inoculum to the basal portion of wheat seedling / T. Zhao [et al.] // Plant Cell Rep. - 2006. -Vol. 25. - P. 1199-1204.
13. Т-ДНК-индуцированные аномалии цветков и мужская стерильность у трансгенных растений табака: морфологический и цитологический анализ / Ю.В. Сидорчук [и др.] // Цитология и генетика. -2000. - T. 34, № 6. - С. 3-8.
14. Embryonic lethals and T-DNA insertional mutagenesis in Arabidopsis / D. Errampalli [et al.] // Plant Cell. - 1991. - Vol. 3, N 2 - P. 149-157.
15. Abnormalities of meiotic division caused by T-DNA tagget mutation in tobacco (Nicotiana tabacum L.) / N.V. Shamina [et al.] // Cell Biol. Int. - 2001. - Vol. 25, N 4. -P. 367-369.
16. Преждевременный цитокинез в материнских клетках пыльцы трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) / Ю.В. Сидорчук [и др.] // Цитология. - 2008. -T. 50, № 5. - С. 447-451.
17. Peirson, B.N. A defect in synapsis causes male sterility in a T-DNA-tagged Arabidopsis thaliana mutant / B.N. Peirson, S.E. Bowling, Ch. Makaroff // The Plant Journal. - 1997. -Vol. 11. N 4. - P. 659-669.
18. Особенности развития мужской репродуктивной сферы инсерционного мутанта табака TPD1 с продолжительным периодом цветения / Э.Л. Миляева [и др.] // Физиология растений. - 2002. - T. 42, № 4. - С. 526-534.
19. Особенности развития и репродукции трансгенних растений льна-долгунца / В.А. Лемеш [и др.] // Онтогенез. - 2014. -T. 45, № 6. - С. 406-411.
20. Genetic and molecular characterization of embryonic mutants identified following seed transformation in Arabidopsis / L.A. Castle [et al.] // Mol. Gen. Genet. - 1993. - Vol. 241. -N 5/6. - P. 504-514.
21. Бавол, А.В. Оптимiзацiя умов Agrobacterium-опосeрeдкован6i трансформацп калюав м'яко'1 пшенищ / А.В. Бавол, С.С. Воронова, О.В. Дубровна // Физиология растений и генетика. - 2015. - Т. 47, № 1. - С. 58-65.
22. Воронова, С.С. Генетична трансфор-мащя in planta м'яко'1 пшенищ з викорис-танням штаму AGLO, який мютить pBi2E з дволанцюговим РНК-супресором гена про-лшдегщрогенази / С.С. Воронова, А.В. Бавол, О.В. Дубровная // Фактори експерт. еволю-цп органiзмiв: зб.наук.праць. - Кшв: Логос, 2015. - Т. 17. - С. 126-130.
23. Гончарук, А.Н. Agrobacterium-опо-середкована трансформащя м'яко'1 пшенищ in planta з використанням гена орштинамь нотрансферази / А.Н. Гончарук, А.В. Бавол, О.В. Дубровная // Фактори експерт. еволю-щ'1 органiзмiв: зб.наук.праць. - Кшв: Логос, 2015. - Т. 17. - С. 131-135.
24. Паушева, З.П. Практикум по цитологии растений / З.П. Паушева. - М.: Колос, 1988. -280 с.
25. Цитологическое изучение коллекции синтетической пшеницы из национальной коллекции злаков США (National Small Grain Collection of USDA-AKS) в условиях нечерноземной зоны России / И.Ф. Лапочкина [и др.] // Сельхоз. биология. - 2014. - № 3. -С. 77-82.
26. Проявление и наследование десинапти-ческой формы ржи с нарушением гомо-логичности синапсиса / С.П. Соснихина [и др.] // Генетика. - 2007. - T. 43, № 10. -С. 1424-1433.
27. Создание тетраплоидных форм озимой ржи (Secale cereale L.) с использованием закиси азота и генетические эффекты дупликации генома / Н.Б. Белько [и др.] // Факторы экспериментальной эволюции организмов. - 2011. - T. 10. - С. 15-20.
O.V. Dubrovna, I.I. Lyalko, A.V. Bavol, s.s. Voronova, A.N. Goncharuk
the analysis of meiosis in transgenic wheat plants
obtained by AGROBACTERIUM-MEDIATED transformation
IN VITRO and INPLANTA
Institute of Plant Physiology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine 03022, Ukraine, Kyiv, str. Vasylkivska 31/17
Meiosis in genetically modified wheat plants obtained by Agrobacterium-mediated transformation of in vitro culture and in planta of bread wheat cv. Zimoyarka has been investigated. It was found that transgenic forms are characterized by a higher frequency of meiotic disorders compared to non-transgenic plants. Comparative analysis of meiosis showed that transgenic lines obtained using strain AGLO with a vector construct pBi2E have much lower percentage of cells with disorders at the metaphase stage 1, and meiotic index is respectively higher than in the lines obtained using strain AGLO with a vector construct pBi-OAT. It is shown that the percentage of cells with impaired meiotic was the largest in transgenic plants from lines from lines that are characterized by reduced pollen fertility and low seed productivity.
Key words: Triticum aestivum L., Agrobacterium-mediated transformation, meiosis.
Дата поступления статьи 8 февраля 2016 г.
