CC BY
31
Серия «Биология. Экология» И З В Е С Т И Я
2010. Т. 3, № 3. С. 13 19 Иркутского
Онлайн-доступ к журналу: государственного
http://isu.ru/izvestia университета
УДК 576.315
Трансформация митохондрий табака генетической конструкцией с интегративными свойствами и отбор клеточных линий с трансгенными митохондриями по устойчивости к антимицину А
11 1 2 А. И. Катышев , В. Н. Шмаков , В. В. Черникова , Ю. В. Сидорчук , 21 Е. В. Дейнеко , Ю. М. Константинов
1 Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск 2Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, Новосибирск E-mail: [email protected]
Аннотация. Получены трансформированные митохондрии табака путем введения in vivo методом биобал-листической трансформации ДНК митохондриального генетического вектора, несущего ген устойчивости к антимицину А. Путем отбора клеточных линий табака по устойчивости к ингибитору дыхательного комплекса III антимицину А получены каллусные линии, сохраняющие высокую скорость роста в присутствии этого ингибитора в отличие от контрольных нетрансформированных линий. Предполагается, что ростовые характеристики отобранных каллусных линий обусловлены экспрессией трансгена в митохондриях этих линий.
Ключевые слова: Nicotiana tabacum, каллусные линии, митохондриальный генетический вектор, модифицированный ген cob, биобаллистическая трансформация, устойчивость к антимицину А.
Введение
До настоящего времени как фундаментальные исследования структурно-функциональной организации генома митохондрий с применением современных подходов молекулярной генетики и молекулярной биологии, так и прикладные работы по переносу генов в геном этих органелл с целью решения конкретных задач биотехнологии и биомедицины пока не могут быть реализованы (за исключением дрожжей [5]) в связи с отсутствием системы генетической трансформации митохондрий. Однако решением данной проблемы может стать разработка системы генетической трансформации растительных митохондрий, основанная на использовании генетического вектора с геном устойчивости к ингибиторам дыхания, действующим на уровне дыхательного комплекса III растительных митохондрий: антимицину А и миксотиазолу [6; 8].
Потенциальная система трансформации митохондриального генома растений табака на основе применения в качестве селективного гена разных мутационных вариантов гена апо-цитохрома b (cob), обеспечивающих устойчивость клеток с трансформированными митохондриями к действию ингибиторов дыхания -антимицина А или миксотиазола, предложена в
работе [8]. При этом для более эффективной селекции предложено использовать дополнительно ингибитор альтернативной оксидазы -салицилгидроксамовую кислоту (СГК) для усиления эффекта антимицина А или миксо-тиазола [8]. Возможность получения устойчивых к действию миксотиазола организмов за счет биобаллистической трансформации митохондриального генома ранее продемонстрирована на примере одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas в работе [6]. Тем не менее, проблема генетической трансформации митохондрий высших растений остается пока нерешенной.
Целью настоящей работы было исследование возможности получения трансформированных митохондрий табака в системе in vivo путем введения методом биобаллистической трансформации ДНК митохондриального генетического вектора, несущего в качестве селективного гена ген устойчивости к антимицину А.
Материалы и методы
Получение генетической конструкции NtPcob-sod3.1-IGr-cob* для трансформации митохондрий. Схема используемого в работе митохондриального генетического вектора с интегративными свойствами представлена на
рис. 1. Для получения кДНК гена sod3.1 Zea mays выделяли тотальную РНК из 5-дневных этиолированных проростков кукурузы с использованием набора RNAeasy (QIAGEN, США) согласно инструкции производителя. Обработку ДНКазой (Fermentas, Литва) препаратов РНК кукурузы и синтез первой цепи кДНК с использованием в качестве затравки праймера олиго^Т)18 с помощью обратной транскриптазы RevertAid Н-Minus (Fermentas, Литва) осуществляли аналогично [2].
Для амплификации кДНК гена cob табака гена sod3.1 кукурузы, геномных последовательностей 5’-области гена cob табака и меж-генного участка atp9/orf262 митохондриального генома арабидопсиса использовали праймеры, представленные в табл. 1. Выделение ДНК из 7-дневных зеленых растений Arabidopsis thaliana и каллусов Nicothiana tabacum var. SR1 осуществляли по методу Devey с соавт. [4].
3’UTR^
rpsl4/cob
межгенная
область
atp9/orf262
межгенная
область
Рис. 1. Схема использованной в работе генетической конструкции NtPcob-sod3.1-IGr-cob*. Обозначения: cob- ген апоцитохрома b Nicotiana tabacum; cob* - модифицированный ген cob; sod3.1 - ген Mn-содержащей супероксиддисмутазы кукурузы; IGR - межгенный участок atp9-orf262 A. thaliana
Таблица 1
Олигонуклеотиды, использованные для создания генетической конструкции
NtPcob-sod-IGR-cob *
Название Последовательность олигонуклеотида (5’->3’) Ожидаемый ПЦР-продукт
Zm1CL ATGGGGGTGACGACGGTCACA sod3.1 кукурузы
Zm1CR TCAAGCAAGAACATTTTCGTACACCT
ricL TCAGGGCGCAGCGAAGCCA 5 -область гена cob табака
ricR TTATTTATTTATCTTTTCTATCGTGACA
3IRaL TCGAAGAAAGAAGGTTTCCATTCA atp9/orf262 межгенный участок митохондриального генома арабидопсиса
3IRaR AATTTAATTTCGAGTGTGATCAAA
cobL ATGACTATAAGGAACCAACGACTCTCT Транслируемая последовательность кДНК гена cob табака
cobR TCAGGTGTGATCAGTCTCATCCGT
GtoVdir TCGTTAGCTGTTATTTGTTTAGT Участок гена cob табака с мутацией (G43V)
GtoVcom ACTAAACAAATAACAGCTAACGA
Амплификацию ДНК (36 циклов) проводили с помощью Р/м-ДИК-полимеразы (Регшеи1а8, Литва) в буфере производителя в следующем режиме: денатурация - 40 с при 94 °С; отжиг -1 мин при 55 °С, элонгация - 1 мин при 72 °С.
Продукты амплификации разделяли с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле при напряжении 100 В. Окрашенные бромистым этидием и визуализированные в УФ-свете соответствующие требуемому размеру ПЦР-
продукты вырезали из геля и элюировали с помощью набора Illustra (GE Healthcare, США) согласно инструкции производителя. Элюированные ПЦР-продукты лигировали с помощью T4-ДНК-лигазы (Fermentas, Литва) в составе плазмиды pBlueScript KS(+) (Invitrogen, США), предварительно расщепленной эндонуклеазой рестрикции EcoRV (СибЭнзим, Новосибирск). Реакции рестрикции и лигирования осуществляли согласно протоколам производителей ферментов. Лигазные смеси использовали для трансформации клеток Escherichia coli, штамм XL1 Blue (Fermentas, Литва) с помощью набора TransformAid (Fermentas, Литва). Отбор рекомбинантных клонов осуществляли с помощью фенотипической селекции на агаризован-ной среде LB, содержащей IPTG (5 мМ) и X-gal (1 %) c последующим ПЦР-анализом ДНК-клонов. Соответствие клонированных фрагментов искомым последовательностям подтверждали секвенированием по методу Сэнгера на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems, США) согласно инструкции производителя.
Получение последовательности модифицированного гена cob N. tabacum, детерминирующего по данным V. M. Ortega и соавторов [8] устойчивость к антимицину А, осуществляли с помощью метода перекрывающихся праймеров. Для этого сначала с применением Pfu-ДНК-полимеразы амплифицировали левую и правую части гена cob с использованием пар праймеров cobL-GtoVcom GtoVdir-cobR (см. табл. 1). В структуру олигонуклеотидов
GtoVdir и GtoVcom введена замена одного из нуклеотидов, определяющая замену триплета GGT, кодирующего аминокислоту глицин в структуре гена шЬ табака на триплет GTT, кодирующий аминокислоту валин. Продукты амплификации очищали от олигонуклеотидов с помощью набора Illustra (GE Healthcare, США) согласно инструкции производителя. После очистки продукты обеих реакций смешивали в эквимолярном количестве (около 100 нг) в реакционной смеси для ПЦР с Pfu-ДНК-полимеразой, не содержащей праймеров, проводили один цикл амплификации в стандартных условиях, после чего добавляли в реакционную смесь олигонуклеотиды cobL и cobR до итоговой концентрации 0,4 нМ каждого и осуществляли амплификацию по стандартной программе. После электрофоретического разделения продуктов ПЦР и визуализации в УФ свете ПЦР-продукт соответствующего размера элюировали из геля с помощью набора Illustra
(GE Healthcare, США), клонировали в составе плазмиды pBlueScript KS(+) и секвенировали.
Вырезание клонированных элементов конструкций для трансформации митохондрий табака in vivo осуществляли с помощью эндонуклеаз рестрикции XhoI и XbaI (СибЭнзим, Новосибирск) согласно инструкции производителя. Лигирование фрагментов после рестрикции проводили с помощью T4 ДНК-лигазы (Си-бЭнзим, Новосибирск) согласно инструкции производителя.
Растительный материал. В качестве растительного материала использовали каллусную культуру табака, растущую на среде следующего состава - основные неорганические соли по Мурашиге и Скугу (MS) [7], 80 г/л мезоино-зитола, 1 мг/л тиамина, 0,5 мг/л пиридоксина, 20 г/л сахарозы, 1 мг/г НУК (а-нафтилуксусная кислота), 0,1 мг/л кинетина, 7 г/л агара. Период субкультивирования составлял 28 дней. Культура поддерживалась в темноте при температуре 24 °С.
Генетическая трансформация N. tabacum. Трансформацию клеточной культуры проводили с помощью генной пушки PDS-1000/He System (BioRad). Кусочки каллуса диаметром примерно 2 см помещали на агаризованную среду MS основного состава и через 2 дня культивирования подвергали обстрелу золотыми микрочастицами с нанесенной на них ДНК генетической конструкции NtPcob-sod3.1-IGr-cob*. Обстрелянную культуру оставляли на той же среде на 2 недели. Далее каждый экземпляр каллуса разделялся на 3-4 участка. Каждый участок нумеровался и культивировался отдельно.
Селекция каллусных линий табака по устойчивости к антимицину А и салицилгдирок-самовой кислоте. Селекцию проводили на чашках Петри. Селективная среда помимо обычных питательных компонентов содержала дополнительно 20 мкМ антимицина А и
0,25 мМ салицилгидроксамовой кислоты. Участки каллусной культуры помещали на чашку с селективной средой и аналогичный по размеру участок каллуса - на чашку со средой без селективных агентов с соблюдением взаиморасположения каллусов на каждой чашке. Визуальную оценку состояния каллусов и их ростовой активности проводили в конце периода субкультивирования.
Результаты и обсуждение
Поскольку возможность интеграции экзогенной ДНК в митохондриальный геном по принципу гомологической рекомбинации пока-
зана ранее для дрожжей [5] и изолированных митохондрий картофеля [1], нами для генетической трансформации митохондрий табака in vivo было решено также использовать генетическую конструкцию с интегративными свойствами (см. рис. 1). В данной конструкции в качестве селективного гена использован модифицированный ген апоцитохрома b (cob*) табака, единичная нуклеотидная замена в структуре которого согласно данным V. M. Ortega и соавторов [8] обеспечивает устойчивость клеток к действию ингибитора митохондриального дыхания антимицина A. Последовательность гена cob* также выполняет функцию одного из сайтов, по которому предполагается рекомбинация конструкции с митохондриальным геномом табака и ее интеграция в митохондриальный геном. В митохондриях табака in vivo транскрипт гена cob, как и транскрипты многих других митохондриальныех генов, при созревании подвергается редактированию [8]. При этом наблюдаемое in vivo неполное редактирование мРНК гена cob влияет на количество функционального белкового продукта этого гена [8]. В связи с этим при создании конструкции NtPcob-sod3.1-IGr-cob* использовали не геномную модифицированную последовательность гена cob, а последовательность кДНК этого гена. Для этого с помощью ПЦР амплифицирована последовательность кДНК гена апоцитохрома b (cob) табака, в которую с использованием метода перекрывающихся праймеров введена нуклеотидная замена (G->T), приводящая к замене аминокислоты глицин на аминокислоту валин (G43V) (см. рис. 1). Наличие измененного аминокислотного триплета подтверждено секвенированием клонированных модифицированных последовательностей.
В качестве целевого гена для трансформации митохондрий табака in vivo нами использован ген антиоксидантной защиты митохондрий кукурузы - Mn-содержащей супероксид-дисмутазы sod3.1 (см. рис. 1), последовательность кДНК которого была предварительно клонирована и секвенирована [9]. Данная кДНК затем клонирована нами в экспрессирующем векторе pQE60 в культуре клеток E. coli (штамм XL 1-Blue). С помощью электрофоретического анализа полипептидного состава экстрактов трансформированных бактерий и определения супероксиддисмутазной активности в геле показано образование белкового продукта гена sod3.1 кукурузы. Данный полипептид формирует характерную для на-
тивного белка тетрамерную структуру и проявляет супероксиддисмутазную активность.
Для экспрессии гена sod3.1 кукурузы в митохондриях табака в качестве промоторной области нами использована 5’-область гена cob, содержащая промоторный участок этого гена (см. рис. 1). Эта область наряду с собственно геном cob выполняет функцию сайта, по которому должна осуществляться ее интеграция в митохондриальный геном путем гомологической рекомбинации. В связи с тем, что терминирующие транскрипционные элементы в митохондриальных геномах растений пока не охарактеризованы, для терминации транскрипции целевого гена sod3.1 и инициации транскрипции селективного гена cob* нами использован один из сравнительно небольших (300 п. н.) межгенных участков митохондриальных геномов растений. Наиболее подходящим для этих целей оказался межгенный участок atp9/orf262 из митохондриального генома Arabidopsis thaliana (GenBank/EMBL Acc.No. Y08501). Использование в данном случае экзогенной генетической последовательности продиктовано необходимостью снижения риска случайной рекомбинации конструкции с различными участками генома митохондрий табака.
Вышеперечисленные элементы генетических конструкций (5’- область гена cob табака и межгенный участок atp9/orf262 арабидопси-са) получены нами с помощью ПЦР с использованием в качестве матрицы тотальной ДНК табака и арабидопсиса, а затем клонированы. Соответствие этих полинуклеотидных последовательностей требуемым было подтверждено секвенированием. На следующем этапе произведено поэтапное лигирование необходимых элементов генетических конструкций. Отбор корректных вариантов после лигирования осуществлялся с помощью ПЦР. Полученные таким образом генетические конструкции также были клонированы, и соответствие их структуры требуемой также подтверждено секвенированием.
В экспериментах по биобаллистической трансформации каллусной культуры табака ДНК полученной конструкции наносили на золотые микрочастицы диаметром 0,6 мкм. Участки каллуса диаметром около 2 см, предварительно культивированные на среде MS основного состава, подвергали двукратному обстрелу с последующей инкубацией в течение двух недель на основной питательной среде MS. Полученные в трех сериях экспериментов по биобаллистической трансформации 18 кал-
лусных линий были подвергнуты селекции по признаку устойчивости к антимицину А.
Селекцию трансформированных клеток табака проводили на основе системы, предложенной в работе V. M. Ortega и соавторов [S], и модифицированной нами [3]. Для этого кусочки каллуса примерно одного размера от каждого образца, подвергнутого биобаллистической трансформации, параллельно помещали на селективную и контрольную среду (рис. 2, А). В конце периода культивирования, составлявше-
го 2S дней, проводили оценку ростовой активности каллуса на селективной и контрольной средах (рис. 2, Б). Как видно из представленных рисунков, скорость роста отдельных кал-лусных линий на используемых средах различна. Сравнительно одинаковая ростовая активность каллуса на селективной и нормальной средах является, вероятно, результатом экспрессии модифицированного гена cob (cob*) в составе используемой нами генетической конструкции.
Рис. 2. Селекция трансформированных каллусных культур табака генетической конструкцией ШРевЬ-sod3.1-Юг-евЬ*. Каллусная культура табака N (контроль) и 8 (получена из листовых высечек, подвергшихся биобаллистической трансформации) на среде Мурашиге-Скуга (МС) (левый образец) и МС + антимицин А 20 мкМ + салицилгидроксамовая кислота 0,25 мМ (правый образец) в начале эксперимента (А) и спустя 1 месяц после начала культивирования (Б). Видны различия в ростовой активности каллусов на селективной среде
Таким образом, путем биобаллистической трансформации каллусной культуры табака митохондриальной генетической конструкцией NtPcob-sod3.1-IGr-cob* и последующего отбора клеточных линий по устойчивости к ингибитору дыхательного комплекса III антимици-ну А получены линии, сохраняющие высокую скорость роста в присутствии этого антибиотика в отличие от контрольных нетрансформиро-ванных линий. Предположено, что ростовые характеристики отобранных каллусных линий обусловлены экспрессией трансгена cob* в митохондриях этих линий. В настоящее время нами проводится молекулярно-биологический анализ с целью получения доказательств экспрессии гена cob* и гена sod3.1 в митохондриях каллусов табака. В случае, если удастся достигнуть эффективной экспрессии гена sod3.1 в полученных нами каллусных линиях, последние будет возможно использовать в качестве информативной модельной системы для исследований роли антиоксидантной системы митохондрий в биогенезе клетки и всего организма.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект 09-04-00992) и междисциплинарных интеграционных проектов СО РАН №№ 7, 83, 98.
Литература
1. Милешина (Непомнящих) Д. В. Интеграция чужеродных последовательностей ДНК в митохондриальный геном растений / Д. В. Милешина (Непомнящих), Ф. Диетриш, Ю. М. Константинов // Изв. Иркут. гос. ун-та. Сер.: Биология. Экология. -2008. - Т. 1, № 2. - С. 62-66.
2. Сравнительная характеристика ядерной и митохондриальной ДНК-топоизомеразы I кукурузы /
B. И. Тарасенко [и др.] // Молекулярная биология. -2008. - Т. 42. - С. 88-95.
3. Шмаков В. Н. Изучение возможности использования антимицина А при селекции растительных клеток, несущих трансформированные митохондрии / В. Н. Шмаков, Ю. М. Константинов // Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды : материалы. Всерос. науч. конф (24-28 августа 2009 г.). - Иркутск, 2009. -
C. 530-533.
4. A genetic linkage map for Pinus radiata based on RFLP, RAPD, and microsatellite markers / M. E. Devey [et al.] // Theoretical and Applied Genetics. -1996. - Vol. 92. - P. 673-679.
5. Bonnefoy N. Directed alteration of Saccharomy-ces cerevisiae mitochondrial DNA by biolistic transformation and homologous recombination / N. Bonnefoy, Th. D. Fox // Methods Mol. Biol. - 2007. - Vol. 372. - P. 153-166.
6. High-efficiency biolistic transformation of Chlamydomonas mitochondria can be used to insert mutations in complex I genes / C. Remacle [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2006. - Vol. 103. - P. 473-497.
7. Murashige T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Scoog // Physiol. Plant. - 1962. - Vol. 15. - P. 473-497.
8. Ortega V. M. The tobacco apocytochrome b gene predicts sensitiivity to the respiratory inhibitors antimycin A and myxothiazol / V. M. Ortega, J. G. Bohner,
C. D. Chase // Curr. Genet. - 2000. - Vol. 37. - P. 315-321.
9. Zea mays L. mitochondrial Mn-superoxide dis-mutase: evidence in favour of potential DNA protective function / A. I. Katyshev [et al.] // Maize Genet. Coop. Newslett. - 2010. - Vol. 84. - P. 76.
Transformation of tobacco mitochondria by genetic construct with integrative properties and selection of cell lines with transgenic mitochondria based on resistance to antimycin A
A. I. Katyshev \ V. N. Shmakov1, V. V. Chemikova1, Yu. V. Sidorchuk2, E. V. Deineko2, Yu. M. Konstantinov1
1Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, SB RAS, Irkutsk 2Institute of Cytology and Genetics, SB RAS, Novosibirsk
Abstract: The delivery by biolistic method of mitochondrial genetic vector conferring resistance to antimycin A to get tobacco transformed mitochondria in vivo was investigated. Callus lines which are resistant to respiratory complex III inhibitor antimycin A were obtained. These cell lines demonstrate high growth rate in the presence of this respiratory inhibitor in comparison with non-transformed lines. We suggest that growth characteristics of selected callus lines are explained by transgene expression in mitochondria of these lines.
Key words: Nicotiana tabacum, callus lines, mitochondrial genetic vector with integrative properties, modified cob gene, biolistic transformation, resistance to antimycin A.
Катышев Александр Игоревич Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН
664033 г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132 кандидат биологических наук, научный сотрудник
тел. (3952) 42-49-03; факс: (3952) 51-07-54 Е-таіІ: [email protected]
Шмаков Владимир Николаевич Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН
664033 г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132
кандидат биологических наук,
старший научный сотрудник
тел. (3952) 42-49-03; факс: (3952) 51-07-54
Е-таіІ: [email protected]
Черникова Валентина Владимировна Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН
664033 г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132 ведущий инженер
тел. (3952) 42-49-03; факс: (3952) 51-07-54 Е-таИ: [email protected]
Сидорчук Юрий Владимирович Институт цитологии и генетики СО РАН 630090 г. Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10 кандидат биологических наук, научный сотрудник тел. (383) 330-15-79; факс: (383) 333-12-78 Е-таИ: [email protected]
Дейнеко Елена Викторовна
Институт цитологии и генетики СО РАН
630090 г. Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10
доктор биологических наук, зав. лабораторией
биоинженерии растений
тел. (383) 330-15-79; факс: (383) 333-12-78
Е-таИ: deineko@bionet. тс. т
Константинов Юрий Михайлович Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН
664033 г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132 доктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией генетической инженерии растений тел. (3952) 42-49-03; факс: (3952) 51-07-54 Е-таИ: [email protected]
Katyshev Alexander Igorevitch Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS 132 Lermontov St., Irkutsk, 664033 Ph.D. of Biology, research scientist
phone: (3952) 42-49-03, fax: (3952) 51-07-54 Е-mail: [email protected]
Shmakov Vladimir Nikolaevitch
Siberian Institute of Plant Physiology
and Biochemistry SB RAS
132 Lermontov St., Irkutsk, 664033
Ph. D. of Biology
senior research scientist
phone: (3952) 42-49-03, fax: (3952) 51-07-54
Е-mail: [email protected]
Chernikova Valentina Vladimirovna Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS 132 Lermontov St., Irkutsk, 664033 leading engineer
phone: (3952) 42-49-03, fax: (3952) 51-07-54 Е-mail: [email protected]
Sidorchuk Yuri Vladimirovitch
Institute of Cytology and Genetics SB RAS
10 Lavrentiev Ave., Novosibirsk, 630090
Ph.D. of Biology, research scientist
phone: (383) 330-15-79; fax: (383) 333-12-78
Е-mail: [email protected]
DeynekoElena Viktorovna
Institute of Cytology and Genetics SB RAS
10 Lavrentiev Ave., Novosibirsk, 630090
D.Sc. in Biology, Head of Laboratory of Plant
Bioengineering
phone: (383) 330-15-79; fax: (383) 333-12-78 Е-mail: deineko@bionet. nsc. ru
Konstantinov Yuri Mikhailovitch
Siberian Institute of Plant Physiology
and Biochemistry SB RAS
132 Lermontov St., Irkutsk, 664033
D.Sc. in Biology, Prof., Head of Laboratory
of Plant Genetic Engineering
phone: (3952) 42-49-03, fax: (3952) 51-07-54
Е-mail: [email protected]
