CC BY
26ТЕХНОЛОГИЯ ВЫСОКИХ УРОЖАЕВ
УДК 633.63: 631.416
doi.org/10.24412/2413-5518-2021-8-44-47
(D ПромАсептика
Создание регенерантов сахарной свёклы с комплексной устойчивостью к абиотическим стрессам в условиях п уИгсг
Т.П. ЖУЖЖАЛОВА, гл. научн. сотрудник, д-р биолог. наук, профессор Н.Н. ЧЕРКАСОВА, ст. научн. сотрудник
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова» (e-mail: biotechnologiya@ mail.ru)
Введение
Разработка биотехнологических методов получения устойчивых к стрессам форм сахарной свёклы — неотъемлемая часть современного селекционного процесса. Среди актуальных методов биотехнологии одним из эффективных подходов к решению этой проблемы является клеточная селекция, позволяющая отбирать резистентные клетки и ткани в селективных условиях in vitro [5].
Абиотические стрессы провоцируют комплекс взаимосвязанных реакций, протекающих одновременно или поочерёдно. Поэтому для первичной селекции целесообразно задействовать агент, оказывающий как общее патологическое давление, так и специфическое воздействие. Если стрессовый фактор отличается высокой токсичностью в относительно малых количествах и вызывает существенные нарушения в клетке, клеточная селекция может стать приоритетным методом получения новых форм растений. Этому условию отвечают ионы тяжёлых металлов (ИТМ), токсичные в следовых количествах. ИТМ действуют совместно с неблагоприятными абиотическими факторами, усиливая
стресс от окружающей среды, и тем самым расширяют спектр поражений растения от стрессов. Клеточная селекция с использованием летальных доз ИТМ может быть перспективным методом получения растительных форм с улучшенными показателями. Линии, отобранные на селективных средах с ИТМ, и их растения-регенеранты отличаются комплексной устойчивостью. Они хорошо адаптируются в условиях различных осмотических стрессов (засоление, водный стресс) независимо от условий (стресс или норма) их предыдущего выращивания. При этом жизнеспособность клеток поддерживается за счёт адаптации к конкретному стрессовому агенту [3, 6].
Достижения последнего времени подтвердили перспективность метода клеточной селекции для получения устойчивых к ИТМ форм растений на различных культурах [2, 10]. Однако в отношении сахарной свёклы подобные сведения отсутствуют. В связи с этим исследования по созданию регенерантов сахарной свёклы с комплексной устойчивостью к ионной токси-кации и осмотическому стрессу в культуре in vitro являются актуальными.
Цель исследования — оптимизировать параметры для создания новых форм сахарной свёклы с комплексной устойчивостью к стрессам и получить новый материал с изменёнными признаками для включения в селекционный процесс.
Материалы и методы
исследования
Научные исследования выполнены на базе лаборатории культуры тканей и молекулярной биологии ФГБНУ ВНИИСС им. А.Л. Мазлумова c использованием биотехнологических методов культуры in vitro [4].
В работе были использованы генотипы сахарной свёклы рамон-ской селекции, в качестве экс-плантов — зрелые зародыши семян, микроклоны сахарной свёклы.
Для моделирования селективного агента к основной среде добавляли ацетат кадмия Cd(CH3CO2)2 в различной концентрации (115 мМ) и маннит (0,40-0,45 M).
Проведённые исследования показали, что относительно низкие концентрации ацетата кадмия (1 мМ) не оказывали негативного действия на прорастание семян, которое составило 58,3-77,7 %
ь ^
Ф а
Üjj
о 5 ^
о m
Ю 8 .Ü ^ m s
44 САХАР № 8 • 2021
ПромАсептика ^
при выживаемости проростков 40,0-44,4 % (табл. 1).
Однако при высоких концентрациях селективного агента (6 мМ) процесс прорастания существенно замедлялся, образовывались проростки небольшого размера, при этом выживаемость варьировала от 13,3 до 16,7 %. При содержании ацетата кадмия 8 мМ количество выживших проростков уменьшалось в два раза и составило 8,38,7 % (рис. 1).
С увеличением концентрации селективного агента было заметно его ингибирующее действие при прорастании. Семена начинали прорастать, а по мере повышения селективной нагрузки ростки погибали через несколько дней, что приводило к уменьшению выживаемости до 5,6 % при 11 мМ ацетата кадмия, а в дальнейшем -к полной их гибели (при 15 мМ).
По-видимому, этапы набухания семени и прорастания корешка менее чувствительны к ионам кадмия, чем последующий рост проростков. Это связано с тем, что оболочка семян практически непроницаема для металла, и его проникновение в зародыш возможно только на заключительной стадии набухания, когда семенные покровы нарушаются. Высокое содержание ионов кадмия существенно замедляет или полностью останавливает процесс прорастания, что, вероятно, связано с непосредственным действием металла на процесс деления и растяжения клеток [8]. Поэтому для отбора устойчивых к ионной токсичности регене-рантов оказалась среда с содержанием кадмия 6 мМ. При этом всхожесть семян in vitro составила 38,9-46,7 %, а выживаемость проростков — 13,3-16,7 %.
В процессе эволюции растения выработали различные приспособительные механизмы, которые защищают клеточный метаболизм от присутствующих в среде
№ 8 • 2021 САХАР 45 -
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
ШИ
1 2 3 4 5 6 7 8
Всего
Выжило
Рис. 1. Влияние различных концентраций ионов кадмия на прорастание семян (среднее для генотипов) сахарной свёклы in vitro: 1 - 0 мМ; 2 - 1 мМ; 3 - 2 мМ; 4 - 4 мМ; 5 - 6 мМ; 6 - 8 мМ; 7 - 11 мМ; 8 - 15 мМ
Таблица 1. Влияние ионов кадмия на прорастание семян сахарной
свёклы in vitro
Генотип Концентрация Cd(CH3 CO2)2 мМ Количество проростков, %
Всего Выжило
МС-2113 0 80,4 80,4
ОП-14044 78,3 78,3
МС-2113 1 77,7 44,4
ОП-14044 58,3 40,0
МС-2113 2 55,6 33,3
ОП-14044 44,4 37,5
МС-2113 4 52,4 38,1
ОП-14044 54,2 25,0
МС-2113 6 46,7 13,3
ОП-14044 38,9 16,7
МС-2113 8 33,3 8,3
ОП-14044 30,4 8,7
МС-2113 11 13,3 6,7
ОП-14044 11,1 5,6
МС-2113 15 5,5 0
ОП-14044 5,0 0
ТЕХНОЛОГИЯ ВЫСОКИХ УРОЖАЕВ
(2) ПромАсептика
Таблица 2. Повторный отбор регенерантов на селективных средах
с различным содержанием ионов кадмия
Генотип Вариант Концентрация ацетата кадмия, мМ Прирост высоты, % Получено устойчивых, %
МС-2113 Контроль 0 8,1 0
МС-2113 Устойчивое 2 22,0 74,8
МС-2113 Устойчивое 4 18,3 58,3
МС-2113 Устойчивое 6 12,5 34,7
0-10 Контроль 0 9,2 0
0-10 Устойчивое 2 20,2 65,0
0-10 Устойчивое 4 17,5 53,8
0-10 Устойчивое 6 13,6 35,7
ионов металлов и способны снижать их токсическое действие или ликвидировать его последствия. Эти механизмы направлены на выживание растений-регенеран-тов при стрессовых воздействиях.
Поскольку не все отобранные в селективных условиях регене-ранты сохраняют признак устойчивости, после нахождения их в обычных условиях целесообразно проводить повторный отбор на идентичных селективных средах. Повторный отбор полученных в селективных условиях регене-рантов, идентичных первичному отбору (2—6 мМ), показал их высокую адаптивную способность. Количество выживших экземпляров составило от 34,7 до 74,8 % (табл. 2).
Наименьшее количество выживших регенерантов было в более жёстких условиях. Прирост высоты к начальной у устойчивых ре-генерантов варьировал от 12,5 до 22,0 % в отличие от контрольных растений, у которых она была значительно меньше, что в течение 10—25 дней приводило к пожелтению листьев, некрозу точек роста, а в дальнейшем — к гибели микроклонов (рис. 2).
Возможно, что с повышением концентрации кадмия в среде до
определённых критических величин клеточная оболочка перестаёт сдерживать поток токсичных ионов и металл попадает в цито-золь клетки [9]. В цитозоле ионы кадмия связываются различными хелатирующими соединениями, часть из которых в составе комплексов затем удаляется в вакуоль. Ионы кадмия оказывают воздействие на белки — дегидрины [1]. Защитная роль дегидринов состоит в предупреждении коагуляции молекул и поддержании целостности клеточных мембран, что становится особенно актуальным
в условиях осмотического стресса. В связи с этим регенеранты с устойчивостью к ионам кадмия после повторного отбора испытывали в условиях моделирования засухи. Для этого использовали высокие концентрации маннита, так как рост и развитие регене-рантов в таких условиях адекватно указывает на их устойчивость [7]. Результаты исследований показали, что устойчивые к ионам кадмия регенеранты росли в условиях осмотического стресса, где они продемонстрировали высокую толерантность (рис. 3).
Рис. 2. Повторный отбор регенерантов: 1, 2 — контроль; 3, 4 — устойчивые
46 САХАР № 8 • 2021
ПромАсептика @
Рис. 3. Регенеранты сахарной свёклы на питательных средах с различным содержанием маннита: 1 — 0,40 М; 2 — 0,45 М
Выживаемость при этом варьировала от 65 до 70 %. Поэтому можно высказать предположение о системности адаптационных процессов, поддерживающих рост клеток при водном стрессе.
Заключение
Проведённые исследования позволили оптимизировать состав селективной питательной среды для получения регенерантов сахарной свёклы с устойчивостью к ионной токсичности в условиях in vitro. В результате выявлена сублетальная концентрация ацетата кадмия (6 мМ) для отбора устойчивых регенерантов из семян. Повторный отбор в селективных условиях повысил толерантность ре-генерантов к ионному стрессу до 34,7—74,8 %. Регенеранты с ионной устойчивостью к металлам показали высокую толерантность в условиях осмотического стресса 65,0—70 %, что свидетельствовало о комплексной их устойчивости к стрессовым факторам. Получены регенеранты сахарной свёклы с комплексной устойчивостью к стрессам.
Список литературы
1. Аллагулова, Ч.Р. Дегидрины растений: их структура и предполагаемые функции / Ч.Р. Аллагулова, Ф.Р. Гималов, Ф.М. Шаки-
рова, В.А. Вахитов // Биохимия. — 2004. - С. 1157-1165.
2. Гончарук, Е.А. Реакция клеток контрастных по устойчивости сортов льна-долгунца (linum usitatissimum L.) на действие ионов кадмия / Е.А. Гончарук, Н.В. Загоскина // Вюник харювського нащонального аграрного ушвер-ситету. Сер1я бюлоия. — 2016. — Вип. 3 (39). — С. 27—38.
3. Духовский, П. Реакция растений на комплексное воздействие природных и антропогенных стрессов / П. Духовский, Р. Юк-нис, А. Бразайтите, И. Жукау-скайте // Физиология растений. — 2003. — № 2. — С. 165—173.
4. Знаменская, В.В. Микроклонирование in vitro как метод поддержания и размножения линий сахарной свёклы / В.В. Знаменская // Энциклопедия рода Beta: биология, генетика и селекция
свёклы. — Новосибирск, 2010. — С. 420-437.
5. Кошкин, Е.И. Физиология устойчивости сельскохозяйственных растений. Клеточная селекция с ионами тяжёлых металлов: новые аспекты комплексной устойчивости / Е.И. Кошкин // Матер. X Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». — Казань, 2013. — С. 82.
7. Сергеева, Л.Е. Клеточная селекция с ионами тяжёлых металлов для получения генотипов растений с комплексной устойчивостью к абиотическим стрессам / Л.Е. Сергеева, Л.И. Бронникова, Е.Н. Тищенко. — Киев : Логос, 2013. — 211 с.
8. Титов, А.Ф. Устойчивость растений к тяжёлым металлам / А.Ф. Титов, В.В. Таланова, Н.М. Казнина, Г.Ф. Лайдинен / Институт биологии КарНЦ РАН; Карельский научный центр. — Петрозаводск, 2007. — 172 с.
9. Титов, А.Ф. Устойчивость растений к кадмию (на примере семейства злаков) : учеб. пособие / А.Ф. Титов, Н.М. Казнина,
B.В. Таланова. — Петрозаводск, 2012. — 55 с.
10. Щуплецова, О.Н. Повышение устойчивости ячменя к токсичности металлов и осмотическому стрессу путём клеточной селекции / О.Н. Щуплецова, И.Г. Широких // Зерновое хозяйство России. — 2015. — № 1. —
C. 124—135.
Аннотация. Представлены результаты создания в условиях in vitro регенерантов сахарной свёклы c комплексной устойчивостью к ионной токсикации и осмотическому стрессу. Выявлены сублетальные концентрации ацетата кадмия, позволяющие проводить отбор устойчивых регенерантов. Получены устойчивые растения-регенеранты.
Ключевые слова: регенеранты, сахарная свёкла, стресс, адаптация, in vitro, питательная среда, ионная токсичность, маннит, ацетат кадмия. Summary. The results of in vitro creation of sugar beet regenerants with complex resistance to ionic toxicity and osmotic stress are presented. Revealed sublethal concentrations of cadmium acetate, allowing the selection of stable regenerants. Resistant plants-regenerants were obtained.
Keywords: regenerants, sugar beet, stress, adaptation, in vitro, nutrient medium, ionic toxicity, mannitol, cadmium acetate.
№ 8 • 2021 САХАР 47 -
Ферменто-антисептируннцие препараты для сахарного производства
