CC BY
65УДК 633.63: 631.416
doi.org/ 10.24411/2413-5518-2020-10907
Разработка оптимальных условий in Vitro для повышения устойчивости регенерантов сахарной свёклы к засухе
Н.Н. ЧЕРКАСОВА
Т.П. ЖУЖЖАЛОВА, д-р биолог. наук, проф., зав. лаб. культуры тканей и молекулярной биологии О.В.ТКАЧЕНКО
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова» (e-mail: biotechnologiya@ mail.ru)
Введение
Засуха является одним из природных факторов, негативно влияющих на урожай сахарной свёклы. Она наносит растениеводству больший урон, чем все остальные стрессовые факторы, вместе взятые [4]. Для ускорения селекционного процесса применяются биотехнологические подходы, в частности клеточная селекция in vitro. С целью имитации in vitro стрессового эффекта засухи могут быть использованы питательные среды, которые дополнены осмотически активными веществами, понижающими внешний водный потенциал: полиэтленгликолем (ПЭГ), маннитом. Большое значение при проведении экспериментов имеет поиск оптимальной концентрации селективного фактора. Известно, что при слишком высоких дозах селективных агентов клетки культурных растений теряют способность к регенерации растений, а при низких концентрациях растения могут не проявлять устойчивость [1]. В ходе опубликованных
ранее исследований, направленных на получение адаптированных к водному стрессу клеточных линий кукурузы, яровой пшеницы, овса, применяли маннит в разных концентрациях. Чувствительность к манниту клеток сахарной свёклы ранее не исследовали [2, 5, 8, 9]. В связи с этим выбор данного селективного фактора в целях создания растений сахарной свёклы, толерантных к недостатку влаги, является актуальным.
Цель работы заключалась в использовании селективной системы с применением маннита для создания засухоустойчивых растений сахарной свёклы. Непосредственной задачей явилось определение чувствительности клеток сахарной свёклы к осмоти-ку и выбор концентрации маннита с целью отбора устойчивых форм. Научные исследования выполнены на базе лаборатории культуры тканей и молекулярной биологии ФГБНУ ВНИИСС им. А.Л. Мазлумова с использованием биотехнологических методов культуры
in vitro [3]. Исходным материалом в опытах служили компоненты гибридов сахарной свёклы Рамон-ской селекции. В качестве экс-плантов использовали микроклоны, зрелые зародыши семян. Для моделирования засухи к основной среде добавляли маннит в различной концентрации (0,25—0,70 M).
При концентрации маннита от 0,25 до 0,35 М было заметно небольшое снижение роста микроклонов, пожелтение листьев. Выживаемость при этом составила 65-79 % (табл. 1).
Увеличение концентрации ман-нита в питательной среде до 0,400,45 М вызывало снижение роста, пожелтение листьев. Однако точки роста оставались живыми и сохраняли способность к регенерации. Количество выживших микроклонов варьировало от 47 до 52 %.
На средах с концентрацией селективного агента 0,50 и 0,60 М было выявлено более выраженное угнетение роста. Отмечался некроз листьев, что приводило к массовой гибели регенерантов (рис. 1).
Рис. 1. Микроклоны сахарной свёклы в питательных средах с различным содержанием маннита (М): 1 - 0; 2 - 0,25; 3 - 0,30; 4- 0,35; 5- 0,40; 6- 0,45; 7- 0,50
По-видимому, действие маннита приводило к снижению тургора листьев, изменению коллоидно-химических свойств цитоплазмы клеток (вязкость, эластичность) и проницаемости клеточных мембран. Эти изменения неблагоприятно отражались на процессе роста растений, замедляя его [7, 10].
Использование в качестве экс-плантов зрелых зародышей семян показало снижение их всхожести при увеличении селективной нагрузки. В начальной фазе развития отмечалось прорастание на всех вариантах питательных сред. В дальнейшем рост проростков и выживаемость снижались при увеличении селективной нагрузки. Так, небольшая концентрация маннита (0,25—0,30 М) в большинстве случаев не вызывала значимых изменений активности ростовых процессов в сравнении с контрольными условиями. При этом всхожесть составила 50—71,5 %, выживаемость — 25,0—42,9 % в зависимости от генотипа (табл. 2).
При высоких концентрациях (0,60—0,70 М) маннита наблюдалось стабильное подавление регенерации, проростки темнели, имели стекловидный стебель, подвергавшийся некрозу, листья становились мельче. Стабильное подавление регенерации приводило к гибели проростков (рис. 2).
Оптимальной оказалась среда с содержанием селективного агента 0,45—0,50 М, где выживаемость варьировала от 5,0 до 18,2 % в зависимости от генотипа. Получение регенерантов в более жёстких
Таблица 1. Ростовые свойства микроклонов сахарной свёклы под влиянием
маннита в питательной среде
Генотип Концентрация маннита, М Начальная высота, см Прирост высоты Выживаемость, %
См %
МС-2113 0 2,5±0,75 1,1±0,17 44,0 88,0
0П-14044 2,2±0,67 0,9±0,15 40,9 90,0
МС-2113 0,25 2,53±0,88 0,50±0,15 21,69 75,0
0П-14044 3,31±0,43 0,48±0,15 15,27 79,0
МС-2113 0,30 3,14±0,42 0,31±0,18 15,48 70,0
ОП-14044 4,22±0,3 0,54±0,13 13,59 72,0
МС-2113 0,35 3,28±0,75 0,35±0,25 11,76 65,0
ОП-14044 3,82±1,2 0,38±0,28 11,46 68,0
МС-2113 0,40 2,46±0,45 0,17±0,70 6,7 51,0
ОП-14044 3,30±0,65 0,22±0,15 4,99 52,0
МС-2113 0,45 2,98±0,38 0,23±0,30 5,5 48,0
ОП-14044 3,59±0,75 0,18±0,18 3,31 47,0
МС-2113 0,50 2,9±0,55 0 0 0
ОП-14044 3,73±0,6 0 0 0
МС-2113 0,60 2,53±0,6 0 0 0
ОП-14044 2,43±0,52 0 0 0
Таблица 2. Влияние маннита на прорастание зрелых зародышей семян
сахарной свёклы
Генотип Концентрация маннита, М Количество регенерантов, %
Проросло Выжило
МС-2113 0 87,4 87,4
ОП-10 74,3 74,4
МС-2113 0,25 66,7 25,0
ОП-10 55,6 42,3
МС-2113 0,30 66,3 33,3
ОП-10 71,5 42,9
МС-2113 0,35 53,3 40,0
ОП-10 50,0 33,3
МС-2113 0,40 31,6 18,7
ОП-10 41,0 20,8
МС-2113 0,45 37,5 10,0
ОП-10 45,5 18,2
МС-2113 0,50 28,3 0
ОП-10 32,5 5,0
МС-2113 0,60 3,5 0
ОП-10 6,6 0
■Г
1
4
Рис. 2. Прорастание семян сахарной свёклы в селективных условиях с применением маннита в разных концентрациях (М): 1- 0,25; 2 - 0,30; 3 - 0,40; 4 - 0,45; 5 - 0,50; 6- 0,70
№ 9 • 2020 САХАР 51
условиях (при концентрации ман-нита 045-0,50 М), по-видимому, было обусловлено содержанием питательных веществ в зародыше семени, которые участвуют в регуляции метаболических процессов при прорастании [6].
На основании полученных результатов в целях отбора осмоу-стойчивых растений-регенерантов сахарной свёклы была выбрана оптимальная концентрация манни-та, равная 0,40-0,45 М для микроклонов и 0,45-0,50 — для семян.
Проведённые исследования позволили оптимизировать состав селективной питательной среды с целью получения регенерантов сахарной свёклы с устойчивостью к засухе в условиях in vitro. Выявлена сублетальная доза маннита (0,40-0,45 М) для отбора устойчивых к засухе регенерантов из микроклонов. Как оптимальная для отбора устойчивых регенерантов из зрелых зародышей семян определена концентрация 0,45-0,50 М. Исследования показали, что зрелые зародыши семян оказались наиболее устойчивы к действию маннита, выживаемость при этом варьировала от 5,0 до 18,0 %. Выявлены оптимальные условия селективной системы в целях отбора устойчивых к засухе регенерантов сахарной свёклы, которые будут использованы в селекционном процессе при создании линий.
Заключение
В результате проведённой работы методом клеточной селекции были получены растения сахарной свёклы, которые по физиологическим показателям и интенсивности роста имели более высокую устойчивость к засухе, чем исходные. Это свидетельствует о возможности использования селективной системы с применением маннита для отбора толерантных
к дефициту воды линий сахарной свёклы.
Список литературы
1. Аль-Холани, Х.А. Определение концентрации маннита для использования в процессе клеточной селекции на устойчивость к засухе у кукурузы / Х.А. Аль-Холани, Ю.И. Долгих // Вестник РУДН. -Сер. Агрономия и животноводство. - 2007. - № 1-2. - C. 38-42.
2. Аль-Холани, Х.А. Получение растений кукурузы с повышенной устойчивостью к засухе путём клеточной селекции на среде с маннитом / Х.А. Аль-Холани,
B.И.М. Тайма, Ю.И. Долгих // Биотехнология. - 2010. - № 1. -
C. 60-67.
3. Знаменская, В.В. Микроклонирование invitro как метод поддержания и размножения линий сахарной свёклы / В.В. Знаменская // Энциклопедия рода Beta: биология, генетика и селекция свёклы. -Новосибирск, 2010. - С. 420-437.
4. Кошкин, Е.И. Физиология устойчивости сельскохозяйственных культур : учеб. для вузов / Е.И. Кошкин. - М. : ДРОФА, 2010. - 638 с.
5. Ступко, В.Ю. Подбор условий для создания стрессоустойчивых
форм мягкой яровой пшеницы in vitro / В.Ю. Ступко, Н.В. Зо-бова, Н.А. Сурин // Сиб. вестн. с/х. наук. - 2008. - № 6 (168). -С. 20-26.
6. Титок, В.В. Биоэнергетическая концепция гетерозиса / В.В. Титок // Доклады Национальной академии наук Беларуси. - 2003. -47, 4. - С. 84-89.
7. Шакирова, Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторами её регуляция / Ф.М. Шакирова. - Уфа : Гилем, 2001. - 160 с.
8. Широких, И.Г. Изучение реге-нерантов овса, полученных в селективных системах с алюминием и полиэтиленгликолем / И.Г. Широких, С.Ю. Огородникова, Р.И. Абубакирова // Агрохимия. -2010. - № 10. - С. 38-43.
9. Щуплецова, О.Н. Повышение устойчивости ячменя к токсичности металлов и осмотическому стрессу путём клеточной селекции / О.Н. Щуплецова, И.Г. Широких // Зерновое хозяйство России. - 2015. - № 1. - С. 124-135.
10. Чиркова, Т.В. Физиологические основы устойчивости растений // Учеб. пособие студентов биологических вузов / Т.В. Чиркова. - СПб. : СПбГУ, 2002. - 244 с.
Аннотация. Выявлены оптимальные концентрации маннита в селективной питательной среде для получения in vitro устойчивых регенерантов сахарной свёклы к засухе. Показана наиболее высокая регенерационная способность зрелых зародышей семян в селективных условиях.
Ключевые слова: стресс, растения-регенеранты, in vitro, маннит, селективная питательная среда, сахарная свёкла, засуха. Summary. The optimal concentrations of mannitol in a selective nutrient medium for obtaining in vitro resistant sugar beet regenerants to drought are revealed. The highest regenerative ability of mature seed embryos under selective conditions is shown.
Keywords: stress, regenerant plants, in vitro, mannitol, selective nutrient medium, sugar beet, drought.
