CC BY
27УДК 633.63: 631.416
Создание растений-регенерантов сахарной свёклы, устойчивых к комплексу стрессовых факторов
H.H. ЧЕРКАСОВА,
Т.П. ЖУЖЖАЛОВА, д-р биолог. наук, проф. Е.О. КОЛЕСНИКОВА, канд. биолог. наук
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова» (е-mail: biotechnologiya@mail.ru)
Введение. Постоянное изменение природных условий и воздействие антропогенных факторов приводят к изменению физико-химических свойств даже высокобуферных чернозёмов и часто вызывают изменение ППК, подкисляя или подщелачивая почвы, что губительно сказывается на растениях [6]. Неблагоприятные для растений последствия усугубляются в течение вегетационного периода, в условиях неравномерного выпадения осадков на фоне повышения среднемесячных температур. Усиление абиотического давления окружающей среды расширяет спектр стрессовых поражений растений [1, 2]. В связи с этим особое значение приобретает создание растений сахарной свёклы с высокими адаптивными реакциями, обеспечивающими комплексную устойчивость к кислотности среды и дефициту влаги (осмотическому стрессу), что позволит существенно увеличить урожайность [9]. Одним из перспективных направлений улучшения адаптивных свойств растений является клеточная селекция. Моделирование воздействий абиотических факторов (селективные агенты) на культивирование in vitro органов и тканей позволяет создавать растения, устойчивые к кислотности почв и засухе [4, 5].
Цель исследований заключалась в получении расте-ний-регенерантов сахарной свёклы с устойчивостью к засухе и кислотности почв.
Материалы и методы исследования. Материалом исследований служили генотипы сахарной свёклы 09001-МС; 09002-0п; 09003-0п; 09005-0пм лаборатории исходного материала ФГБНУ ВНИИСС им. А.Л. Мазлумова. Индукция регенерации проводилась на питательных средах В5 и MS, дополненных необходимыми регуляторами роста (БАП, кинетин, ИУК, ГК, НУК). Культивирование растений осуществлялось при температуре 26 оС, 16-часовом фотопериоде с освещённостью 5 тыс. люкс и относительной влажностью воздуха 70 % [3]. Семена предварительно очищали от перикарпа и обеззараживали 10%-ным хлорамином «Б» в те-
чение 1 ч. Для моделирования засухи использовали сорбит 0,40—0,45М (неионный и неметаболизируе-мый осмотик), кислотности — подкисленную питательную среду до рН 4,0.
Результаты исследований и обсуждения. Проведённые исследования позволили выявить устойчивость микроклонов сахарной свёклы к воздействию селективных агентов, моделирующих засуху и кислотность. Так, при содержании сорбита в концентрации 0,30 М в питательной среде и незначительном повышении кислотности (рН 5—4,5) микроклоны сахарной свёклы начинали ощущать действие стрессового фактора; наблюдалось пожелтение боковых листьев, отставание в росте при сохранении жизнеспособности. При увеличении содержания сорбита до 0,40—0,45 М, а кислотности среды до рН 4,0 наблюдалось сильное угнетение роста, не приводящее к полной гибели растений; происходил некроз боковых листьев, но точка роста оставалась зелёной.
Снижение рН питательной среды до 3,5 при той же концентрации сорбита (0,40—0,45 М) приводило к полной гибели растений.
Таким образом, питательная среда с содержанием сорбита 0,40—0,45 М при рН 4,0 явилась сублетальной для микроклонов сахарной свёклы и в дальнейшем была использована нами для отбора устойчивых регенерантов. Исследования показали, что прорастание семян при данной концентрации осмотического компонента варьировало от 14,3 до 35,5 %, выживаемость регенерантов составила от 7,3 до 13,5 %. Для создания более жёстких условий отбора была повышена кислотность питательной среды путём добавления 0,1 н соляной кислоты. Так, изменение рН питательной среды до 3,3 при содержании сорбита 0,45 М оказывало губительное воздействие на прорастание семян сахарной свёклы, которое составило 2,5—3,0 % (табл. 1).
При дальнейшем развитии проростков наблюдалось полное замедление ростовых процессов и гибель регенерантов. Оптимальной явилась среда с содержа- 28 САХАР № 5 • 2018
ЩЕЛКОВО ТШ1Т1111 ЛШ1 НКР Для борьбы с широким спектром болезней зерновых, рапса,
I VII УЛ ИНГ подсолнечника, сахарной свеклы и гороха
АГРПУ1/1М 1 Л1 Ж« М®иииии подсолнечника, сахарной свеклы и гороха
. 200 г/л пропиконазола + 200 г/л тебуконазола ~/и/ЛУЛЬИОв
россиискии аргумент защиты • г • г ^ ^ ^ ^./; ^ ^
нием сорбита 0,45 М и рН 3,5, где у всех генотипов наблюдалось прорастание семян в среднем 7,3—8,6 %, а выживаемость регенерантов варьировала от 3,7 до 4,3 %, при сохранении регенерационной способности (рис. 1).
Получение регенерантов в более жёстких условиях (концентрация сорбита 0,45 М, рН 3,5) по-видимому, было обусловлено содержанием питательных веществ в зародыше семени, которые участвуют в регуляции метаболических процессов при прорастании [8].
Для повышения регенерационной способности в селективные среды вводили БАП-6, который принимает активное участие в физиологических реакциях, связанных с активацией работы белоксинтезиру-ющего аппарата клеток. В этом случае гормон стимулирует работу аппарата биосинтеза белка и создаёт благоприятную внутриклеточную обстановку для биосинтеза адаптивных белков [7].
Было установлено, что селективная питательная среда (рН 3,5, содержание сорбита 0,45 М) с добавлением БАП-6 в концентрации 0,2 мг/л способствовала увеличению активности прорастания семян до трёх раз, что составило 15,0—22,7 % (табл. 2).
Выживаемость регенерантов при этом варьировала от 6,0 до 8,6 %, что в 1,6—2,3 раза превышало контроль. При повышении содержания гормона БАП до 1,0 мг/л количество проросших семян также увеличивалось, но в дальнейшем наблюдалось подавление ростовых процессов, при этом выживаемость варьировала от 3,2 до 0 % в зависимости от генотипа (рис. 2).
Таблица 2. Влияние БАП-6 на эффективность прорастания
семян в селективных условиях
Генотип Содержание БАП, мг/л Количество регенерантов, %
Проросло Выжило
09001МС 0 контроль 7,6 3,8
090020n-1 7,8 3,9
090030п 8,6 4,3
090050nM 7,3 3,7
09001МС 0,2 15,0 6,0
090020n-1 16,4 6,4
090030п 22,7 8,6
090050nM 22,5 8,5
09001МС 0,5 17,6 6,2
090020n-1 17,3 6,3
090030п 20,7 8,0
090050nM 21,1 7,0
09001МС 1,0 14,3 3,2
090020n-1 11,4 0
090030п 12,0 2,9
090050nM 9,9 0
Вероятно, в жёстких селективных условиях этот гормон стимулировал прорастание семян за счёт усиления защитных свойств клеточных тканей, что по-
Рис. 1. Влияние селективных условий на регенерационную способность семян сахарной свёклы: № 1 — рН 3,3, сорбит 0,45М; № 2 - рН 3,5, сорбит 0,45М_
Таблица 1. Влияние селективных условий in vitro на прорастание семян сахарной свёклы
Генотип Значение кислотности Содержание сорбита, М Количество регенерантов, %
Проросло Выжило
09001МС 4,0 0,45 14,3 7,9
090020П-1 15,2 8,5
090030П 14,4 7,4
09005 0ПМ 18,1 9,9
09001МС 4,0 0,40 32,0 12,0
090020П-1 28,6 10,7
090030П 30,0 11,0
09005 0ПМ 35,5 13,2
09001МС 3,5 0,40 14,7 7,4
090020П-1 14,1 7,7
090030П 15,6 8,6
09005 0ПМ 13,8 7,0
09001МС 3,5 0,45 7,6 3,8
090020П-1 7,8 3,9
090030П 8,6 4,3
090050ПМ 7,3 3,7
09001МС 3,3 0,45 3,0 0
090020П-1 2,5 0
090030П 2,6 0
090050ПМ 2,8 0
Рис. 2. Микроклоны при различном содержании гормона БАП: № 1- 0,2 мг/л; № 2 - 1,0 мг/л_
№ 5 • 2018 САХАР 29
СИСТЕМА УПРАВЛЕНИЯ ВЕГЕТАЦИЕЙ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ: эффективные ХСЗР, [g] ЩЕЛКОВО
W V^ агрохимикаты, высококачественные семена, полный цикл агросопровождения агрохим
controlled vegetation system WWW. beta ГЁ П. I'll
вышало устойчивость растений к действию стрессовых факторов.
Таким образом, в результате исследований была выявлена оптимальная селективная питательная среда с содержанием сорбита 0,45 М при рН 3,5 и БАП-0,2 мг/л, где у всех генотипов наблюдалось прорастание семян от 15,0 до 22,7 % и сохранялась реге-нерационная способность проростков. Повторное культивирование их в селективных условиях показало высокую толерантность к эдафическим стрессам, при этом количество устойчивых регенерантов варьировало от 58,0 до 73,5 % (табл. 3).
Микроклоны хорошо развивались в селективных условиях, что сопровождалось образованием нормальных черешковых листьев с цельной пластинкой, тупой верхушкой и клиновидным основанием, сбегающим по черешку (рис. 3).
Результаты экспериментов позволили отобрать около 200 микроклонов (09001-МС; 09002-0П; 09003-0П; 09005-0ПМ), которые будут использованы для создания устойчивых линий сахарной свёклы.
Заключение. На основании исследований был оптимизирован состав питательных сред, обеспечивающий успех культивирования регенерантов сахарной свёклы в стрессовых условиях in vitro. Была выявлена оптимальная селективная среда с содержанием сорбита 0,45 М при рН 3,5, где у всех генотипов наблюдалось прорастание семян и сохранялась регенерацион-ная способность. Повторное индуцирование устойчивости в селективных условиях показало высокую толерантность растений к эдафическим стрессам, при этом количество устойчивых микроклонов варьировало от 58,0 до 73,5 %. Это позволило отобрать устойчивые регенеранты с высокой адаптационной и регенерационной способностью, которые в дальнейшем будут использованы в селекции для создания линий с повышенной устойчивостью к абиотическим факторам среды. Результаты проведённых биотехнологических экспериментов имеют научное и практическое значение для селекции сахарной свёклы.
Список литературы
1. Зайова, Е.Г. Използване на in vitro методи за отбор на форми захарно цвёкло, устойчиви на неблагоприятни условия: автореф. дис. ... д-ра биолог. наук / Е.Г. Зайова. — София, 2003. — 40 с.
2. Зобова, Н.В. Повышение устойчивости ячменя к стрессовым биотическим и абиотическим факторам в Сибири: автореф. дис. . д-ра с/х наук / Н.В. Зобова. — Красноярск, 2009. — 66 с.
Таблица 3. Повторный отбор регенерантов сахарной свёклы в селективных условиях эдафического стресса
Генотип Количество устойчивых регенерантов, %
Кислотность рН 4,0 Засуха (сорбит) Засуха + кислотность
09001МС 60,6 61,7 60,0
090020n-1 63,0 58,0 58,0
090030П 69,3 70,5 62,0
090050ПМ 72,0 73,5 66,0
Рис. 3. Регенеранты, устойчивые к эдафическому стрессу
3. Знаменская, В.В. Микроклональное размножение сахарной свёклы: методические рекомендации / В.В. Знаменская, Т.П. Жуж-жалова. — Воронеж, 1995. — 23 с.
4. Конышева, Е.Н. Использование биотехнологических методов в повышении соле- и кислотоустойчивости ярового ячменя: автореф. дис. ... канд. биолог. наук / Е.Н. Конышева. — Красноярск, 2004. - 20 с.
5. Косарева, И.А. Изучение коллекции сельскохозяйственных культур и диких родичей по признакам устойчивости к токсическим элементам кислых почв / И.А. Косарева // Доклады РАСХН. — 2012. — Т. 170. — С. 35—45.
6. Кураков, В.И. Влияние длительного применения удобрений на изменение агрохимических показателей чернозёма выщелоченного и продуктивность сахарной свёклы в севообороте / В.И. Кураков, Е.В. Попов, М.М. Жуков // Материалы Международной научной конференции. — Воронеж : ВГУ, 2004. — С. 463—460.
7. Таланова, В.В. Фитогормоны как регуляторы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды: автореф. дис. ... д-ра биолог. наук / В.В. Таланова. — Петрозаводск, 2009. — 44 с.
8. Титок, В.В. Биоэнергетическая концепция гетерозиса / В.В. Титок // Доклады Национальной академии наук Беларуси. — 2003. — Т. 47. — № 4. — С. 84—89.
9. Щуплецова, О.Н. Совершенствование и применение метода культуры ткани для получения форм ярового ячменя, устойчивых к кислым почвам: автореф. ... дис. канд. биолог. наук / О.Н. Щуплецова. — М., 2003. — 20 с.
Аннотация. Представлены результаты создания растений-регенерантов сахарной свёклы с устойчивостью к засухе и кислотности среды на основе селективного отбора in vitro. Выявлены оптимальные концентрации селективных агентов для отбора устойчивых регенерантов (сорбит, 0,40-0,45М при рН 4,0). Отобраны устойчивые регенеранты. Ключевые слова: стресс, растения-регенеранты, in vitro, сорбит, селективная питательная среда, засуха, кислотность, сахарная свёкла.
Summary. The results of obtaining sugar beet plants-regenerants with resistance to drought and environment acidity based on in vitro selection are presented. Optimal concentrations of selective agents to select resistant regenerants (sorbite, 0,40-0,45М with рН 4,0) have been revealed. The resistant regenerants havebeen selected. Keywords: stress, plants-regenerants, in vitro, sorbite, selective nutrient medium, drought, acidity, sugar beet.
30 САХАР № 5 • 2018
ЩЕЛКОВО ТШ1Т1111 ЛШ1 ННР Для борьбы с широким спектром болезней зерновых, рапса,
I VII УЛ ИНГ подсолнечника, сахарной свеклы и гороха
АГРПУ1/1М 1 Л1 Ж« М®иииии подсолнечника, сахарной свеклы и гороха
. 200 г/л пропиконазола + 200 г/л тебуконазола ~/и/ЛУЛЬИс)в
россиискии аргумент защиты • г • г -> ^-1 ^ 1 л ^ ^ >
