CC BY
49
УДК 557.21:579.834.114:616.98-07
И.А. Лавриненко
СОЗДАНИЕ ПЛАЗМИДЫ рЯАИ ДЛЯ ОЦЕНКИ АЛКИЛИРУЮЩЕГО ПОВРЕЖДЕНИЯ КСЕНОБИОТИКАМИ ГЕНОМА КЛЕТКИ
ГУ НИИ биохимии СО РАМН, Новосибирск
В настоящее время проблема мониторинга токсического воздействия компонентов ракетного топлива на окружающую среду актуальна для США, России, Франции, Китая и других стран, использующих 1,1-диметилгидразин (гептил) при запуске тяжелых ракетоносителей. Необходимо оценить воздействие 1,1 -диметилгидразина, приводящих к метилированию оснований ДНК, особенно в области промоторов, что может приводить к значительному изменению активности генов и канцерогенезу. Целью настоящей работы является создание генно-инженер-ными методами плазмиды, которая могла бы служить основой биосенсорной детекции метилирующих воздействий гептила на ДНК живой клетки. В работе использовали плазмиду рИАСЗ, ранее сконструированную в нашей лаборатории и клетки Е. соН штамм МКХХЬ-Ыие. Эти клетки были трансформированы плазмидой рЯЛО, сконструированной в ходе настоящей работы. В данную плазмиду было необходимо клонировать область я^я-промотора и под управление этого промотора ген репортерного белка С/р. Проверка наличия вставки белков б/р и промотора а<1а было проведено с помощью рестрикции и амплификации целевых геномных последовательностей в полученной плазмидерЯЛО и показало их наличие в полученной плазмиде. Таким образом, была получена генетическая конструкция, которую необходимо проверить на пригодность выявления гептила и его производных в окружающей среде.
Ключевые слова: гептил, Е. соН, биосенсор, я^я-промотор, репортерный белок С]р
В настоящее время проблема мониторинга токсического воздействия компонентов ракетного топлива на окружающую среду актуальна для США, России, Франции, Китая и других стран, использующих 1,1-диметилгидразин [гептил] при запуске тяжелых ракетоносителей. В связи с этим данная проблема неоднократно обсуждалась на конференциях ООН по окружающей среде [1, 2]. Достоверно установлено, что компоненты ракетного топлива обладают выраженным токсическим и канцерогенным воздействием на организм человека и животных [3-7]. Необходимо, в частности, оценить метилирование оснований ДНК, вызываемое 1,1-диметилгидразином (особенно в области промоторов), что может приводить к значительному изменению активности генов и канцерогенезу [8-10]. Как известно, метилирование оснований и сахарофосфатного остова ДНК репарируется рядом систем [11]. Известным примером являются бактерии Е. соН, обладающие различными системами репарации. Один из белков адаптивной системы репарации — алкилтрансфе-раза ogt, синтезируется конститутивно, а другая алкилтрансфераза а(1а является индуцируемой [8-11]. Этот репарационный ответ существенно отличается от БОЗ-репарационного ответа, так как он не приводит к активации гесА 505 системы репарации.
Целью настоящей работы является создание генно-инженерными методами плазмиды, которая могла бы служить основой биосенсорной детекции алкилирующих воздействий гептила на ДНК живой клетки.
Материалы и методы
В работе использовали в качестве исходной плазмиду рКАСЗ и клетки Е. соН штамм МКХ ХЬ-Ыие. Эти клетки были трансформированы плазмидой р.&4Д сконструированной в ходе настоящей работы. В работе использовали ферменты рестрикции производства фирмы «Сибэнзим» [Новосибирск, Россия]. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции и лигирование Т4 ДНК-ли-газой проводили согласно инструкциям фирмы-изготовителя ферментов.
Для проведения ПЦР использовали ампли-фикатор МС-2 [«ДНК-технология», Москва]. Реакцию проводили в пластиковых пробирках объемом 0,5 мл («£)8Р», иБА). Объем реакционной смеси в одной пробирке составлял 50 мкл. ПЦР проводили в режиме активного регулирования температуры реакционной смеси. Ампликоны гидролизовали рестриктазами, очищали фенол-хлороформной экстракцией.
Плазмиды ДНК рЛАСЗ и рНАО гидролизовали рестриктазами АаШ, М£е1, ЕсоШ, ХЬо I. Линейную форму плазмидной ДНК отделяли от
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №5 (127), 2007 г.
69
продуктов гидролиза в 0,8% агарозном геле. Необходимый фрагмент плазмидной ДНК вырезали из агарозного геля и растворяли в равном объеме раствора, содержащего КаСЮ и ЭДТА в следующих концентрациях 8 М КаСЮ4, 2мМ ЭДТА, pH раствора 7,0. Раствор остужали до комнатной температуры и вносили в него «силику» (мелкодисперсный оксид кремния) в количестве, достаточном для связывания 3-кратного количества ДНК по отношению к тому ее количеству, которое находится в вырезанной полоске геля. Содержимое пробирки инкубировали в течение 15 мин. После сорбции ДНК силику осаждали центрифугированием в течение 15-20 сек. при 10000g. Осадок силики с сорбированной ДНК дважды промывали раствором, содержащим №С104 и ЭДТА [4 М №СЮ4, 1мМ ЭДТА, pH 7,0]. Для освобождения осадка силики от КаС104 осадок дважды промывали 70% этанолом, затем обезвоживали 96% этанолом и высушивали. Сорбированную на силике ДНК элюировали 50 мкл би-дистиллированной воды, инкубируя суспензию в термостате в течение 10 мин при 50 °С. После осаждения силики центрифугированием при 10000g в течение 2 мин. в растворе оказывалось около 70% исходной ДНК, не содержащей примесей в виде моно- или олигонуклеотидов.
Очищенные фрагменты плазмидной ДНК [без фрагментов АаИ — М£е1 или ХЬо 1-ЕсоШ] лигировали с предварительно обработанными данными рестриктазами фрагментом я^а-промотора или геном @/р. Лигирование проводили с помощью ДНК-лигазы Т4 бактериофага. На завершающем этапе лигазной смесью трансформировали клетки Е. соИ шт. МНХХЬ-Ыие.
Трансформацию клеток Е. соИ рекомбинантной плазмидной ДНК проводили с помощью электропора-тора в соответствии с руководством фирмы-производителя прибора — «PeqLab, Вю1есЬпо^1е СтЬН».
После электропорации трансформированные клетки быстро переносили в 1 мл среды ЛБ [Луриа-
Бертани], не содержащей антибиотики, и инкубировали течение 1 час при 37 °С. Подращенные трансформировании клетки концентрировали центрифугированием при 10000g течение 1 мин. на настольной центрифуге Весктап и рассевал на агаризованной среде ЛБ с ампициллином в концентраци 100 мкг/мл. Чашки инкубировали при 37 ° С до образовани колоний размером 0,5-1 мм в диаметре.
Часть выросших клонов клеток Е. соИ была проанализирс вана с помощью ПЦР с праймерами РШ49 иРШ50 на наличи в составе рекомбинантной плазмиды рЛАО структурной част гена ^р и с праймерами 252Е и 25311 на наличие вставки фра] мента ай?а-промотора. По размерам амплифицируемого фра1 мента [примерно 600 п.о.] судили о правильном клонировани фрагмента ДНК в плазмиду рЯАО.
Результаты и их обсуждение
Как известно, многие продукты трансформации гептила почве и воде являются активными алкилирующими соедине ниями, в ряде случаев более активными, чем гептил. На рис. представлена схема соединений, которые образуются из гепти ла в окружающей среде. Создание биосенсорной системы дл оценки метилирующей модификации ДНК клетки гептилом его производными поэтому является актуальной задачей.
аммиак
ЫН}
синильная » формальдегид
кислота |
метил 1,1,4,4-тетраметиптетразен N-нитрозодиметиламин
Рис. 1. Метаболизм 1,1 -диметилгидразина [ гептила] в воде и почв
В качестве основы для получения биосенсора, позволяю щего оценить метилирующее воздействие гептила, в работе ис пользовали ранее полученную в нашей лаборатории плазмид; pRAC3. Генетическая карта плазмиды pRAC3, из которой нам] получена целевая плазмида pRAD, представлена на рисунке 2.
В данную плазмиду необходимо клонировать область ada промотора и под контроль этого промотора ген репортерноп белка Gfp. Область <м?а-промотора [промотор + UP-подобньп энхансер] гена ada была получена амплификацией ДНК /:. col штамм MRX XL-blue с помощью праймеров P252F и P253R На 5/ — конце праймера P252F была предусмотрена последо вательность для сайта Aatll, а также последовательность CAT для обеспечения лучшей рестрикции по данному сайту. Н; 57-конце праймера P253R предусмотрена последовательност] для сайта Mfel и дополнительная последовательность СТТ дл; обеспечения оптимальной рестрикции ампликонов по этом’ сайту.
Promoter гесА
SD
Enhancer
Его RI (170)
Рис 2. Генетическая карта плазмидыpRAC3
Праймеры для встройки промотора ас1а из Е. соН штамм МКХХЬ-Ыие по сайтам АаШ и М£е1 имели следующие характеристики:
Р252-Р:
З’-САТСАСОГСТГСССССССААССССТССС-З’
АаШ
Тт2оопм (без сайта АаН) = 76.04 °С;
Тт2о„пм (с сайтом АаШ) = 83.69 °С;
е1гаМ = 2927001/то1; Е=15,0 Ои: С = 51.0 рМо1/р1
Р253-К:
5’-СТТСААГЩСССТТТАСССТССССССТСАСС-3’
ММ
Тт200|1М (без сайта М^е1) = 73.74 °С Тт200пм (с сайтом М£е1) = 78.85 °С;
Б1тМ = 2957001/то1; Е=19,4 Ои; С = 65,6 РМо1/ц1
Постановка ПЦР на ДНК Е. соН МЯХ осу-
ществлялась с применением РЬг-Состав реакционной смеси в представлен ниже: полимеразы: объеме 50 мкл
Компонент Объемы
ДНК (1 мкг/мкл) 0,5 мкг
Минеральное масло 30 мкл
Те^ буфер х10 5 мкл
Р252-Р (4 ршо1/мкл) 2,5 мкл
Р253-11 (4 рто1/мкл) 2,5 мкл
МйС1, 10 мМ 5 мкл
dNTP по 1мМ каждого 2,5 мкл
Р^! полим. 1 ед/мкл 2 мкл
Температурный режим ПЦР для промотора регуляторной области [промотор + иР-подобный энхансер] гена а(1а Е. соН МКХ ХЬ-Ыие:
1.73 "С 10 сек;
2. 96 °С, 1 мин; 74 °С, 1 мин; 72 °С, 30 сек — 1 цикл;
3. 96 °С, 30 сек; 74 °С, 30 сек; 72 °С, 30 сек - 5 циклов;
4. 96 °С, 30 сек; 79 °С, 30 сек; 72 °С, 30 сек — 24 цикла;
5. 96 °С, 30 сек; 79 °С, 2 мин; 72 °С, 5 мин — 1 цикл.
В качестве источника гена gfp из медузы Aequorea victoria служила плазмида pGreenTIR. Ген GFP амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции. Для амплификации структурной области мутантного гена gfp, использовали праймеры PR149Fh PR262R.
Нуклеотидные последовательности данных праймеров;
Праймер PR149F
5’-ATGAATTCTATGAGT AAAGGAGAAGAACTT-3’;
Праймер PR262R
5’-GCGCTCGAGTTTGTATAGTTCATCCATGC-3’
На 5’-конце праймера PR149F был предусмотрен сайт узнавания рестриктазой EcoRI, а на 5’-конце праймера PR262R был предусмотрен сайт узнавания рестриктазой Xho I, а также последовательности, обеспечивающие лучшую рестрикцию рестриктазами EcoRI и Xho I.
1 этап: денатурация ДНК при 94 °С 30 сек.; отжиг праймеров с ДНК при 52 °С 30 сек.; синтез цепи ДНК при 72 °С 90 сек.; количество циклов -5.
2 этап: денатурация ДНК при 94 °С 30 сек.; отжиг праймеров с ДНК при 62 °С 30 сек.; синтез цепи ДНК при 72 °С 90 сек.; количество циклов -30.
Проверка наличия вставки белков GFP и промотора ada проводилась с помощью рестрикции целевых геномных последовательностей в полученной плазмиде pRAD и показало их наличие в полученной плазмиде (Рис. 3,4) .
Таким образом, получена генетическая конструкция, которую необходимо проверить на пригодность выявления гептила и его производных в окружающей среде. Это будет являться задачей следующей работы.
CREATION OF PLASMID pRAD FOR AN ESTIMATION OF ALKILATING DAMAGES BY XENOBIOTICS OF CELLS GENOME
I.A. Lavrinenko
Now the problem of rocket fuel toxic influence on an environment is actual for USA, Russia, France, China and other countries using 1,1-dimethylhydra-zine (heptyl) at start heavy carrier rocket. It is necessary to estimate influence of 1, 1-dimethylhydrazine resulting in the methylation of DNA bases,especially in area promoters that can result in significant change of activity of genes and carcinogenesis. The purpose
12 3 4 5 6 7
Рис. 3. Амплификация плазмиды pRAD на наличие вставки ada-промотори 1 — дорожка Маркер ( к/ Hind III);
2-7 дорожки — ампликоны a da
of the present work is creation by genetic-engineering methods of the plasmid which could form a basis of heptyl influences on DNA an alive cell. In work used plasmidpRAC3, earlier designed in our laboratory and cells E. coli str. MRXXL-blue. These cells were transformed bv plasmid pRAD, designed during the present work. In given plasmid it was necessary to clone area ««fa-promoter and under management of it promoter a gene of reporter protein Gfp. Stock-taking of protein Gfp insert and promoter ada it was carried out with the help genetic engineering of restriction and amplifications target genomic sequences in received plasmid pRAD and luts shown their presence in received plasmid. Thus, the genetic design which is necessary for checking up on suitability of heptyl revealing and its derivatives in an environment was received.
Литература
1. Разработка системы экологического мониторинга токсичных азотсодержащих органических соединении н воздушной среде / Д. I'. Победимскни, М. II. Евгениев, А. Д. Кирилин, Э. М. Врублевский // Рос. хим. журнал. 2001. Т. XLV. — Ms 5-6. — С. 83-88.
2. Доклады ООН Ecology Conference, 22.04.1997 (DC/2581), 26.06.2000 (ECOSOC/5925), 26.04.2000 (ENV/DEV/543).
1 2 3
Рис. 4. Плазмида pRAD и ампликон gfp 1 дорожка — маркер, 2 дорожка — ампликон gfp,
3 дорожка — плазмида pRAD
3. Авакян Л.А'. Новые молекулярные критерии оценки токсического действия производных гидразина. Активные формы кислорода как ключевые агенты в механизме токсичности / А.Х. Авакян // Фармакол. и токенкол. -1990. Т. 53. - № I. С. 70-73.
4. Басараба И.II. Токсичность комбинации 1.2-ди-метилгидразина и диоксида серы при хроническом воздействии / Басараба П.П., Бенеманский В.В. // 1-и съезд токсикологов России: Тезисы докладов. — М., 1998. - С. 33.
5. Богданов НА. Патология, клиника и терапия поражений жидкими ракетными топливами / II.А. Богданов. - Л.: ВМОЛА. - 1970. - С. 36-38.
6. Лавриненко НА. Создание цельноклеточной био-сенсорной тест-системы для обнаружения генотоксических воздействии на клетку / П.А. Лавриненко, А.Ц, Рябченко. А.Б. Беклемишев // Бюлл. экснер. биол. медицины. — 2006. -Т. 141. — №1. — С.33-35.
7.Лавриненко НА. Создан не биосенсорной тест-системы для оценки повреждений ДМ К, II.А. Лавриненко // Материалы международной научной конференции: Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных. — 2005. С. 124-126.
8. Hughes StephenJ. The Adaptive Response to Alleviation Damage / StephenJ. Hughes, B. Sedgwick J. Biol. Chein. - 1998. - Vol. 264. - № 35. - P. 21369-21375.
9. Landini P. Expression of the Escherichia coli Ada Regulon in Stationary Phase: Evidence for rpoS-Depen-dent Negative Regulation of alkA Transcription / P. Landini, S. J. W. Busby //J. Bacteriol. - 1999. - Vol. 181.
№21.- P. 6836-6839.
10. Landini P. Regulator*' Responses of the Adaptive Re-sponse to Alkylation Damage: a Simple Regulon with Complex Regulatory Features / P. Landini. M.R. Volkert //J. Bacteriol. - 2000. - Vol. 182. - №23. P. 6543-6549.
11. Сойфер B.H. Репарация генетических повреждении / B.H. Сойфер // Соросовскнн Образовательный журнал. - 1997. — №8. - С. 4-13.
