CC BY
59
<becmHUKjBTyWïïï, №3, 2013L
УДК 577.21
Аспирант C.B. Кирьянова, доцент Д.А. Черенков, аспирант A.A. Толкачева, профессор О.С. Корнеева
(Воронеж. гос. ун-т инж. технол.) кафедра биохимии и биотехнологии, тел. (473) 255-38-51
Получение рекомбинантной a-L-фукозидазы (alfB)
В данной работе ген a-L-фукозидазы (AlfB), амплифицированный с помощью ПЦР, был клонирован в составе векторной плазмиды pet23b+ по сайтам EcoR1 - Xho1. Экспрессия гена происходила в клетках Escherichia coli top 10 под контролем Т7-промотора. Был получен штамм-продуцент рекомбинантного белка a-L-фукозидазы, в результате оптимизации условий действия фермента были определены оптимальные значения pH и температуры.
In this study the gene a-L-fucosidase (AlfB), amplified by PCR was cloned in the vector plasmid pet23b + sites for EcoR1 - Xho1. Gene expression occurred in the cells of Escherichia coli top 10 under the control of the T7 promoter. The strain-producer recombinant protein a-L-fucosidase was obtained, optimum values of pH and temperature was determined by optimizing the conditions of the enzyme action.
Ключевые слова: a-L-фукозидаза, клонирование, экспрессия, Escherichia coli.
a-L-фукозидазы (КФ 3.2.1.51) -ферменты, относящиеся к классу О-гликозидгидролаз, - расщепляют внутренние фукозидные связи в молекуле фукоидана - полисахаридах клеточных стенок бурых водорослей. Установлено, что образующиеся в результате ферментативного гидролиза фуко-олигосахариды и моносахарид фукоза обладают пребиотическим, иммуностимулирующим действием, а также влияют на репродуктивную функцию живого организма. Поэтому актуальным является создание на их основе лечебно-профилактических средств с иммуностимулирующими свойствами и препаратов, нормализующих и повышающих репродуктивную способность млекопитающих [1].
Сведения о выделенных и охарактеризованных на сегодняшний день a-L-фукозидазах немногочисленны, большинство из них обладают низкой активностью и являются 1,2-экзофукозидазами, вследствие чего не способны гидролизовать фукоидан водорослей, содержащий преимущественно 1,3-, 1,4- и 1,6-фукозидные связи [2,3,4].
Достижения в области технологии молекулярного клонирования и генной инженерии позволяют решить данную проблему путем создания микроорганизмов с заданными генетическими характеристиками, что дает возможность повысить активность и выход целевого
© Кирьянова C.B., Черенков Д.А., Толкачева A.A., Корнеева О.С., 2013
фермента в сравнении с его выходом у нативно-го продуцента [5]. Наиболее перспективным подходом к получению высокоактивного препарата является создание продуцентов a-L-фукозидазы - рекомбинантных штаммов кишечной палочки, несущих клонированный ген alfB. На сегод-няшний день в литературе имеются сведения о клонировании гена alfB в составе вектора pQE80, который экспрессировался в клетки E. coli. Также имеются сообщения о рекомбинантных a-L-фукозидазах из Streptomyces sp и Bifidobacterum bifidum [4,6,7].
Цель настоящего исследования заключалась в клонировании гена alfB с использованием вектора pet23b+, обеспечивающего экспрессию чужеродного гена под контролем Т7-промотора и получение рекомбинантного фермента a-L-фукозидазы. Донором ДНК для амплификации гена alfB служил штамм Lactobacillus rhamnosus 12L, который используется для приготовления биологически активных добавок, бактерийных препаратов, нормализующих микрофлору кишечника у детей первого года жизни. Штамм получен из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов, ГосНИИгенетика, Москва. Для отбора рекомбинантных плазмид использовали штамм Escherichia coli top 10. В качестве вектора для клонирования использовали плазмиду pet 23 b(+) (Novagen, США). Скрининг трансформированных клеток E.coli top 10, несущих
(RecmHu-KjBcpyWHt, №3, 2013
плазмиду pet 23 b(+) с клонированным фрагментом ДНК, проводили по устойчивости полученного штамма к ампициллину в концентрации 100 мкг/мл. Отобранные в результате скрининга колонии выращивали методом глубинного культивирования в орбитальном шейкере-инкубаторе на питательной среде LB, содержащей ампициллин, в течение 6 часов, затем производили индукцию синтеза белка путем добавления IPTG.
Выделение хромосомной и плазмидной ДНК проводили с помощью набора GeneJet Plasmid Midiprep Kit. Рестрикцию, дотирование, электрофорез в агарозном геле, ПЦР проводили по стандартным методикам [5].
Последовательность нуклеотидов гена alfB Lactobacillus rhamnosus 12L была получена из базы данных NCBI. Кодирующую часть гена a-L-фукозидазы L. rhamnosus амплифи-цировали при помощи ПЦР, используя прай-меры EcoRl: 5' -ctatgaattcatggttaaaccatcacctgtc
- 3', Xhol: 5' - tacactcgagttaacgatcactaagttgctgc
- 3' и хромосомную ДНК L. rhamnosus 12L в качестве матрицы. Полученный фрагмент клонировали в векторе pet 23 b (+) по сайтам рестрикции EcoRl и Xhol. Конструирование праймеров для амплификации клонируемого фрагмента ДНК осуществляли с помощью пакета программы Vector NTI.
ДНК плазмиды и амплификат гена alfB расщепляли эндонуклеазами рестрикции EcoRl и Xhol (Fermentas) в течение 24 ч в буфере Tango. Линейную форму плазмиды и амплификат после рестрикции очищали электрофорезом в 0,7 %-ном агарозном геле и ли-гировали с использованием ДНК-лигазы Т4 (Fermentas) согласно рекомендациям изготовителя. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli top l0, обработанные хлористым кальцием. Трансформанты высевали на агаризованную среду LB, содержащую l00 мкг/мл ампициллина. Посевы культивировали при 37 °С в течение l2 ч. Отбирали ампициллинрезистентные колонии и определяли присутствие гена alfB с помощью праймеров для детекции гена. Из позитивных клонов выделяли плазмидную ДНК и подтверждали наличие в ней вставки гена alfB рестрикцией EcoRl и Xhol с последующим электрофорезом в агарозном геле.
Активность a-L-фукозидазы определяли по изменению количества свободной фукозы в пробе по методу Дише [8], основанному на способности фукозы при кипячении с сильными минеральными кислотами образо-
вывать 5-метилфурфурол, в отличие от других гексоз, благодаря чему возможно ее дифференцированное определение.
Реакционную смесь, состоящую из 1 мл водного раствора фукоидана с массовой долей 1 % и 1 мл раствора фермента a-L-фукозидазы, инкубировали при температуре 30 °С в течение 1 ч. Через один час гидролиза реактивную смесь фильтровали и разбавляли водой в 20 раз. Затем 1 мл пробы помещали в водяную баню и ставили в морозильник до образования корочки льда. Приливали 4,5 мл H2SO4, разведенной дистиллированной водой (1 часть дистиллированной воды - 6 частей H2SO4 конц.), перемешивали и оставляли на 10 мин при комнатной температуре. Помещали пробу в кипящую водяную баню на 3 минуты, охлаждали проточной водой. Добавляли 0,1 мл 3 %-го раствора солянокислого цистеина, перемешивали и оставляли на 1,5 ч при комнатной температуре. Измеряли оптическую плотность растворов на спектрофотометре против контроля при длине волны 396 нм (все сахара) и 430 нм (все сахара, кроме метилпен-тоз). В качестве контроля использовали инакти-вированный фермент a-L-фукозидазы.
За единицу активности a-L-фукозидазы принимали такое количество фермента, которое образует 1 мМоль фукозы за 1 мин в стандартных условиях.
С целью оптимизации условий действия фермента было исследовано влияние pH среды и температуры на активность целевого фермента, продуцируемого генетически модифицированным штаммом E. coli top 10.
Оптимальные значения параметров действия фермента определяли следующим образом: проводили глубинное культивирование рекомбинантного штамма-продуцента a-L-фукозидазы в качалочных колбах емкостью 750 см3, содержащих по 250 см3 питательной среды заданного состава, варьируя значения необходимых параметров.
Для выращивания рекомбинантного штамма E. coli top 10 использовали среду Лурия-Бертани (среда LB) следующего состава, %: пептон - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, NaCl - 0,5, pH 7.0. Среду стерилизовали в течение 30 минут при 0,8 МПа, охлаждали до 30 °С и засевали бактериальной культурой. Различные значения pH среды устанавливали добавлением 1 н HCl или NaOH.
Таким образом, в ходе работ был получен штамм-продуцент рекомбинантного белка a-L-фукозидазы и определены оптимальные условия действия фермента. В результате скрининга бактериальных штаммов из коллекции
QecmHUKjBTyWm:, №3, 2013
микроорганизмов ВКПМ ГосНИИгенетика в качестве источника целевого гена a-l-фукозидазы был выбран штамм Lactobacillus rhamnosus 12L. Выделенный из данного штамма необходимый участок ДНК использовали в качестве матрицы для амплификации гена a-l-фукозидазы с помощью полимеразной цепной реакции, для чего на основе анализа имеющейся в базе данных NCBI нуклеотидной последовательности гена a-l-фукозидазы (AlfB, protein_id="ZP_03212876.1") сконструировали
праймеры Бр-1 ( ^аЩаайсаЩШааасса^ассШс, подчеркнут сайт для рестриктазы EcoR1) и Яр-1 ( 1асас1с£ав^1аас§а1сас1аа§^1§с1§с, подчеркнут сайт для рестриктазы Xho1).
Ожидаемый размер продукта амплификации для гена а-1-фукозидазы равен 45 кДа. В процессе амплификации с прайме-рами Бр-1 и Яр-1 был получен фрагмент ДНК, соответствующий данному размеру, что подтверждается результатами электрофоретиче-ского анализа (рисунок 1).
12 3 4
Рисунок 1 - 8В8-ПААГ - электрофореграмма продуктов амплификации. 1 - белки-стандарты молекулярной массы (сверху вниз - 120 кДа, 66 кДа, 40 кДа, 25 кДа)
2,3,4 - продукты амплификации
Для клонирования в качестве вектора был выбран экспрессионный вектор pet23b+, предназначенный для экспрессии рекомбинантных белков в E. coli и содержащий в своем составе ген резистентности к ампициллину. Ген a-l-фукозидазы перенесли в вектор экспрессии pet23b+ по сайтам рестриктаз EcoR1-Xho1. Полученной рекомбинантной плазмидой были трансформированы клетки E. coli top 10.
Отобранные генетически модифицированные клетки E. coli top 10, содержащие плаз-миду с геном a-l-фукозидазы, инкубировали с синтетическим аналогом лактозы - ИПТГ для индукции экспрессии гена AlfB. После индукции наблюдалось накопление в бактериальных клетках белка соответствующей молекулярной массы (45 кДа) (рисунок 2).
кДа 120 66
40 25
1 2 3
Рисунок 2 - SDS-ПААГ-электрофореграмма клеточных белков генетически модифицированных бактерий E. coli top 10 1 - белки-стандарты молекулярной массы (сверху вниз - 120 кДа, 66 кДа, 40 кДа, 25 кДа) 2 - клеточные белки белков генетически модифицированных бактерий E. coli top 10 без индукции IPTG 3 - клеточные белки белков генетически модифицированных бактерий E. coli top 10 через 5 часов после индукции
IPTG в концентрации 0,1^mol
Фестни^ФГУШТ, №3, 2013_
Далее была определенна область оптимальных значений рН и температур, при которых полученная рекомбинантная а-Ь-фукозидаза проявляет максимальную активность. Изменение активности а-фукозидазы в зависимости от концентрации ионов водоро-
А,%
5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 15 8,0 8,5 9,0 pH
а)
Рисунок 3
На рисунке 36 представлена зависимость активности а-фукозидазы от температуры, которая описывается колоколообразной кривой. Такой характер влияния температуры на актив -ность фермента связан с действием двух факто-ров: с одной стороны, с увеличением темпера -туры возрастала скорость ферментативной реакции, а с другой - происходила инактивация фермента, вследствие денатурации белка, что приводило к непрерывному уменьшению концентрации активного фермента.
Наиболее интенсивным действием а-фукозидазы обладала при температуре 40 °С, отклонение температуры на 10 °С от оптимального значения приводило к снижению активности на 60 и 40 % соответственно.
В результате проведенной работы нами сконструированы рекомбинантные плазмиды на основе вектора pet23b+, способные к эффективной экспрессии клонированного гена a-l-фукозидазы (AlfB) в E. coli под контролем Т7-промотора. Установлены оптимальные условия действия полученного рекомбинант-ного фермента. Данные исследования послужат основой для дальнейшей работы по получению стабильного промышленного генно-инженерного штамма E. coli top 10 - активного продуцента a-l-фукозидазы.
да представлено на рисунке 3а. Из графика следует, что для a-фукозидазы E. coli top 10 оптимум действия лежит в области значений pH 7,0. При pH 9,0 фермент почти полностью терял каталитическую активность.
А.%
о А-1-1-1-1-1-1-1-1—
20 25 30 35 W 45 50 55 60 t, "С
б)
Работа выполнена в рамках НИОКР по программе У.М.Н.И.К. (ГК № 12128р/20823 от 29.07.2013 г.) и ФЦП " Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы" (ГК № 14.512.11.0069 от 17.04.2013 г.).
ЛИТЕРАТУРА
1 Черенков, Д.А. Фукоза : биологическая роль, пути получения и перспективы применения [Текст] / Д.А. Черенков, Ю.А. Рыбаков, Т.В. Санина и др. // Биотехнология. - 2010. -№6. - С. 63-71.
2 Aminoff, D. Purification and general properties of 1,2 -L-ficosidase from Clostridium Perfringens [Text] / D. Aminoff, K. Furukawa // J. Biol. Chem. - 1970. - V. 245. - P. 1659-1669.
3 Kurimura, Y. Efficient production and purification of extracellular 1,2-alpha-L-fucosidase of Bacillus sp. K40T [Text] / Y. Kurimura // Biotech-nol Biochem. - 1995. - V. 59. - № 4. - P. 589-594.
4 Katayama, T. Molecular cloning and characterization of Bifidobacterium bifidum 1,2-a-l-fucosidase (AfcA), a novel inverting gly-cosidase (Glycoside Hydrolase Family 95) [Text] / Katayama T. // J Bacteriol. - 2004. - V. 186. -№ 15. - P. 4885-4893.
- Зависимость активности а-фукозидазы (% от максимальной) а) от величины рН при температуре 40 0С; б) от температуры при оптимальной величине рН.
<ЪестникФТУЖЛС, №3, 2013
5 Sambrook, J. Molecular cloning [Text]: laboratory manual / J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis. - New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. - 452 p.
6 Rodriguez-Diaz, J. Utilization of natural fucosylated oligosaccharides by three novel alpha-L-fucosidases from a probiotic Lactobacillus casei strain [Text] / J. Rodriguez-Diaz, V. Monedero, M.J. Yebra // Appl. Environ. Microbiol. - 2011. -V. 77. - P. 703-705.
7 Sano, M. Purification and characterization of alpha-L-fucosidase from Streptomyces species [Text] / M. Sano, K. Hayakawa, I. Kato // J. Biol Chem. - 1992. - V. 267. - № 3. - P. 1522-1527.
8 Полыгалина, Г.В. Определение активности ферментов [Текст]: справочник / Г.В. Полыгалина, B.C. Чередниченко, Л.В. Ри-марева. - М.: ДеЛи принт, 2003. - 375 с.
REFERENCES
1 Cherenkov, D.A. Fucose : biological role, ways of obtaining and application prospects [Text] / D.A. Cherenkov, Y.A. Rybakov, T.V. Sanina, et al // Biotechnology. - 2010. - № 6. - P. 63-71 .
2 Aminoff, D. Purification and general properties of 1,2 -L-ficosidase from Clostridium Perfringens [Text] / D. Aminoff, K. Furukawa // J. Biol. Chem. - 1970. - V. 245. - P. 1659-1669.
3 Kurimura, Y. Efficient production and purification of extracellular 1,2-alpha-L-fucosidase of Bacillus sp. K40T [Text] / Y. Kurimura // Biotech-nol Biochem. - 1995. - V. 59. - № 4. - P. 589-594.
4 Katayama, T. Molecular cloning and characterization of Bifidobacterium bifidum 1,2-a-l-fucosidase (AfcA), a novel inverting gly-cosidase (Glycoside Hydrolase Family 95) [Text] / Katayama T. // J Bacteriol. - 2004. - V. 186. -№ 15. - P. 4885-4893.
5 Sambrook, J. Molecular cloning [Text]: laboratory manual / J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis. - New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. - 452 p.
6 Rodriguez-Diaz, J. Utilization of natural fucosylated oligosaccharides by three novel alpha-L-fucosidases from a probiotic Lactobacillus casei strain [Text] / J. Rodriguez-Diaz, V. Monedero, M.J. Yebra // Appl. Environ. Microbiol. - 2011. -V. 77.- P. 703-705.
7 Sano, M. Purification and characterization of alpha-L-fucosidase from Streptomyces species [Text] / M. Sano, K. Hayakawa, I. Kato // J. Biol Chem. - 1992. - V. 267. - № 3. - P. 1522-1527.
8 Polygalina, G.V. Determination of enzyme activity [Text]: a guide / G.V. Polygalina, V.S. Cherednychenko, L.V. Rimareva. -M.: DeLee print, 2003. - 375 p.
