CC BY
296
УДК 573.6.086.83:577.21]:[615.373.3+615.277]
А. В. Карабельский, Ю. Г. Зиновьева, М. Н. Смирнов, М. В. Падкина
СОЗДАНИЕ ШТАММОВ ДРОЖЖЕЙ Р1СН1А РАБГОЫБ ПРОДУЦЕНТОВ ХИМЕРНЫХ БЕЛКОВ
«АЛЬБУМИН-ИНТЕРЛЕЙКИН-2» И «АЛЬБУМИН-ИНТЕРФЕРОН-а16»
Введение. Цитокины — биологически активные вещества пептидной природы, обеспечивающие согласованность действия иммунной, эндокринной и нервной систем в нормальных условиях и в ответ на патологические воздействия. По структурным особенностям и биологическому действию все цитокины можно разделить на несколько семейств: гемопоэтины, интерлейкины, интерфероны, хемокины и др. На основе некоторых из них созданы и успешно применяются генно-инженерные иммуномодулирующие препараты.
Интерлейкин-2 (ИЛ-2). Среди цитокинов одним из первых был обнаружен интерлейкин-2. ИЛ-2 человека продуцируется Т-лимфоцитами в ответ на антигенную и митогенную стимуляцию или под влиянием ИЛ-1. ИЛ-2 синтезируется в виде предшественника, состоящего из 153 аминокислот [37]. В процессе секреции происходит отщепление сигнального пептида, образование внутримолекулярной дисульфидной связи между 58-м и 105-м остатками цистеина, а также гликозилирование треонина, занимающего третью позицию. В зависимости от степени гликозилирования молекулярная масса ИЛ-2 варьирует от 15,5 до 17,0 кДа [34]. Биологическая активность ИЛ-2 определяется корректным замыканием дисульфидной связи, но не зависит от гликозилирования [8]. В то же время присоединение углеводных остатков повышает стабильность молекулы и увеличивает время ее циркуляции в кровотоке.
Основная функция ИЛ-2 состоит в обеспечении клеточной составляющей адаптивного иммунитета. ИЛ-2 является фактором роста и дифференцировки Т-лимфоцитов, NK-клеток, обеспечивает дифференцировку Т-киллеров и способствует проявлению функциональной активности Т-хелперов. Он также воздействует на моноциты, экспрессирующие рецептор ИЛ-2, и усиливает синтез иммуноглобулинов предварительно активированными В-лимфоцитами [6, 11, 18, 22]. Препараты рекомбинантного ИЛ-2 бактериального и дрожжевого происхождения широко применяются для лечения различных заболеваний, характеризующихся нарушениями в работе иммунной системы («Пролейкин®», «Си Эс Си Лтд.», Москва; «Ронколейкин®», «Биотех», Санкт-Петербург).
Интерферон-альфа (ИФНа). Интерфероны (ИФН) — группа белков, обладающих рядом общих свойств, главным из которых является способность обеспечивать противовирусную защиту организма. Система интерферонов возникла в филогенезе у позвоночных. Ее действие направлено прежде всего на распознавание и элиминацию чужеродной генетической информации. Синтез ИФН в клетках инициируют различные биологические и химические агенты, основными из которых являются вирусы, микроорганизмы, природные и синтетические полирибонуклеотиды, митогены, некоторые ингибиторы синтеза макромолекул и экзогенный ИФН [1]. ИФН позвоночных, в том числе и человека,
© А. В. Карабельский, Ю. Г. Зиновьева, М. Н. Смирнов, М. В. Падкина, 2009
разделяют на три класса: лейкоцитарные, или а-интерфероны (ИФНа), фибробластные, или Р-интерфероны (ИФНР), иммунные, или у-интерфероны (ИФНу) [30, 31]. ИФН разных классов различаются структурой молекул, некоторыми биологическими свойствами и типом клеток, в которых происходит их синтез. Интерфероны являются секреторными белками и синтезируются в виде предшественников, содержащих сигнальные последовательности. Благодаря относительному сходству функций и аминокислотных последовательностей ИФНа и ИФНР объединены в одно семейство интерферонов I типа, тогда как ИФНу выделяют в отдельное семейство интерферонов II типа [30, 31].
В настоящее время выделено и охарактеризовано 23 ИФНа человека, которые на 80 % идентичны между собой и обладают общими функциональными признаками [32]. Клинические испытания показали возможность использования ИФНа для лечения ряда вирусных заболеваний: гепатитов В, С, D, герпетической инфекции, кератитов, гриппа, атипичной пневмонии [9, 12, 15, 19, 28, 38]. Помимо этого, в настоящее время ИФНа совместно с другими препаратами активно используются в лечении различных онкологических заболеваний (рак простаты, почечноклеточный рак, рак молочной железы, лейкозы, злокачественные заболевания кожи) и аутоиммунных заболеваний человека [1, 10, 23, 29].
Несмотря на то, что все известные ИФНа человека характеризуются высокой степенью гомологии, нельзя исключить, что спектр их действия может несколько различаться. В пользу этого предположения говорят данные о том, что соотношение синтезируемых ИФНа зависит от типа клеток и может меняться при некоторых заболеваниях [20, 21]. Для выявления индивидуальных особенностей действия этих белков необходимо появление новых рекомбинантных ИФНа.
Широкое применение ИФНа в качестве лекарственного средства стало возможным только после создания штаммов Escherichia coli, Pseudomonasputida, Saccharomyces cerevi-siae, продуцирующих различные ИФНа человека. Наиболее распространенными являются продуценты рекомбинантного а2-интерферона, полученные на основе прокариотических микроорганизмов E. coli и P. putida.
В лаборатории биохимической генетики БиНИИ СПбГУ были созданы штаммы дрожжей S. cerevisiae — продуценты лейкоцитарного ИФН16 человека и ИЛ-2 человека [4, 5]. Интерес к ИФНа16 был обусловлен тем, что этот белок относится к подтипу ИФНа4, который совместно с ИФНа1 и ИФНа2 составляет основную фракцию интерферонов в индуцированных лейкоцитах [20].
Цитокины пролонгированного действия. Препараты рекомбинантных цитокинов бактериального происхождения получили широкое распространение в лечении многих заболеваний. Однако период полужизни цитокинов очень короткий, поэтому для достижения положительного результата в процессе лечения необходимы частые инъекции их препаратов. Кроме того, существующие схемы лечения требуют длительных, зачастую многократных курсов введения препарата. Таким образом, лечение рекомбинантным ИЛ-2 и ИФНа оказывается дорогостоящим и нередко сопровождается нежелательными побочными реакциями.
Эти недостатки могут быть полностью или частично устранены при использовании препаратов цитокинов в виде химических соединений с некими носителями или модификаторами, в качестве которых чаще всего используют полиэтиленгликоль (ПЭГ). Такая модификация белков увеличивает время их полужизни, снижает иммуногенность, придает устойчивость к протеолизу, а также улучшает переносимость препарата за счет связывания функциональных групп, не участвующих в формировании активного центра
белковой молекулы [36]. К основным недостаткам ПЭГ-коньюгированных пептидов можно отнести возможное уменьшение активности белка, связанное с неудачным выбором размера или структуры ПЭГ; с этой же причиной может быть связано и возможное удлинение элиминации пептида.
Альтернативным способом увеличения периода полужизни терапевтических белков является присоединение короткоживущих белковых молекул к молекуле сывороточного альбумина, период полужизни которого составляет около 19 дней [33]. Альбумин обладает рядом ценных свойств, главным из которых является его способность связывать и транспортировать эндо- и экзогенные лиганды (в том числе и белки). Таким образом, он играет роль естественного стабилизатора и переносчика белков плазмы крови.
Этот подход и был выбран нами для получения химерных белков «альбумин-интерлейкин-2» и «альбумин-интерферон-а16», обладающих большей продолжительностью циркуляции в кровяном русле с сохранением своей биологической активности по сравнению с нативными молекулами ИЛ-2 и ИФНа.
В качестве продуцента секреторных рекомбинантных белков были выбраны мети-лотрофные дрожжи Pichiapastoris. Дрожжи P pastoris способны расти до очень большой плотности клеточной суспензии, что в значительной мере определяет высокий уровень продукции гетерологичных белков. Кроме того, данный вид дрожжей характеризуется высоким уровнем экспрессии чужеродных генов за счет использования сильного инду-цибельного промотора структурного гена алкогольоксидазы 1 (AOX1) [14].
Цель настоящей работы — создание штаммов дрожжей Pichia pastoris, продуцентов гибридных белков человека «альбумин-интерлейкин-2» и «альбумин-интерферон-а16», а также подбор оптимальных условий индукции синтеза целевых рекомбинантных белков.
Материалы и методы исследования. Штаммы, плазмиды, среды. Для создания векторов экспрессии pPIC9HAbIL-2 и pPIC9AbFN в качестве исходного использовали вектор pPIC9 (“Invitrogen”, США). Выбор данной плазмиды для продукции химерных белков обусловлен следующими причинами. Промотор гена AOX1 относится к числу наиболее сильных промоторов. Уровень экспрессии генов, находящихся под контролем AOX1 промотора, эффективно регулируется источниками углерода. Использование метанола в качестве единственного источника углерода обеспечивает экспрессию гена AOX1 и, следовательно, всех генов, находящихся под контролем промотора этого гена. В состав плазмиды входит фрагмент ДНК, кодирующий структуру сигнального пептида а-фактора дрожжей S. cerevisiae, обеспечивающий секрецию рекомбинантного белка в культуральную среду, и ген HIS4 дрожжей, что позволяет селективно отбирать трансформанты при использовании в качестве реципиентов штаммов дрожжей с мутациями в этом гене.
Плазмиды pRSAbFN, pHIN и pJDB (MSIL) использовали при амплификации кодирующей части генов ALB, IFNA16 и IL-2 человека [2, 4, 5].
Для амплификации бактериальных ДНК был использован штамм E. coli DH5a F' / endAl hsdR17 (rK-m3+) supE44 thi-1 recAl gyrA (Nalr) relAl A(lacZYA-argF) U169 deoR (p80dlacA(lacZ) M15)) [3].
В качестве штамма-реципиента интегративных плазмид использовали штамм дрожжей P pastoris GS115 (“Invitrogen”, США). Штамм имеет мутацию в гене гистидинолде-гидрогеназы (HIS4) — фермента, участвующего в синтезе гистидина. Частота спонтанной реверсии штамма GS115 к HIS+ прототрофности составляет меньше, чем 10-8.
Для обозначения фенотипов штаммов дрожжей использовали следующие символы: HIS-, HIS+ — ауксотрофность и прототрофность по гистидину, Muts — замедленная скорость роста на среде с метанолом по сравнению со штаммом дикого типа — Mut+.
Для выращивания бактерий использовали среду LB. Для отбора трансформантов в среду LB добавляли ампициллин до конечной концентрации 100 мкг/мл. При работе на чашках Петри в среду LB добавляли агар до конечной концентрации 2 %. Бактерии выращивали при 37 оС.
Для выращивания дрожжей Ppastoris с последующей индукцией экспрессии белков использовали жидкую среду BMGY [13, 35]. Для индукции экспрессии генов, находящихся под контролем промотора гена AOX1, дрожжевые клетки переносили в среду ММ, которая, в отличие от среды BMGY, содержит в качестве источника углерода метанол, а не глицерин.
Выделение ДНК. Плазмидную ДНК из E. coli выделяли стандартным методом [7].
Трансформация. Трансформацию бактериального штамма проводили по методике, предложенной Дж. Сэмбруком и соавторами [3]. Дрожжи P. pastoris трансформировали с помощью методики PLATE, разработанной для трансформации дрожжей S. cerevisiae [16].
Конструирование. В процессе конструирования двух плазмид, содержащих гены ALB и IL-2, а также ALB и IFNA16, были использованы ферменты производства “Fermen-tas” (Литва): эндонуклеазы рестрикции Taq-полимераза, ДНК-лигаза фага Т4. Реакции проводили в буферах и при условиях, рекомендованных фирмой-изготовителем ферментов. Фрагменты ДНК выделяли из агарозных гелей с помощью набора реактивов “DNA Extraction Kit” (“Fermentas”, Литва).
Полимеразная цепная реакция. Присутствие экспрессионной кассеты в геноме дрожжей P pastoris подтверждали методом ПЦР на колониях [39]. В качестве праймеров использовали следующие олигонуклеотиды:
5'-CCGCTCGAGAAAAGAGATGCACACAAGAGT-3' — прямой к гену ALB,
5'-GGAATTCTTAAGTCAGTGTTGAGATG-3' — обратный к гену IL-2,
5'-GGAATTCCTCAATCCTTCCTTCTTAATCCT-3' — обратный к гену IFNA16.
Реакцию проводили в течение 30 циклов в MiniCycler (“MJResearch”, США) по следующей программе: плавление цепей ДНК при 95 °С в течение 30 с, отжиг праймеров при 55 °С в течение 1 мин, реакция синтеза при 72 °С в течение 2,5 мин. Реакционную смесь предварительно прогревали при 95 °С в течение 15 мин. После окончания ПЦР пробу инкубировали при 72 °С в течение 10 мин.
Анализ рекомбинантных белков. Спектр белков, секретируемых в культуральную среду клетками дрожжей штаммов P pastoris GS115/pPIC9HAbIL-2 и P. pastoris GS115/pPI-C9AbFN, анализировали методом электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН [25]. В качестве контроля использовали белки, секретируемые исходным штаммом GS115, выращенным в тех же условиях.
Химерные белки идентифицировали при помощи иммуноблотинга. Для этого белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану, которую инкубировали 2 ч при 37 °С в буфере ТВST (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 0,05 % твин-20, 1 % BSA). Далее мембрану с белками, секретируемыми штаммом GS115/pPIC9AbFN, инкубировали 2 ч при 37 °С с моноклональными антителами к ИФНа2 («Протеиновый контур», Санкт-Петербург), разведенными тем же буфером, после чего трижды промывали буфером TBST и инкубировали 1 ч при 37 °С с конъюгатом видоспецифических антител и пероксидазы хрена («Протеиновый контур», Санкт-Петербург). После отмывки фильтра буфером PBST (58 мМ Na2HPO4, 17 мМ NaH2PO4, 68 мМ NaCl, 0,1 % твин-20) проявляли белковые комплексы, используя раствор DAB (3, 3'-диаминобензидин тетрагидрохлорид) в 10 мМ трис-HCl, с добавлением нескольких капель перекиси водорода.
Мембрану с белками, секретируемыми штаммом GS115/pPIC9HAbIL_2, инкубировали 2 ч при 37 °С с поликлональными антителами к ИЛ-2 человека, мечеными биотином (“NatuTec”, Германия), разведенными буфером TBST, трижды промывали буфером TBST и добавляли конъюгат стрептавидин-щелочная фосфатаза («Силекс М», Москва). Активность щелочной фосфатазы тестировали при помощи 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфата и нитроголубого тетразолия в 10 мМ Трис-HCl, pH 8.0.
Определение биологической активностирекомбинантных белков. Биологическую активность рекомбинантного химерного белка «альбумин-ИФНа 16» человека определяли по подавлению цитопатической активности вируса везикулярного стоматита в первичной культуре L-41 кожно-мышечной ткани эмбрионов человека, чувствительной к ИФН а-типа [27]. В качестве стандарта использовали человеческий лейкоцитарный интерферон ОСО 42-28-90-87 («ГИСК», Москва).
Биологическую активность рекомбинантного химерного белка «альбумин-ИЛ-2» человека определяли по способности обеспечивать пролиферацию ИЛ-2-зависимых Т-лимфоцитов мыши линии CTLL-2 [17]. В качестве стандарта использовали BRMP reference reagent human IL-2 (“NCI”, США).
Результаты исследования и их обсуждение. Создание рекомбинантной плазмиды, обеспечивающей экспрессию химерного белка «альбумин-ИЛ-2» человека. Конструирование вектора экспрессии проводили по схеме, приведенной на рис. 1. Как видно из рисунка, последовательность, кодирующую ИЛ-2 человека, получали методом ПЦР с использованием плазмиды pJDB (MSIL) в качестве матрицы. Для реакции использовали
Xhol
Xho I Eco KI
і.
У
Рис. 1. Схема конструирования вектора экспрессии pPIC9HAbIL-2
следующие праймеры: 5'-CAAGCTGCCTTAGGCTTAGCACCTACTTCAAGT-3' — в качестве прямого и 5'-GGAATTCTTAAGTCAGTGTTGAGATG-3' — в качестве обратного праймера. Выбор был обусловлен необходимостью создания сайтов рестрикции для ферментов Bsu36I и EcoRI (выделены жирным шрифтом), используемых при конструировании рекомбинантной плазмиды.
Последовательность, кодирующую альбумин человека, получали, гидролизуя плазмиду pRSAbFN ферментами рестрикции XhoI и Bsu36I. На 3'-конце гена ALB в составе плазмиды pRSAbFN удален терминирующий кодон для обеспечения последующей непрерывной транскрипции фрагмента ДНК, содержащего последовательности двух генов. Полученные фрагменты ДНК выделяли из агарозного геля и лигировали с плазмидой pPIC9, предварительно обработанной рестриктазами XhoI и EcoRI.
Лигазной смесью трансформировали штамм бактерий E. coli DH5a. Из трансформантов выделяли плазмидную ДНК и анализировали ее. Для доказательства того, что в составе вектора pPIC9HAbIL-2 присутствует гибридный ген, проводили ПЦР с использованием прямого праймера к 5'-концу гена альбумина: 5'-CCGCTCGAGAAAAGAGATGCACACAAGAGT-3' — и обратного праймера к 3'-концу гена IL-2, указанного ранее. Продукты реакции подвергали электрофоретическому разделению в 0,7%-ном агарозном геле. Результаты разделения представлены на рис. 2. Присутствие на электрофореграмме фрагмента ДНК размером 2148 п. о. подтверждает наличие гибридного гена HAbIL-2 в полученной плазмиде pPIC9HAbIL-2.
Создание рекомбинантной плазмиды, обеспечивающей экспрессию химерного белка «альбумин-ИФН-а16»человека. Для создания вектора экспрессии pPIC9AbFN (рис. 3, в), обеспечивающего синтез химерного гетерологичного белка, состоящего из альбумина человека и ИНФ-а16, были использованы плазмиды pPIC9 и pRSAbFN (рис. 3, a, б). Плазмиду pRSAbFN обрабатывали эндонуклеазами рестрикции XhoI и EcoRI. Рестрикционную смесь разделяли в 0,8 %-ном агарозном геле. Полученный в результате реакции фрагмент ДНК размером 2300 п. о., соответствующий химерному гену AbFN16, выделяли из геля и лигировали с вектором pPIC9, гидролизованным этими же эндонуклеазами рестрикции. Лигазной смесью трансформировали штамм бактерий E. coli DH5a. Из полученных трансформантов выделяли плазмидную ДНК и анализировали ее при помощи рестрикционного анализа и ПТТР.
Для этого выделенную плазмид-ную ДНК гидролизовали эндонуклеазами рестрикции XhoI/EcoRI, Bgl II, Eco81I (Bsu36I)/EcoRI и анализировали с помощью электрофореза в 0,8 %-ном агарозном геле (рис. 4, а). При обработке плазмиды ферментами XhoI и EcoRI образуются фрагменты 8000 и 2300 п. о., соответствующие линейной форме плазмиды pPIC9 и химерному гену AbFN16.
1 2
т.п.н.
Рис. 2. Электрофореграмма разделения продуктов ПЦР с использованием в качестве матрицы рР1С9НАЫЬ-2
1 — амплифицированный фрагмент, соответствующий химерной конструкции-2; 2 — ДНК фага X, обработан-
При обработке плазмидной ДНК ферментом В§1 II образуются фрагменты ДНК размером 6000, 2400 и 1900 п. о. Результаты этого анализа согласуются со структурой ожидаемой плазмиды рР1С9АЬШ (рис. 3, в). В случае обработки плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции Есо811 (Вби361) и ЕсоЫ на электрофореграмме видны фрагменты ДНК размером ~8900 п. о., 850 п. о. и ~500 п. о. Фрагмент размером ~500 п. о. соответствует гену 1ГЫЛ16. Таким образом, результаты проведенного рестрикционного анализа подтверждают, что структура полученной плазмиды соответствует теоретически ожидаемой структуре рРГС9аьрм (рис. 3, в).
а б
Bgll (2)
AMP(R)
РМВ1 P(LAC)
ТЗР Ec<R I (4302)
AbFN BsiB6I (3778)
Bgffl (4)
AOX1
MF-alfal XhoI(1193)
Bgffl (1913) Bgffl (1949) .bFN Blnl (2492)
Bsu36I (2951) EcoRI (3471) Blnl (3497) TTAOX1 Bsu36I (4357)
Рис. 3. Карта плазмид pPIC9 (a), рRSAbFN (б), pPIC9AbFN (в)
в
Для доказательства того, что полученная плазмида pPIC9AbFN содержит в своем составе химерный ген AbFN16, проводили ПЦР анализ плазмидной ДНК с использованием специфических праймеров:
5'-CGGGATCCAAACGATGAAGTGGGTACC-3' — прямой к гену ALB. 5'-GGAATTCCTCAATCCTTCCTTCTTAATCCT-3' — обратный к IFNA16. Продукты реакции разделяли в 0,8%-ном агарозном геле. Результаты представлены на (рис. 4, б). Присутствие на электрофореграмме фрагмента ДНК размером 2300 п. о. подтверждает наличие химерного гена AbFN16 в искомой плазмиде.
Получение штаммов дрожжей P. pastoris — продуцентов химерных белков «альбумин-ИЛ-2» и «альбумин-ИФН-а16»человека. Плазмиды pPIC9hawl-2 и pPIC9AbFN
Рис. 4. Электрофореграмма разделения продуктов гидролиза плазмидной ДНК рР1С9аьбн (а) и разделения продуктов ПЦР с использованием в качестве матрицы рР1С9аьбн (б) а: 1 — ДНК фага X, обработанная РвЯ; 2 — плазмида рРЮ9АЬР^ обработанная эндонуклеазами рестрикции ХЬо1 и ЕсоЫ; 3 — плазмида рРЮ9АЬР^ обработанная эндонуклеазой рестрикции В§1 II; 4 — плазмида рР1С9АЬР^ обработанная эндонуклеазами рестрикции Есо8П (Вви36!) и EcoRI. б: 1 — ДНК фага X, обработанная РбЙ;
2 — продукты ПЦР плазмиды рРГС9АЬР№
использовали для трансформации штамма дрожжей Р р^вПБ GS115. Селекцию клонов трансформированных клеток с фенотипом ИШ+ ЫШ8 в обоих случаях осуществляли по способности расти на среде без гистидина и замедленному росту на среде с метанолом в качестве единственного источника углерода.
В результате ПЦР на колониях выросших трансформантов с использованием праймера, комплементарного 5' -концу гена альбумина и праймеров, комплементарных 3'-концам гена 1Ь-2 и гена 1ЕИЛ16, получены фрагменты ДНК размером 2148 и 2300 п. о., что свидетельствует о присутствии в геноме дрожжей химерных генов ИЛЫЬ-2 и ЛЪГЫ16 соответственно.
Подбор условий культивирования штаммов-продуцентов, индукции синтеза и секреции рекомбинантных белков. Полученные штаммы Р pastoris GS115/pPIC9HAЬIL-2 и Р ра8^П8 GS115/pPIC9AЬFN выращивали в среде BMGY с глицерином до достижения значения влажной клеточной массы порядка 60 г/л. Для этого клетки дрожжей вносили в 100 мл среды BMGY и выращивали при 30 оС с перемешиванием при 180 об./мин в течение 2 суток. Далее клетки осаждали центрифугированием, переносили в 500 мл BMGY, содержащей 2 % глицерина, и растили при тех же условиях в течение 4 суток. По истечении половины указанного срока в среду добавляли глицерин в концентрации 1 %.
Для индукции синтеза гибридных белков «альбумин-ИЛ-2» и «альбумин-ИФН-а16» использовали среду ММ, содержащую в качестве единственного источника углерода
метанол. За 3 ч до переноса к растущим клеткам дрожжей добавляли первую порцию метанола (1,5 мл/л). Далее клеточную массу переносили в среду ММ, содержащую метанол в концентрации 1 %. Клетки инкубировали в течение пяти суток, добавляя метанол до концентрации 0,5 % каждые 48 ч.
По окончании культивирования клетки осаждали центрифугированием и проводили анализ спектра секретированных белков при помощи электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН. В культуральной среде штамма GS115/pPIC9HAbIL-2 наблюдали появление дополнительного белка: с молекулярной массой около 82 кДа, а в культуральной среде штамма GS115/pPIC9AbFN — 86 кДа.
Анализ рекомбинантных белков. Для доказательства того, что полученные белки с молекулярной массой 82 и 86 кДа являются искомыми химерными белками, мы использовали гибридизацию с моноклональными антителами к ИЛ-2 и ИФНа соответственно. В качестве положительных контролей были использованы рекомбинантный ИЛ-2 — «Ронколейкин®» («Биотех», Санкт-Петербург) и человеческий лейкоцитарный интерферон ОСО 42-28-90-87 («ГИСК», Москва). В качестве отрицательного контроля в обоих случаях выступали белки, секретируемые исходным штаммом GS115. Результаты, приведенные на рис.5, показывают, что белок с молекулярной массой 82 кДа специфически взаимодействует с моноклональными АТ к ИЛ-2, а белок с молекулярной массой 86 кДа дает реакцию с моноклональными АТ к ИФНа. Таким образом, было доказано соответствие белков, синтезированных штаммами Р рав1ог\в GS115/pPIC9HAbIL-2 и Р. рав1ог\в GS115/pPIC9AbFN, гибридным белкам «альбумин-ИЛ-2» и «альбумин-ИФН-а16». По предварительным подсчетам, продуктивность полученных штаммов составила примерно 5 мг белка «альбумин-ИЛ-2» и около 7 мг белка «альбумин-ИФН-а16» на литр среды.
Биологическую активность секретируемых белков определяли по методике, указанной в разделе «Материалы и методы». Было установлено, что присоединение альбумина
«Альбумин- 1 ИЛ-2»
«Альбумин-ИФНа16»
ИФНа16
ИЛ-2
Рис. 5. Иммуноблот белков культуральной среды штаммов продуцентов химерных белков «альбумин-ИЛ-2» (а) и «альбумин-ИФНа16» (б)
а: 1 — белки, секретируемые штаммом GS115/pPIC9HAbIL-2; 2 — «Ронколейкин®» («Биотех», Санкт-Петербург); 3 — маркеры молекулярной массы. б: 1 — исходный штамм GS115; 2 — штамм-продуцент ИФНа16;
3 — GS115/pPIC9AbFN; 4 — маркеры молекулярной массы.
1
2
2
3
к молекуле целевого белка не приводит к существенному снижению биологической активности ИЛ-2 и ИФНа16.
Индукцию синтеза рекомбинантных белков проводили при различных температурах: 15 оС, 20 оС, 25 оС и 30 °С, с интенсивным перемешиванием при 180 об/мин. Соотношение жидкой и газовой среды в колбах поддерживали на уровне 1:3.
Результаты серии экспериментов показали, что максимальный уровень продукции химерного белка «альбумин-ИЛ-2» достигается при температуре +15 оС, а наибольшее количество белка «альбумин-ИФН-а16» секретируется в среду при температуре 20-22 °С. Проведение индукции синтеза при температуре 25 оС и выше сопровождалось появлением в культуральной жидкости дополнительных белков с меньшей молекулярной массой, взаимодействовавших со специфическими моноклональными антителами к ИЛ-2 и альбумину. Возможно, это продукты протеолиза химерного белка, так как в последовательности, кодирующей альбумин человека, имеется свободный сайт узнавания для аналога протеазы Yap3 дрожжей S. cerevisiae [24, 26].
Таким образом, нами были созданы плазмиды pPIC9HAbIL-2 и pPIC9AbFN, содержащие «химерные» гены ALB-IL-2 и ALB-IFNA16 под контролем промотора AOX1. Впервые получены штаммы дрожжей P. pastoris, синтезирующие и секретирующие в культуральную среду химерные белки «альбумин-ИЛ-2» и «альбумин-ИФН-а16». Установлено, что присоединение альбумина не влияет на биологическую активность ИЛ-2 и ИФНа16. Доказана необходимость проведения стадии индукции синтеза химерных белков при пониженной температуре для предотвращения их протеолитической деградации.
Литература
1. Ершов Ф. И. Система интерферона в норме и при патологии. М., 1996.
2. Карабельский А. В., Парфенова Л. В., Смирнов М. Н., Падкина М. В. Создание штамма дрожжей Pichia pastoris продуцента гибридного белка «Альбуферона16» // III Московский международный конгресс «Биотехнология — состояние и перспективы развития». М., 2005. С.74-75.
3. Маниатис Т., Фритч Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., 1984.
4. Мясников А. Н., Смирнов М. Н., Авот А. Я. Рекомбинантная плазмидная ДНК pJDB (MSIL), обеспечивающая синтез интерлейкина-2 человека в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae, способ ее получения и штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae — продуцент интерлейкина-2 человека // А. с. SU 17703359 А1.-МКИ С 12 N 15/26, 1/19. 1989.
5. Падкина М. В., Парфенова Л. В., Самбук Е. В. Штамм-дрожжей Pichia pastoris — продуцет лейкоцитарного интерферона-16 человека, рекомбинантная плазмидная ДНК pHIN и способ ее конструирования // Патент РФ RU 2203950 С1.-МКИ С 12 N 15/21, 15/23, 1/19. 2002.
6. Baker E., Gillis S., Ferm M. M., Smith K. A. The effect of T cell growth factor on the generation of cytolytic T cells // J. Immunol. 1978. Vol. 121. P. 2168-2173.
7. Birnboim H. C., Doly L. J. A rapid alkalin extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucleic Acids Res. 1970. Vol. 7. P. 1513.
8. Brandhuber B. J., Boone T., Kenney W. C., McKay D. B. Three-dimensional structure of interleukin-2 // Science. 1987. Vol. 238. P. 1707-1709.
9. Brassard D. L., Grace M. J., BordensR. W. Interferon-alpha as an immunotherapeutic protein // J. Leu-koc. Biol. 2002. Vol. 7. P. 565-581.
10. Bukowski R. M. Cytokine combinations: therapeutic use in patients with advanced renal cell carcinoma // Semin. Oncol. 2000. Vol. 27. P. 204-212.
11. Caligiuri M. A., Zmuidzinas A., Manley T. J., Levine H., Smith K. A., Ritz J. Functional consequences of interleukin 2 receptor expression on resting human lymphocytes. Identification of a novel natural killer cell subset with high affinity receptors // J. Exp. Med. 1990. Vol. 171 (5). P. 1509-1526.
12. Cinatl J., Morgenstern B., Bauer G., Chandra P., Rabenau H., Doerr H. W. Treatment of SARS with human interferons // Lancet. 2003. Vol. 362. P. 293-294.
13. Clare J. J., Romanos M. A., Rayment F B., Rowedder J. E., Smith M. A., Payne M. M., SreekrishnaK., Henwood C. A. Production of mouse epidermal growth factor in yeast: high level secretion using Pichia pastoris strains containing multiple gene copies. // Gene. 1991a. Vol. 105. P. 205-212.
14. CoudercR.., Baratti J. Oxidation of methanol by the yeast Pichia pastoris. Purification and properties of alcohol oxidase // Agric. Biol. Chem. 1980. Vol. 44. P. 2279-2289.
15. Estem D., Acar Y., Kotiloglu K., Pehlivanoglu E. High-dose interferon results in high HBsAg sero-clearance in children with chronic hepatitis B infection // Turk. J. Pediatr. 2003. Vol. 45. P. 123-128.
16. FujimuraH. Molecular cloning of Saccharomyces cerevisiae MLF4/SSH4 gene which confers the immunosuppressant leflunomide resistance // Biochem Biophys Res Commun. 1998. Vol. 246 (2). P. 378-381.
17. Gearing A. J., Thorpe R.. The international standard for human interleukin-2. Calibration by international collaborative study // J. Immunol. Methods. 1988. Vol. 114 (1-2). P. 3-9.
18. Gullberg M., Smith, K. A. Regulation of T cell autocrine growth. T4+ cells become refractory to interleukin-2 // J. Exp. Med. 1986. Vol. 163. P. 270-284.
19. Guo J. T., Bichko V V., Seeger C. Effect of alpha interferon on the hepatitis C virus replicon // J. Virol. 2001. Vol. 75. P. 8516-8523.
20. Hiscott J., Ryals J., Dierks P., Hofmann V., Weissmann C. The expression of human interferon alpha genes // Philos. Trans. R. Soc. (Biol. Sci). 1984. Vol. 307. P. 217-226.
21. Hussain M., Gill D. S., Liao M. J. Both variant forms of interferon-alpha4 gene (IFNA4a and IFNA4b) are present in the human population // J. Interferon Cytokine Res. 1997. Vol. 17. P. 559-566.
22. Kang C. J., Sheridan C., KoshlandM. E. A stage-specific enhancer of immunoglobulin J chain gene is induced by interleukin-2 in a presecretor B cell stage // Immunity. 1998. Vol. 8. P. 285-295.
23. Kramer G., Steiner G. E., Sokol P., Handisurya A., Klingler H. C., Maier U., Foldy M., Marberger M. Local intratumoral tumor necrosis factor-alpha and systemic IFN-alpha 2b in patients with locally advanced prostate cancer // J. Interferon Cytokine Res. 2001. Vol. 21. P. 475-484.
24. Krysan D. J., Ting E. L., Abeijon C., Kroos L., Fuller R. S. Yapsins are a family of aspartyl proteases required for cell wall integrity in Saccharomyces cerevisiae // Eucaryotic Cell. 2005. Vol. 4 (8). P. 1364-1374.
25. Laemmli V. K. Change of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 224. P. 680-685.
26. LedgerwoodE. C., George P. M., Peach R. J., Brennan S. O. Endoproteolytic processing of recombinant proalbumin variants by the yeast Kex2 protease // Biochem. J. 1995. Vol. 308. P. 321-325.
27. Liu P. T., Ta T. V., Villarete L. H. High-yield expression and purification of human interferon a-1 in Pichia pastoris // Protein Expr. Purif. 2001. Vol. 22. P. 381-387.
28. Melian E. B., Plosker G. L. Interferon alfacon-1: a review of its pharmacology and therapeutic efficacy in the treatment of chronic hepatitis C // Drugs. 2001. Vol. 61. P. 1661-1691.
29. Mickisch G. H., Garin A., van Poppel H., de Prijck L., Sylvester R.. Radical nephrectomy plus interferon-alfa-based immunotherapy compared with interferoh alfa alone in metastatic renal-cell carcinoma: a randomised trial // Lancet. 2001. Vol. 358. P. 966-970.
30. Pestka S., Baron S. Definition and classification of the interferons // Meth. Enzymol. 1981. Vol. 78. P. 3-14.
31. Pestka S., Langer J. A., Zoon K. C., Samuel S. E. Interferons and their actions // Ann. Rev. Bochem. 1987. Vol. 56. P. 727-777.
32. Pestka S. The human interferon alpha species and receptors // Biopolymers. 2000. Vol. 55. P. 254-287.
33. Peters T. P. All about albumin. New York, 1996.
34. Robb R. J., Smith K. A. Heterogeneity of human T-cell growth factor (s) due to variable glycosylation // Mol. Immunol. 1981. Vol. 18. P. 1087-1094.
35. SreekrishnaK., PotenzR. H., Cruze J. A., McCombie W. R., Parker K. A., Nelles L., Mazzaferro P. K., Holden K. A., Harrison R. G., Wood P. J. High level expression of heterologous proteins in methylotrophic yeast Pichia pastoris // J. Basic Microbiol. 1988. Vol. 28. P. 265-278.
36. Talpaz M, O’Brien S., Rose E., Gupta S., Shan J., Cortes J., Giles F. J., Faderl S., Kantarjian H. M. Phase 1 study of polyethylene glycol formulation of interferon a-2B (Schering 54031) in Philadelphia chromosome-positive myelogenous leukemia // Blood. 2001. Vol. 98 (6). P. 1708-1713.
37. Taniguchi T., Matsui H., Fujita T., Takaoka C., Kashima N., Yoshimoto R., Hamuro J. Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2 // Nature. 1983. Vol. 302. P. 305-310.
38. TilgH. New insights into the mechanisms of interferon alfa: an immunoregulatory and anti-inflammatory cytokine // Gastroenterology. 1997. Vol. 12. P. 1017-1021.
39. WeisR,, LuitenR., Skranc W., SchwabH., Wubbolts M., Glieder A. Reliable high-throughput screening with Pichia pastoris by limiting yeast cell death phenomena // FEMS Yeast Res. 2004. Vol. 5. P. 179-189.
